水稻葉舌紫色性狀基因的定位分析

黎鍵湧，劉 鵬，歐克緯，閻衛清，凌 瑩，黃 威，金 剛，梁云濤，王麗萍，蔡中全*

(1.廣西農業工程職業技術學院，廣西 崇左 530028； 2.廣西大學，廣西 南寧530004； 3.廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001； 4.廣西壯族自治區農業科學院 水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點實驗室，廣西 南寧530006)

0 引言

【研究意義】水稻是重要的糧食作物，也是生物研究的模式植物，水稻器官的紫色是花色素苷積累顯色的結果，是重要的標記性狀，水稻紫色部位的花色苷等生物活性物質含量高于其他部位[1-3]。由于葉舌紫色性狀是一種不受環境及其他生物指標影響的表現型性狀，可作為標記性狀應用于輔助育種、品種鑒定、制種除雜和植物新品種權保護等方面。因此，探索水稻紫色性狀的遺傳模式、控制基因等，可為相關種質資源以及基因的利用提供參考?！厩叭搜芯窟M展】花色苷是花色素類物質與糖類物質結合而成，二者以糖苷鍵結合，而以花青素類物質結合的花色苷，是水稻葉片等部位呈現紫紅色的主要物質。NAGAO等[4]對水稻花色苷遺傳研究進行總結，提出色素原基因C、酶激活及調節基因A與部位特異性基因P共同作用的遺傳模式。目前關于水稻花青素CAP遺傳系統的研究中，對于相關控制基因的位置已有多個成果。HU等[5]利用玉米花色苷調節基因的cDNA為探針，在水稻cDNA文庫中篩選出與玉米花色苷調節基因同源的水稻花色苷調節控制基因Pb(Prp-b)以及Pa(Prp-a)，并將2個基因分別定位在第1與第4染色體上；CAUSSE等[6]通過研究水稻種皮顏色遺傳，再次成功將Pb與Pa基因成功定位于第1與第4染色體上，并確定2個基因的互補遺傳模式?！狙芯壳腥朦c】水稻葉舌顏色是常用的重要標記性狀，但其顏色決定機制尚未明確。鮮見前人對水稻紫色葉舌性狀決定基因的研究，開展其遺傳分析和相關基因的定位研究，對揭示葉舌顏色決定機制具有重要意義?！緮M解決的關鍵問題】以葉舌表現為綠色的日本晴與葉舌表現為紫色的WPB-1作為親本，通過系列雜交、自交與回交構建BC1F4代群體，包含18個遺傳群體共計1 500株單株，通過表型統計與遺傳分析進行遺傳模型的預測，并根據葉舌表型進行分區采樣，采用GSR40K基因芯片技術，利用SNP標記進行基因檢測，篩選出存在差異的分子標記位點以尋找目標基因可能存在的區段。通過表型的統計以及對遺傳模型的預測，對水稻紫色葉舌性狀基因進行初步的定位分析，為水稻紫色葉舌性狀的利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選用日本晴和WPB-1為親本進行雜交，通過系列雜交構建BC1F4群體。WPB-1為熱帶粳亞種水稻，該品種植株內富含花色素，葉片邊緣、葉耳、葉舌、莖基部以及穎殼等部位呈紫黑色或紫紅色。

1.2 方法

1.2.1 遺傳群體構建 2017年4月，在廣西大學農學院水稻育種試驗田種植親本日本晴和WPB-1(紫色葉舌)，6月對親本進行雜交，同年晚稻種植F1代。2018年早稻種植F2代，選取紫色葉舌單株與日本晴進行回交，同年晚稻種植回交種子獲得BC1F1。2019年早稻種植BC1F2代群體，晚稻種植BC1F3。2020年早稻種植BC1F4株系34個，每個株系種植50～150株。BC1F4遺傳群體構建詳見圖1。

圖1 BC1F4遺傳群體的構建過程

1.2.2 性狀觀察及遺傳模型推測 觀察成株數大于50株且存在葉舌顏色分離的株系群體，統計各單株葉舌顏色。計算表型分離比例，根據分離比例進行遺傳模型預測。

1.2.3 GSR40K水稻高密度全基因組SNP芯片測序與分析 成熟的水稻種子單株編號收種。選取不同葉舌顏色的單株各30～40株，取其種子進行發芽，待葉片長度達3 cm左右進行取樣，分類取樣構建混池。每混池包含30～40株水稻單株，樣品采用水稻GSR40K高密度SNP芯片(武漢雙綠源創芯科技研究院有限公司)進行檢測分型。檢測獲得芯片數據后，利用Genome Studio分析2個表型混樣池間的堿基差異，然后根據其在染色體位置繪圖展示，差異區段為目標基因可能所在區間。

1.3 數據統計與分析

芯片檢測的數據在染色體框架圖中展示，根據日本晴第6版基因組序列信息構建水稻12條染色體的框架(條狀圖)，使用genome studio分析軟件對檢測原始數據進行展示，橫坐標為染色體號數，縱坐標為染色體長度(單位為Mb)。雜合位點的展示，根據檢測結果將雜合堿基位點標識在染色體框架圖上，繪圖展示雜合區域的位置和大小等情況。樣品間差異位點展示，分析2個樣品間的SNP標記差異，然后根據其在染色體位置，繪圖直觀展示差異位點位置和區間大小，差異區段為目標基因所在區間。純合的差異堿基，標記為AA或BB，雜合的標記為AB。利用The Rice Annotation Project Datebase網站(https://rapdb.dna. affrc.go.jp/viewer/gbrowse/irgsp1/)公布的日本晴基因組序列及基因信息，分析目標區段內與花色苷合成相關的基因，進行目標基因預測分析。

2 結果與分析

2.1 BC1F4代葉舌表型

觀察BC1F4代遺傳株系群體發現，葉舌顏色和穎尖色有3種分離情況，分別為葉舌紫色且穎尖片狀紫色的植株，樣品編號A-1；葉舌顏色為綠色但穎殼尖端點狀紫色的植株，樣品編號A-2；葉舌綠色且穎尖也綠色的植株，樣品編號A-3。

統計發現，不同株系表型分離情況不同，有不分離的株系，有分離紫色葉舌︰綠色葉舌近似3︰1的株系，還有近似9︰7的株系。紫色葉舌︰綠色葉舌=3︰1或者紫色葉舌︰綠色葉舌=9︰7的均通過卡方檢驗，均達顯著水平(表1)。部分株系群體葉舌顏色分離呈9︰7，表明有2個基因分離，即水稻葉舌的顏色分離至少由2個基因控制，且表現為互補效應。

表1 BC1F4代群體葉舌性狀的分離情況

2.2 GSR40K基因芯片檢測結果

2.2.1 等位位點純合度 從各個樣品的各條染色體的純合(染色體條形圖空白區)和雜合(染色體條形圖陰影區)情況(圖2)看，整體上，各條染色體純合程度中等，反映混樣群體的純合進程，與遺傳群體處于中高遺傳世代的情況吻合；染色體間存在明顯的差異，如第7染色體絕大部分已經純合，而第4染色體純合程度較低，大部分區域仍處于雜合狀態。

注：1,2,3…12為染色體號；A-1為紫色葉舌，紫色稃尖；A-2為綠色葉舌，紫色稃尖； A-3為綠色葉舌，綠色稃尖，下同。條形圖中的陰影部分表示雜合堿基位點，空白表示純合位點。

2.2.2 芯片檢測的差異SNP位點 通過對A-1與A-2、A-1與A-3、A-2與A-3的SNP標記兩兩比較，得出樣品間具有多態性SNP的情況(圖3)。A-1與A-2在第4染色體上有1段差異區間，在A-1中為雜合，在A-2中為純合，為概率較高的候選區間；A-1與A-3在第2、3、6、8、10染色體上存在差異位點；A-2與A-3在第2、3、4、6、8、11、12染色體上存在差異位點。A-1與A-2和A-3存在的差異區間為目標區間。

圖3 樣本間的SNP差異位點

2.2.3 葉舌紫色性狀的基因初步定位 依據A-1與A-2和A-3存在的SNP差異，再結合3個樣品的表型(A-1雙顯性基因，A-2和A-3為單顯性或者無顯性基因)，篩選出27個候選SNP標記，3個標記位于第2染色體，6個位于第3染色體，2個標記位于第8染色體，16個標記位于第4染色體；分別對應4個區間，為目標基因所在的候選區間，其中第4和第3染色體的差異區間差異標記數量較多，是候選區間的可能性更大(表2)。

表2 紫色葉舌性狀分子標記信息

2.2.4 區間內候選基因 分析候選區間發現，花青素積淀調控基因Os04g0557500位于第4染色體第27 915 598～27 939 357 bp區間[7](表3)，在本研究所定位的候選區間內(第4染色體25 000 001～29 000 000 bp)。說明本研究的目標基因之一可能是已被發現的Os04g0557500基因。另1個目標基因，推測位于第3染色體19 140 450～20 443 511 bp、第2染色體7 000 001～8 000 000 bp，或者第8染色體17 000 001～18 000 000 bp區間。

表3 花色苷生物合成控制基因

3 討論

花色素類物質與糖類物質結合而成的花色苷是水稻葉片等部位呈現紫紅色的主要物質?；ㄉ諏τ谘蹼x子、氫氧根離子、過氧化氫、自由基等強氧化物質的有效還原劑或螯合劑,能降低植物以及動物體內的過氧化作用。意大利的CIGNARELLA[2]、日本的DEGUCHI等[3]科學家先后利用大麥、藍莓等植物提取花色苷，研究花色苷對大鼠糖尿病等疾病的影響，發現花色苷有降血糖、抗腫瘤等動物保健性作用。由于花色苷的保健價值，其生物合成在植物中已被廣泛研究[8-10]。該研究群體材料的表型統計與遺傳分析表明，在發生性狀分離的區號內，出現紫色葉舌︰綠色葉舌=9︰7的性狀分離比，卡方檢驗達顯著水平，說明在研究群體中葉舌的顏色性狀是由2個基因控制，并且當2個基因均為顯性時葉舌表現為紫色，否則表現為綠色。這2個基因的互作表現為互補作用。

BSA作為一種快速高效的基因定位方法，在遺傳分析與基因定位等領域應用廣泛。借助BSA法，TAKESHIMA等[11]篩選出了與蕎麥發芽抗性相關的基因，張久坤等[12]在大豆基因組內定位到10個與株高相關聯的染色體區間；SEO等[13]定位到洋蔥塊莖顏色性狀的控制基因；GAO等[14]定位到1個調控水稻紫色葉片性狀的隱形基因Plr4。本研究所使用的BSA定位工具GSR40K基因芯片，其采用SNP標記，針對水稻篩選出32 887個高質量位點，在水稻目標性狀關聯基因的尋找與分析上有廣泛應用[15]。利用GSR40K基因芯片進行基因檢測，篩選出研究群體內與葉舌顏色性狀相關的存在差異的27個分子標記位點，分別位于第2、3、4和8染色體上。

前人對水稻花青素遺傳模型已作出CAP基因系統的預測，在日本晴的基因組中共篩選出Os01g0633500、Os04g0557500與Os06g0205100等3個控制基因[7]。經過對比發現，研究群體中位于第4染色體目標區段上的目標基因可能是Os04g0557500，該基因控制花色苷的積淀；該基因編碼bHLH轉錄因子，其啟動子會由于反轉座子的插入而重排，最終導致異位表達[16]。另1個決定紫色葉舌的目標基因可能位于第3染色體19 140 450～20 443 511 bp、第2染色體7 000 001～8 000 000 bp，或者第8染色體17 000 001～18 000 000 bp，而非目前已定位的Os01g0633500或Os06g0205100基因。由于未能在第2、3和8染色體上的目標區段檢索到已定位或克隆的花色素合成相關的基因，故該基因可能是一個尚未被發現的新基因，需要進行后續更精細的基因定位與功能驗證加以證實。

4 結論

水稻葉舌顏色性狀至少受2個基因控制，當2個基因均為顯性時葉舌表現為紫色，2個控制基因為顯性互補效應。2個控制基因中位于第4染色體目標區段上的1個基因有可能是Os04g0557500，該基因控制花色苷的積淀；另1個基因初步定位于第2、3或8染色體上，可能是一個未被探知的與花色苷代謝相關的新基因，需要進行后續更精細的定位與功能研究。