微生物利用無機氮生產有機氮

劉立明，許雪晨，郭 亮

（江南大學食品科學與技術國家重點實驗室 江蘇無錫 214122）

在追求美好生活的新時代，人們對于食品的需求已經從“保障供給”向“營養健康”轉變[1]。今年“兩會”期間，習總書記指出：“發展生物科技、生物產業，向動物、植物、微生物要熱量、要蛋白”。蛋白質作為生命活動的主要承擔者，是人體健康與生長發育最重要的營養素[2]。長期以來，人們主要通過畜牧業獲取肉、蛋、奶等產品作為蛋白質的主要來源[3]。然而，畜牧業占用了全球約1/3 的土地和約1/4 的淡水，并釋放了約15%的溫室氣體，難以滿足人們日益增長的蛋白質需求[4]。隨著合成生物學、代謝工程等新興生物技術的發展，對微生物細胞進行理性設計與改造，構建微生物細胞工廠，利用可再生資源生產氨基酸，實現了向微生物要氨基酸[5-7]，合成單細胞蛋白實現了向微生物要蛋白[8-9]。

氮代謝不僅是微生物細胞的基本代謝過程，也是氨基酸和蛋白質生物合成的關鍵瓶頸[10-11]。在微生物細胞中，NH4+在谷氨酸脫氫酶與谷氨酰胺合成酶等相關酶的作用下合成谷氨酸和谷氨酰胺，經轉氨作用合成其它氨基酸，摻入蛋白質合成[12-13]。本文重點關注銨的生物合成途徑，即向自然界要銨；介紹利用銨合成蛋白質減量替代的氨基酸，即向微生物要氨基酸；利用氨基酸合成蛋白質，即向微生物要蛋白，并展望未來利用微生物細胞工廠生產氨基酸與蛋白質的發展方向。

1 微生物利用氮源生產銨鹽

氮元素是生物合成蛋白質、核酸的關鍵元素[10]。氮在自然界中以氣態氮（N2、NO、N2O）、硝態氮（NO3-、NO2-）、聯氨（N2H4）、羥胺（NH2OH）等形式存在，微生物通過生物固氮、硝酸鹽同化等氮代謝途徑，將自然界中不同形式的氮轉變為NH4+，從而摻入蛋白質、核酸等有機氮的合成中（圖1）。

圖1 自然界中的氮循環Fig.1 Schematic diagram of the nitrogen cycle in nature

1.1 微生物利用氮氣生成銨鹽

固氮生物將空氣中氮氣還原為氨的過程，稱為生物固氮，每年固定的氮素量約占全球作物所需氮量的75%[14]。生物固氮依賴于固氮酶，在生物固氮過程中，鐵蛋白將電子傳遞給鉬鐵蛋白，鉬鐵蛋白再將電子傳遞給N2和質子，生成NH3和H2[15-16]。提高微生物固氮效率的關鍵在于：在固氮微生物中提高固氮酶活性[17]，在非固氮微生物中引入固氮酶[18]。

通過對比分析5 種來源的固氮酶基因，發現棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）鉬依賴型固氮酶是由14 個基因組成，位于基因組上2 個未連接區 域：包 含nifHDKTY、nifENX、nifSUVP、nifWZ、nifM 和nifF 的29 kb 的區域以及包含nifBQ 和nifAL 的6 kb 的區域[15]，其中nifH 是檢測環境中固氮微生物的標記基因，nifDK 編碼活性中心含鉬的催化部分[19]，nifH、nifEN、nifQ、nifV 和nifB 負責鐵鉬輔因子（FeMoco）的生物合成，nifF 編碼黃素氧還原蛋白，nifUS 參與Fe-S 簇的形成，nifAL 則是調控基因轉錄水平的調控基因[20]。在解析固氮酶基因功能的基礎上，發展了一系列提高固氮酶活性的方法，如改造轉錄因子nifL 和nifA。棕色固氮菌固氮基因簇在轉錄水平上受雙組份調控因子nifLA 調控，敲除nifL 或者強化nifA 的表達，能有效增加胞內nifH 的mRNA 水平，增強固氮酶活性，使培養液中銨濃度增加到35 mmol/L[20]。另一個例子是在褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）中，利用組成型啟動子控制正調控因子NifA表達，并通過部分敲除失活負調控因子NifL，提高固氮酶活性，將工程菌株應用于小麥的生產，使小麥產量增加60%[17]。

如何借助合成生物學的方法，將固氮途徑引入非固氮微生物，提高非固氮微生物的固氮能力成為研究熱點。1972年，科研人員首次將肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）的固氮基因組簇nif 克隆到大腸桿菌（Escherichia coli），獲得具有生物固氮能力的大腸桿菌[21]。由于存在固氮酶活性低、能量供應不足等問題，因此MIT 的Christopher A Voigt 團隊將產酸克雷伯氏桿菌（Klebsiella oxytoca）固氮酶系統的16 個基因分為103 個部分，通過改變啟動子占有率、基因順序和基因方向等方法，在大腸桿菌中從頭設計了122個突變體，并根據設計-構建-檢測-學習循環優化了固氮酶系統，最終使其固氮效率達到對照產酸克雷伯氏桿菌的57%[7]。微生物固氮酶系統每固定一個氮氣分子需要消耗16 個ATP 和8 個高能電子[22]，造成微生物細胞內能量供應嚴重不足。為此，將來源于類芽孢桿菌WLY78（Paenibacillus sp.WLY78）的固氮酶導入大腸桿菌，其固氮酶活性僅為原菌株的10%。在大腸桿菌中將來源于類芽孢桿菌WLY78 的電子傳遞鏈蛋白（pfoABfldA）和產酸克雷伯氏桿菌來源的鐵-硫原子簇蛋白（nifSU）進行重組，使固氮酶的活性提高了5 倍[23]。為了進一步強化固氮酶系統的能量供給，將固氮酶系統分為電子傳遞鏈模塊、金屬原子簇模塊及固氮酶核心模塊3 個模塊。針對電子傳遞鏈模塊，將固氮酶系統中負責電子傳遞的模塊替換植物葉綠體的電子傳遞鏈模塊，同時將固氮酶系統電子傳遞鏈與線粒體來源的電子傳遞鏈組成功能性雜合的電子傳遞鏈模塊，均有效提高了能量供應[18]。

1.2 微生物利用硝態氮生成銨鹽

微生物利用硝酸鹽的途徑主要包括硝酸鹽同化途徑和硝酸鹽異化還原途徑，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。硝酸鹽同化途徑主要存在于藻類、藍細菌和植物中，其過程是硝酸鹽在ATP 依賴的硝酸鹽轉運蛋白的作用下轉運到細胞質中，再由細胞質中的硝酸鹽還原酶（NAS）還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽通過電子傳遞鏈進一步被還原為銨[24-25]。然而，在富銨環境下，NAS 的表達會受到顯著抑制。若NAS 在其它細胞器中，則不存在NAS 表達受到抑制這個問題，如：在結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）中發現了膜錨定硝酸鹽還原酶系統（NAR），可以在周質空間中進行硝酸鹽的高效同化[26]。硝酸鹽異化還原途徑主要存在兼性厭氧菌中，硝酸鹽作為呼吸鏈的最終氫受體，被還原為亞硝酸鹽，從而用于呼吸作用。膜錨定硝酸鹽還原酶系統（NAR） 和周質空間硝酸鹽還原酶系統（NAP）都可以催化硝酸鹽異化還原反應[24]。有研究發現，脫氮副球菌（Paracoccus denitrifican）同時具有NAR 和NAP 兩種酶系統[24]。NAR 系統在細胞質中還原硝酸鹽，并將質子釋放進細胞周質中，產生的質子驅動力直接促進能量的生成；NAP 系統還原硝酸鹽為亞硝酸鹽的過程發生在細胞質周質中，不會發生質子轉移。硝酸鹽異化還原途徑可與甲烷、硫化物和氫氣等電子供體的氧化耦合生成亞硝酸鹽。

微生物細胞能將亞硝酸鹽還原為銨和一氧化氮。由于還原為銨對微生物生長具有促進作用，因此它是微生物利用亞硝酸鹽的主要途徑。亞硝酸鹽異化還原為銨是硝酸鹽異化還原為銨（DNRA）途徑（NO3-→NO2-→NH4+）的關鍵反應，當環境中的鐵、氫氣、硫化物等和硝酸鹽相關的電子供體大量存在時，微生物可以利用DNRA 作用耦合電子供體的氧化來生長[27-28]。這一過程由位于周質空間中細胞色素c 亞硝酸鹽還原酶（ccNIR）、八面體血紅素亞硝酸鹽還原酶（ONR）[29]和八面體血紅素連四硫酸鹽還原酶（OTR）[30]3 個酶所催化。此外，在胎兒彎曲菌（Campylobacter fetus）中，發現只含羥胺氧化酶（HAO）而不含亞硝酸鹽還原酶，也可以將亞硝酸鹽還原為銨，推測這一反應是由HAO 催化[31]。

1.3 微生物利用其它形式氮生產銨鹽

一氧化氮、一氧化二氮、羥胺和聯氨等形式的氮是氮循環的重要組成部分，微生物可以通過多種氮代謝途徑將這些形式的氮轉變為氮氣，再利用生物固氮過程將這些形式的氮轉變銨：1） 一氧化氮被一氧化氮還原酶還原為一氧化二氮和氮氣，一氧化氮還原酶以多種形式存在于多種微生物中，如在脫硫弧菌（Desulfovibrio gigas）中是黃銅二鐵-一氧化氮還原酶[32]，在大腸桿菌中是雜合蛋白HCP[33]，在尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）中是NADH 依賴型黃素蛋白P450[34]。2）羥胺氧化還原酶（HAO）將羥胺轉化為一氧化氮，再借助一氧化氮轉化途徑和固氮途徑生成銨鹽。在消化螺菌（Nitrospira spp）及其它氨氧化細菌中，發現10余種羥胺還原酶類似蛋白[35]，其中一種羥胺氧化酶[36]（HOX）可催化羥胺氧化為一氧化氮。然而，最近研究表明，HAO 并非將羥胺直接催化為一氧化氮，而是將其催化為亞硝酸鹽，而后在未知酶的作用下生成一氧化氮[37]。3）聯氨脫氫酶（HDH）將聯氨氧化成氮氣[38-39]，氮氣在微生物固氮途徑的作用下生成銨鹽。進一步分析HDH 的氨基酸序列發現，其與羥胺氧化還原酶（HAO） 和羥胺氧化酶（HOX）具有相似的序列[39]。

2 微生物生產飼用氨基酸

隨著人民生活水平不斷提高，動物產品的人均消費量逐年增加，2021年我國人均肉類、禽蛋、奶類消費量分別為70，24，42 kg，導致2021年我國養殖業消耗4.5 億t 飼料，其中豆粕（蛋白）消耗量為6 800 萬t，占比15.3%；導致2021年我國大豆進口量為9 652 萬t，對外依存度為85.66%，嚴重威脅養殖行業的健康發展。在中美貿易摩擦的背景下，如何減少豆粕使用，對保障養殖行業健康發展和人民生活水平提高具有重要意義。2021年3月，農業農村部推薦減少豆粕用量的重要舉措之一是：在飼糧中補充必需氨基酸，降低動物日料中蛋白質水平。小品種氨基酸的添加能有效提高動物生長性能，改善腸道微生物，提高免疫力、減緩應激，在降本增效中發揮著重要作用。

2.1 飼用氨基酸高產菌株構建技術

基于基因-蛋白-生化反應以及組學數據，將細胞代謝網絡和調控網絡標準化、數字化、模型化，搭建了基因組規模代謝網絡模型（GSMM）[40]，可在計算機中模擬細胞代謝，預測氨基酸的最佳合成途徑，設計菌種改造策略，指導氨基酸高產菌株構建[41]。如在大腸桿菌代謝模型iML1515[42]的基礎上，利用GECKO 方法[43]整合酶學動力參數kcat值，構建大腸桿菌酶約束模型（ec_iML1515）。利用酶約束模型ec_iML1515，預測賴氨酸合成過程中的關鍵靶點，發現前體積累、產物合成路徑和能量供給是制約賴氨酸合成的關鍵靶點。在此基礎上。利用模塊化工程策略對預測的關鍵靶點進行調控，使賴氨酸產量增加到193.6 g/L[41]（圖2a）。

為了平衡氨基酸高產菌株中代謝流分配，研究人員建立了一系列代謝流靜態調控方法，實現氨基酸生產菌株的代謝流精細調控。例如，采用啟動子工程平衡L-色氨酸前體磷酸烯醇式丙酮酸、赤蘚糖-4-磷酸和絲氨酸的供給，將L-色氨酸產量提高到52.1 g/L[5]。為了同時調控多個基因表達，研究人員開發了具有切割DNA 和RNA 的雙重功能的CRISPR/Cpf1，Cpf1 可以切割gRNA 陣列使其成為單個成熟的gRNA，同時靶向多個靶基因[44]。利用DNA 切割功能失活的dCpf1 和gRNA陣列，將賴氨酸合成途徑中的檸檬酸合酶（gltA）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pck）、葡萄糖-6-磷酸異構酶（pgi）和高絲氨酸脫氫酶（hom）同時弱化不低于90%，將賴氨酸產量提高了4 倍[44]。然而，靜態調控策略會造成細胞代謝負擔，引起微生物細胞生長緩慢與代謝失衡等[45-46]。為此，開發了一系列基于生物傳感器的動態調控策略：物理信號（光、溫度）、化學信號（pH 值、溶氧）和生物信號（細胞生長濃度）[45-46]。例如，在大腸桿菌中利用溫度敏感型元件（cIts-pR-pL）和調節蛋白（tetRPLtetO-1），開發了基于溫度敏感型的動態調控技術，動態調節丙酮酸羧化酶（PYC），平衡代謝流在細胞生長和蘇氨酸合成之間的平布。在發酵起始階段，通過溫度控制關閉PYC 表達，使代謝流進入TCA 循環用于生長；當細胞生長到一定階段，通過升高溫度開啟PYC 表達，使代謝流經丙酮酸羧化為草酰乙酸用于蘇氨酸合成，最終使L-蘇氨酸產率提高到124.03%[47]（圖2a）。此外，由于氨基酸高產菌株復雜的代謝調控網絡，僅依靠已知靶點的疊加調控，無法實現目標氨基酸代謝流的最大化。為此，在蛋氨酸合成菌株中，建立了包含中心代謝路徑和氨基酸合成路徑中80 個候選靶點的基因庫，并利用CRISPRi 技術對候選靶點基因進行調控，獲得影響蛋氨酸合成的關鍵靶點。根據模塊化工程策略，將蛋氨酸生物合成途徑分為：碳模塊、硫模塊和一碳模塊，并利用CRISPRi 技術對蛋氨酸合成模塊進行多層次調控，最終使蛋氨酸的產量提升到16.86 g/L[48]。

2.2 飼用氨基酸高產菌株高通量篩選技術

為了快速獲得生產性能顯著提升的氨基酸高產菌株，研究人員開發了與目標氨基酸智能適配的生物傳感器，將胞內或胞外的氨基酸濃度信號轉化為易于檢測的熒光信號[49]或細胞生長信號[50]，從而提高高產菌種篩選效率。如在L-賴氨酸高產菌株篩選中，構建了由響應賴氨酸的啟動子元件pA 和綠色熒光蛋白（GFP）組成的表達元件pAG，將胞內賴氨酸濃度轉化為易于檢測的綠色熒光蛋白信號。利用pAG 元件和綠色熒光蛋白強度的變化，從1 000 萬個突變庫中篩選到186 株有益突變體，進一步通過96 孔板篩選到大腸桿菌MU-1和大腸桿菌MU-2 菌株，L-賴氨酸產量達到136.51 g/L 和133.29 g/L[49]。由于基于RNA 適配器具有折疊復雜結構的靈活性，開發了響應L-色氨酸的RNA 適配器，并利用黃色熒光蛋白建立了高產L-色氨酸菌株的高通量篩選平臺，成功獲得1 株L-色氨酸產量提高165.9%的高產菌株大腸桿菌K3mu1[51]。此外，研究人員根據培養環境氨基酸匱乏時，稀有密碼子tRNAs 無法完全翻譯的“密碼子偏好性”規律，建立了基于富含稀有密碼子的氨基酸高產菌株篩選系統，該系統通過將報告蛋白或耐藥標記中的密碼子替換為稀有密碼子，提高蛋白翻譯過程中對胞內氨基酸的“門檻值”，實現了亮氨酸、精氨酸和絲氨酸等氨基酸高產菌株的高通量篩選[50]（圖2b）。

2.3 飼用氨基酸高產菌株環境適應性提升技術

提升高產菌種對工業環境的環境適應性，能顯著提高菌種生產性能[52]。利用誘變育種與適應性進化策略，獲得具有優良生產性狀的氨基酸高產菌株，再通過反向代謝工程策略解析耐受機制，指導高產菌株的選育與構建[52]。例如，通過常壓室溫等離子體（ARTP）誘變L-蘇氨酸生產菌株大腸桿菌TRFC，獲得了抗噬菌體的L-蘇氨酸高產菌株大腸桿菌TRFC-AP，使L-蘇氨酸產量增加到159.3 g/L（提高了10.9%）。對高產菌株大腸桿菌TRFC-AP 的基因分析，發現噬菌體侵染基因（fhuA）的缺失是高產菌株產生噬菌體抗性的根本原因[53]。為了進一步提高氨基酸生產菌種工業環境耐受性，開發了由脅迫誘導突變模塊組成的基因組復制工程輔助連續進化系統（GREACE），在脅迫環境下實現了“邊突變邊篩選”[54]。在GREACE 的基礎上，引入突變的DNA 聚合酶校對元件（DnaQ），使突變率增加了317 倍，并利用GREACE 技術篩選到突變菌株大腸桿菌RS3，將L-賴氨酸產量提高到155 g/L。研究人員進一步利用基因組學和代謝組學技術，解析突變菌株大腸桿菌RS3 耐受機制，發現大腸桿菌RS3 通過前蛋白轉位酶（SecYM145V）、ATP 合酶亞基（AtpBS165N）和瓜丁胺酶（SpeBA302V）的突變，提高了大腸桿菌細胞在脅迫條件的完整性并強化了合成目標化學品賴氨酸代謝流[52]（圖2c）。

圖2 代謝工程改造微生物細胞工廠生產飼用氨基酸Fig.2 Enhancing feed amino acid production by metabolic engineering in microbial cell factories

3 微生物生產單細胞蛋白

蛋白質是生命活動的主要承擔者，在人體健康與生長發育過程中具有不可替代的作用。長期以來，人們主要通過畜牧業獲取肉、蛋、奶等產品作為蛋白質的主要來源?；趥鹘y畜牧業的蛋白生產能力，難以滿足人們日益增長的蛋白質需求。隨著合成生物學、系統代謝工程等新興生物技術的發展，人們開發了利用非致病和非產毒的酵母菌、真菌、藻類和細菌，生產營養價值高，原料來源廣，培養周期短的單細胞蛋白（SCP），實現了向微生物要蛋白[9，55-56]（圖3）。

圖3 微生物細胞工廠生產單細胞蛋白Fig.3 Production of single cell protein by microbial cell factories

3.1 生產單細胞蛋白的微生物細胞

能生產單細胞蛋白的微生物有細菌、藻類、真菌和酵母。其中，細菌具有倍增時間短、生長迅速，營養需求簡單、底物譜廣等優點[55-56]。細菌單細胞蛋白含量約占細胞干重的40%～80%，且在氨基酸組成上優于酵母或真菌單細胞蛋白。例如嗜甲基菌屬（Methylophilus spp）倍增時間僅為2 h，用其生產的單細胞蛋白能替代動物飼料蛋白。此外，細菌在利用廢水中的碳、氮、硫、磷營養物質生產單細胞蛋白方面展現巨大的應用潛力，如紫色光合細菌（Purple photosynthetic bacteria）可用于回收環境廢棄物中的有機物、氮和磷，用于生產單細胞蛋白。然而，細菌通常體積小，分離困難，所獲得的蛋白質不易消化。

藻類單細胞蛋白具有蛋白含量高（占細胞干重的50%～70%），富含脂肪酸、維生素、色素、多肽，核酸含量低（占細胞干重的3%～8%）等優點[57]。藻類能利用太陽光和CO2進行生長和轉化為碳水化合物，加上具有蛋白含量高、生長速度快、栽培簡單的優點，被廣泛應用于飼料生產，如小球藻（Chlorella）和柵藻（Senedessmus）被用作魚類飼料[58]。藻類單細胞蛋白的缺點在于藻類細胞具有纖維質的細胞壁，不易被人體消化；同時藻類培養過程中能富集一定量的重金屬，限制了其進一步應用。

真菌單細胞蛋白含量在30%～50%之間，含有豐富的蘇氨酸和賴氨酸，甲硫氨酸含量較低[57]。真菌單細胞蛋白還可以提供核黃素、煙酸、硫胺素、生物素、泛酸等多種維生素。如1985年Marlow Foods（GB）公司推出的威尼斯鐮刀菌（Fusarium venenatum）單細胞蛋白，可以替代動物肉類，形成肉類替代品QuornTM，進一步研究發現，攝食威尼斯鐮刀菌單細胞蛋白后，人體的胰島素和血糖水平顯著降低[59]。此外，芬蘭科學家以糖、木材水解物或亞硫酸鹽廢料上生長的絲狀真菌宛氏擬青霉（Paecilomyces varioti） 作為單細胞蛋白用于動物飼料[60]。真菌單細胞蛋白存在的問題是真菌生產速度較慢、核酸含量高，從而引起痛風或風濕性關節炎。

酵母細胞生產單細胞蛋白具有以下幾個優點：1）含有45%左右的優質全價蛋白質，包括兒童所必需的組氨酸在內的人體必需的9 種氨基酸，滿足人類營養需求；2）酵母單細胞蛋白易消化，無致敏成分，無豆腥味，適用人群廣泛；3）酵母發酵工藝成熟，適合于規?；圃?；4） 酵母細胞體積大，易于分離回收。例如：釀酒酵母作為釀酒工業的副產品，可用于生產酵母提取物以及馬麥醬、維吉麥醬等酵母咸味醬。2019年，歐洲食品安全局（EFSA） 接受經干燥和滅活處理的解脂耶氏酵母為新型食品[61]。

3.2 用于生產單細胞蛋白的微生物工程改造

對生產單細胞蛋白的微生物菌株進行改造，主要涉及提高底物利用效率，提高細胞環境耐受性，提高細胞生長速度和蛋白質的含量。在利用復雜原料生產單細胞蛋白過程中，原料中有毒組分會抑制細胞生長，從而降低細胞濃度，降低單細胞蛋白的生產效率[62]。通過表達外轉運蛋白和工程改造轉錄因子，可以減少微生物細胞對這些有毒組分的攝取，從而提高細胞的耐受性和生長速度[63]。而過表達轉運蛋白可以提高其吸收底物的速度，提高底物利用率，進一步促進細胞生長[64-65]。在以多種糖作為原料時，表達多種糖攝取轉運蛋白能顯著改善細胞的生長性能，如在藍藻PCC 7002（Synechococcus sp PCC 7002）中過表達天然Na+依賴性碳轉運蛋白（SbtA 和BicA），顯著提高了細胞生長速率和干細胞質量[65]。在以甘油（工業過程中的關鍵副產品）為原料生產單細胞蛋白時，在產甘油假絲酵母（Candida glycerinogenes）中過量表達甘油轉運蛋白（STL1 和STL2），顯著增加了產SCP 的微生物細胞濃度[66]。

適應性進化（ALE）、化學誘變和基因組工程也被廣泛用于改善微生物細胞的生長性能和生物量積累。如：借助適應性進化技術，篩選獲得能在一種或多種抑制劑存在的情況下生長速率提高3.3 倍，而延滯期縮短56%的菌株馬克斯克魯維酵母（Kluveronymces maxianus）。將化學誘變與適應性進化相結合，則能顯著提高大腸桿菌甲基營養菌株的甲醇耐受性[67]。

生產單細胞蛋白的微生物細胞濃度也可以通過協同生長的方式得到提高[68-69]。工程化改造的方法包括：調節細胞表觀遺傳因素，微生物群落的結構，共存菌株的營養需求，可利用營養物質，副產品的途徑。相關策略包括快速基因組測序/重新設計，多組學數據生成和分析，計算機建模，提高生產量和生物制造自動化等技術的發展。

提高蛋白質含量的方法策略包括：減少mRNA 和蛋白質降解，增強蛋白質折疊和重折疊，減少蛋白質的降解。mRNA 降解與核糖核酸酶（RNase）在mRNA 上的結合概率有關，為了減少總mRNA 降解維持胞內總mRNA 水平，一種直接的方法是開發和使用核糖核酸酶（RNase）缺陷菌株[70]。分子伴侶（如大腸桿菌GroEL/ES 和DnaK/J/GrpE）可以指導翻譯蛋白質的正確折疊，對錯誤折疊或聚集的蛋白質進行重新折疊。單個或多個伴侶的共表達是增強微生物細胞中蛋白質含量的有效方法[71]。提高蛋白質產量的另一方法是開發和使用缺乏蛋白酶的微生物細胞，減少蛋白質降解。如敲除枯草芽孢桿菌中8 個細胞外蛋白酶基因，可以獲得具有更高穩定性的異源蛋白，然而，很少有文獻報道蛋白酶基因的缺失會提高SCP 中的總蛋白質產量[72]。

3.3 用于生產單細胞蛋白的原料

單細胞蛋白生產所需的原料包括碳源、氮源、無機鹽、磷鹽等。常用碳源包括氣態碳氫化合物、正烯烴、乙醇、甲醇、碳氧化物、多糖、糖蜜、各種啤酒廠的流出物和其它固體化合物[57]。原料占單細胞蛋白生產總成本的45%～75%，碳源占據大部分原料成本，而氮源僅占原料成本的7%～15%[73]。

以碳為主要成分的碳水化合物在自然界中分布廣泛，易于獲取，且易被微生物所利用，如糖蜜、乳清、淀粉和烷烴等碳水化合物。生產單細胞蛋白的其它碳源包括二氧化碳、正烯烴、乙醇、甲醇、碳氧化物等[57]，而在藻類的培養過程中需要高耗能的攪拌促進二氧化碳的溶解。利用來源豐富且價格低廉的農業和工業廢棄物生產單細胞蛋白，不僅可以減少近80%的生物需氧量，而且還可最大限度地減少處置它們所需的處理成本[74]。然而，使用前需要對其特殊處理，增加了生產成本，而工業廢棄物在使用過程具有高水平的生物需氧量，如果不進行處理就會造成環境污染。碳氫化合物及其衍生物也可用作生產單細胞蛋白的底物，約占總生產成本的30%～70%[61]。碳氫化合物通常從天然氣或石油中獲得，在本質上屬于不可再生資源。

微生物在生長和生產單細胞蛋白的過程中，需要氨、銨鹽或硝酸鹽等提供的氮源，而且在生長過程中培養基需要保持合適的碳氮比[60]。研究表明，微生物中存在相似的碳氮比，培養基中碳氮比維持在10∶1 最優。也有研究表明，不同微生物之間，培養基碳氮比不同。當碳氮比較高時，導致培養基中的氨先被消耗完，影響后期單細胞蛋白的合成。當碳氮比在1∶1 時，氨大部分被浪費掉，不能進入細胞[56]。除碳水化合物和氮源外，生產單細胞蛋白的培養基中還需補充一定量的微生物生長所需的維生素、礦物質等營養物質，以最大限度地獲得最大蛋白產量。

4 展望

利用合成生物學、系統代謝工程等新興生物技術構建的微生物細胞工廠，實現了向自然界要銨，向微生物要氨基酸和向微生物要蛋白，在滿足人體營養需求的前提下，有效減少土地資源、淡水資源的利用和溫室氣體的排放。氮素不僅是氨基酸與蛋白質的重要組成部分，也是動植物生長的必需元素之一。圍繞生物固氮等氮代謝途徑，開發新型生物固氮技術，克服天然固氮體系缺陷，創制新一代人工高效固氮技術是未來的研究方向。目前，微生物細胞主要以“糧食生物質”淀粉作為原料的第1 代生物煉制技術進行微生物氨基酸和微生物蛋白質合成，存在“與人爭糧，與糧爭地”等問題。為了解決這個問題，可以開發以木質纖維素等非糧生物質作為原料的第2 代生物煉制技術。CO2作為自然界含量豐富的碳源，預計到2050年CO2排放量將增加到500 億t/年。利用CO2作為微生物細胞工廠的原料，不僅可以實現“不與人爭糧，不與糧爭地”的目標，而且可以減少CO2排放，為實現碳達峰與碳中和提供一條有前景的發展路線。雖然通過科研人員的不斷努力，賦予或者強化了微生物細胞工廠的固定CO2的能力，但是微生物細胞工廠大規模利用CO2生產目標化學品還缺乏市場競爭力，迫切需要捕碳元件與能量供給方面的突破。