植物乳桿菌WU14 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因克隆、蛋白表達及生物信息學分析

繆婷婷，沈風飛，張曉曉，邱胡林，徐 波，尹愛國*，石鵬君1，*

（1 江西農業大學生物科學與工程學院 南昌 330045 2 廣東石油化工學院生物與食品工程學院 廣東茂名 525000 3 中國農業科學院農產品加工研究所 北京 100193）

乳酸菌是一類在自然界中廣泛存在的革蘭氏陽性菌，能夠在生物氧化的過程中獲得能量并生長繁殖。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，最適生長溫度在30～35 ℃，最適pH 值為6.5 左右，是一類兼性異養，兼性厭氧的同型發酵乳酸菌[1]。植物乳桿菌作為安全的食品發酵劑，在改善食品風味和發酵特性等方面被廣泛應用[2]。其在葡萄酒釀造業中也發揮著重要作用。植物乳桿菌是葡萄酒進行蘋果酸乳酸發酵常見的乳酸菌之一[3]，可在葡萄酒高酒精、低、高溫等苛刻條件下生長[4]，并且其產生的β-葡萄糖苷酶對葡萄酒的風味有著非常重要的影響[5]，對于葡萄酒的增香具有廣闊的應用前景[6]。

β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，EC3.2.1.21），是一種能夠水解糖苷鍵，從而產生揮發性香氣物質和葡萄糖的糖苷水解酶（glycohydrolase enzyme，GH enzyme）[7]，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能水解結合于非還原性末端的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D 葡萄糖和相應的配基，是纖維素分解酶系中的重要組成成分[8]。另外，還有一類6-磷酸-β-葡萄糖苷酶（6-phospho-β-glucosidase，EC 3.2.1.86）[9]在微生物中基本以胞內酶的形式存在，可催化6-磷酸-纖維二糖、6-磷酸-纖維素寡糖等6-磷酸-β-葡萄糖苷類化合物產生葡萄糖-6-磷酸，使纖維素得以分解[10-11]。

6-磷酸-β-葡萄糖苷酶有兩類，分別分布于GH1 和GH4 中。GH1 家族作用殘基多為兩個谷氨酸殘基，靠近N 端的谷氨酸起酸/堿作用，另一谷氨酸起親核試劑的作用[12]。這兩類酶的主要區別是GH4 的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶催化底物分解時需要金屬離子（Mn2+，Ni2+，Co2+或Fe2+）和NAD+的輔助，而GH1 的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶則可獨立完成催化作用[11，13]。目前關于β-葡萄糖苷酶的研究很多，而有關6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的報道很少，鮮見有關植物乳桿菌來源的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶，原因之一可能是其在異源表達時容易形成包涵體或需要磷酸化底物[14]。牛瑜[15]、尹捷等[16]和劉晴等[17]以pNPβG6P（p-Nitrophenyl-β-D-Glucuronide-6-phospho，對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸）為底物，測定6-磷酸-β-葡萄糖苷酶酶活。

根據NCBI 數據庫中的比對信息得到植物乳桿菌WU14 中有8 個6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因。本研究 對8 個基 因BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14和BglHW14 進行基因克隆和異源表達，并對其對應的編碼蛋白進行生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

植物乳桿菌（L.plantarum）WU14 篩自腌菜，大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α 克隆菌株、E.coli BL21（DE3）表達菌株購自博邁德生物公司，表達載體pET30a（+）為本實驗室保存。

1.2 工具酶和試劑

限制性內切酶Hind III、Nde I，Thermo Scientific 公司；Exnase Ⅱ連接酶，Vazyme 公司；KOD Plus Neo 高保真酶，株式會社東洋紡公司；DNA 凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒和清潔回收試劑盒，康寧生命科學有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒，Solarbio 公司；普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，TIANGEN 公司；鎳柱填料，QIAGEN 公司；TGA Stain-Free Fast Cast Acrylamide Kit 12%，BIO-RAD 公司；其它試劑均為國產分析純，購自北京化學試劑公司。

1.3 試驗儀器

DK-8D 三孔電熱恒溫水槽，上海齊欣科學儀器有限公司；PCR 儀，Bio-rad 公司；紫外分光光度計，菲勒儀器有限公司；超聲波細胞破碎儀，貝普斯科技有限公司；臺式高速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；pH 計，METTLER TOLEDO 公司；電子天平，上海天美天平儀器有限公司；膠片觀察燈，北京六一儀器廠；電泳儀，北京東方瑞利電泳設備有限公司；磁力攪拌器，Kylin-bell 實驗儀器公司；恒溫振蕩培養箱，上海旻泉儀器有限公司；脫色搖床，Kylin-bell 實驗儀器公司；潔凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司。

1.4 培養基和相關溶液

1）LB 培養基 5 g/L 酵母提取物，10 g/L 胰蛋白胨，10 g/L NaCl，（固體培養基含20 g/L 瓊脂），121 ℃滅菌20 min。

2）MRS 液體培養基 蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，K2HPO42.0 g，檸檬酸銨2.0 g，無水乙酸鈉5.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 mL，MgSO4·7H2O 0.50 g，MnSO4·2H2O 0.25 g，調節pH 值為7.0，加入蒸餾水補至1 L。

3）10×SDS-PAGE 緩沖液 188 g 甘氨酸，10 g SDS，30.3 g Tris 堿，蒸餾水900 mL 25 ℃水浴攪拌溶解，定容至1 L，室溫保存備用。

4）考馬斯亮藍R250 染色液 0.1%（質量分數） 考馬斯亮藍R250，10%（質量分數） 冰醋酸，25%（質量分數）異丙醇，蒸餾水定容1 L，過濾去除雜質，室溫避光保存備用。

5）卡那霉素 配制母液50 mg/mL，濾器過濾除菌，-20 ℃保存備用。

6）NTA 緩沖液 20 mol/L Tris-Hcl 緩沖液，0.5 mol/L NaCl，20～300 mmol/L 咪唑，每個梯度調pH 7.4。

7）IPTG 配制母液24 mg/mL，濾器過濾除菌，-20 ℃保存備用。

8）50×TAE Buffer Tris 242 g，Na2EDTA·2H2O 37.2 g，冰乙酸57.1 mL，蒸餾水定容至1 L，調pH 8.5，室溫保存備用。

1.5 方法

1.5.1 菌種活化 從-80 ℃冰箱中取出保藏菌株植物乳桿菌WU14 在MRS 固體平板上劃線，挑取單菌落接種到4 mL MRS 液體培養基中，37 ℃靜置培養12 h，后按1%接種量接種至100 mL MRS液體培養基中37 ℃靜置培養12 h。

1.5.2 基因組DNA 提取及濃度純度檢測 使用購自Solarbio 公司的細菌基因組DNA 提取試劑盒，提取植物乳桿菌WU14 總基因組，操作步驟按照試劑盒說明書進行，提取的基因組DNA 用超微量蛋白核酸分析儀檢測，確定提取的DNA 的濃度和純度是否合格，將合格的基因組DNA 置于-20 ℃冰箱保存。

1.5.3 目的基因的PCR 擴增 引物是由華大基因公司合成，PCR 擴增特異引物序列依次為：

表1 基因擴增引物Table 1 The primers used for gene cloning

PCR 反應體系（50 μL）：KOD buffer 5 μL、dNTP 5 μL、MgSO43 μL、WU14 基因組1 μL、引物各1.5 μL、KOD 酶1 μL，加ddH2O 至50 μL。

PCR 擴增程序：94 ℃預變性2 min、98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min 30 s，35 個循環，最后4 ℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR 擴增產物，電泳結束后用凝膠成像系統留圖分析。

1.5.4 pET30a（+）空載體雙酶切 使用下列快切酶體系（50 μL）對pET30a（+）空載體進行雙酶切37 ℃金屬浴4 h，并使用PCR 清潔試劑盒回收酶切產物，測好濃度，保存在-20 ℃冰箱中備用。

酶切體系：

pET30a（+） 20 μL

Hind III 限制性內切酶 1.5 μL

NdeⅠ限制性內切酶 1.5 μL

FD buffer 5 μL

ddH2O 22 μL

總體積 50 μL

1.5.5 無縫連接目的片段與酶切載體 使用購自康寧生命科學有限公司的DNA 凝膠回收試劑盒回收目的基因，然后使用pET30a（+）載體系統，按照下列無縫連接體系（10 μL），37 ℃連接45 min。質粒的轉化參照大腸桿菌DH5α 感受態的轉化方法進行。

Exnase Ⅱ連接酶 1 μL

pET30a（+） 1 μL

目的基因回收片段 1 μL

ddH2O 5 μL

buffer 2 μL

總體積 10 μL

1.5.6 重組質粒的提取及轉化 用含有Kana（K+） 抗生素的LB 培養基活化已驗證正確的含有重組克隆載體的大腸桿菌DH5α 感受態菌株，37 ℃振蕩培養6～8 h，取1～4 mL 的菌液用于提取重組質粒，質粒的提取參照康寧生命科學有限公司的質粒小提試劑盒的提取方法。重組質粒的轉化參照大腸桿菌BL21 感受態的轉化方法進行。

1.5.7 重組蛋白的誘導表達、純化和檢測 將過夜培養的重組質粒種子液按1%接種于200 mL LB（K+）液體培養基中，37 ℃搖床培養至OD600為0.4～0.8，加入終濃度為0.6 mmol/L 的IPTG 37 ℃振蕩培養4 h。收集誘導完成的發酵液菌體，利用超聲破碎儀將細胞破碎，收集破碎上清液和破碎沉淀，用鎳柱純化蛋白，并用不同濃度的咪唑洗脫純化蛋白，然后用SDS-PAGE 分析蛋白表達情況。

1.5.8 測序及生物信息學分析 將1%瓊脂糖凝膠電泳驗證正確的菌液送至華大基因公司測序。測序完成后，將得到的堿基序列翻譯為氨基酸序列，隨后進行生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌WU14 全基因組的提取

利用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取植物乳桿菌 WU14 全基因組DNA，提取的基因組DNA 用超微量蛋白核酸分析儀檢測，其質量濃度在40 ng/μL，可用于后續試驗，同時用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，提取結果如圖1所示。

圖1 植物乳桿菌WU14 基因組的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis of L.plantarum WU14 genome

2.2 克隆8 個β-葡萄糖苷酶編碼基因

通過基因組測序結果分析，經CAZy 數據庫（http：//www.cazy.org/）注釋分析發現基因組上具有8 個GH1 家族6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因。利用植物乳桿菌WU14 基因組為模板，以目的基因的特異性引物為擴增引物進行PCR 擴增，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果如圖2所示，目的條帶大小為1 500 bp 左右，結果顯示擴增條帶大小正確，條帶單一濃度較高，可用于后續試驗。

圖2 BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14 和BglHW14 基因PCR 擴增凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14、BglHW14 gene PCR amplification

2.3 SDS-PAGE 分析重組蛋白

利用生物信息學軟件SnapGene 分析目的基因序列，8 個基因的理論蛋白大小均為55 ku 左右。8 個蛋白結果如圖3到圖6所示，以未加IPTG 誘導的菌液作為對照組，可以看出8 個蛋白都誘導表達成功，蛋白BglAW14、BglCW14 和BglFW14 的破碎上清液表達條帶明顯且與誘導成功的條帶一致，都在55 ku 左右，其余的5 個蛋白的菌體破碎上清未檢測到表達蛋白，而菌體破碎沉淀都有大量表達，故5 個蛋白都為包涵體表達。蛋白BglAW14、BglCW14 和BglFW14 為部分可溶性表達。

圖3 SDS-PAGE 分析Fnr 蛋白Fig.3 SDS-PAGE analysis of Fnr protein

圖4 SDS-PAGE 分析BglDW14 和BglEW14 蛋白Fig.4 SDS-PAGE analysis of BglDW14 and BglEW14 protein

圖5 SDS-PAGE 分析BglDW14 和BglEW14 蛋白Fig.5 SDS-PAGE analysis of BglFW14 and BglGW14 protein

圖6 SDS-PAGE 分析BglHW14 和BglAW14 蛋白Fig.6 SDS-PAGE analysis of BglHW14 and BglAW14 protein

純化蛋白BglAW14、BglCW14 和BglFW14 的SDS-PAGE 結果如圖7所示，3 個蛋白用不同濃度的咪唑溶液洗脫后，得到的純化蛋白的條帶與對應的已誘導的菌體破碎液上清條帶一致，表達量高且條帶單一，用pNPG 法處理樣品10 min 沒有檢測到β-葡萄糖苷酶酶活。劉晴等[16]研究的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶TteBg1B 具有較強的底物特異性，對β-D-葡萄糖苷鍵和β-D-半乳糖苷鍵僅有微弱的水解作用。尹捷等[15]研究的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶PbgL 具有底物專一性，對pNP 衍生物中的α-半乳糖苷鍵，6-磷酸-α-葡萄糖苷鍵，6-磷酸-α-半乳糖苷鍵及6-磷酸-α-甘露糖苷鍵均無水解作用，本研究中的這3 個純化酶與已報道的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶具有特異降解6-磷酸底物，而不能水解pNPG 的酶學特性相一致。

圖7 SDS-PAGE 分析BglAW14、BglCW14和BglFW14 純化蛋白Fig.7 SDS-PAGE analysis of BglAW14，BglCW14 and BglFW14 purified protein

2.4 目的基因BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14 和Bgl-HW14 的生物信息學分析

2.4.1 氨基酸序列分析、跨膜結構和信號肽預測用NCBI 比對氨基酸序列，結果如表2所示，8 個基因與對應的蛋白注釋的一致性在100%。在線（http：//web.expasy.org/protparam/）預測8 個基因編碼蛋白的氨基酸長度、分子質量和等電點如下表3所示。蛋白質的跨膜結構能分析蛋白質的定位，為后續的表達、純化有著重要影響，利用TMHMM 2.0 對8 個基因進行跨膜結構預測，結果如下表2所示，8 個蛋白均沒有跨膜結構，預測結果均為可溶性蛋白。信號肽能夠引導新合成的蛋白向分泌通路轉移，預測蛋白類型，利用SignalP4.0 對8 個基因進行信號肽預測，預測結果如下表2所示，8 個蛋白均沒有信號肽，預測結果均為非分泌蛋白。

表2 植物乳桿菌的GH1 家族葡萄糖苷酶的基因注釋和一致性分析Table 2 Gene annotation and consistency analysis of GH1 family glucosidase from L.plantarum

表3 氨基酸序列分析、跨膜結構和信號肽預測Table 3 Amino acid sequence analysis，transmembrane structure and signal peptide prediction

2.4.2 氨基酸序列比對分析及系統發育樹分析將8 個蛋白的氨基酸序列進行序列比對，結果如圖8所示，8 個序列都具有GH1 家族葡萄糖苷酶的兩個典型的谷氨酸（E）催化位點。N 端序列差異明顯，C 端序列具有較高的一致性。同時對8 個蛋白序列用MEGA 5 軟件的NJ 法構建系統發育樹，結果如圖9所示，8 個蛋白序列的一致性在32%～74%之間。從進化樹分析結果發現，8 個蛋白形成3 個進化簇，其中BglBW14 和BglDW14 氨基酸一致性最高為74%，其次BglFW14、BglHW14和BglGW14 相互之間的一致性在66%以上。其它蛋白氨基酸一致性均在60%以下，尤其BglAW14與其它7 個蛋白氨基酸一致性在40%以下。

圖8 氨基酸序列比對結果Fig.8 Amino acid sequence alignment results

圖9 系統發育樹Fig.9 Phylogenetic tree

2.4.3 蛋白二級結構預測 蛋白質的二級結構是蛋白質的多肽鏈中有規則重復的構象，主要包括α-螺旋、β-折疊和β-轉角，在線（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopm.pl）預測BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14 和BglHW14 的二級結構，結果如下表4所示，8 個蛋白均有最大占比的α-螺旋，中等占比的延伸鏈，大占比的無規則卷曲以及小占比的β-轉角。

表4 蛋白二級結構預測Table 4 Protein secondary structure prediction

2.4.4 亞細胞定位 亞細胞定位能預測蛋白在細胞內的位置，對于研究蛋白具有重要意義，在線（http：//www.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=programs&subgroup=gfindb） 預測BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14 和BglHW14 編碼蛋白在細胞內的位置如下表5所示，BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglFW14 和BglGW14 的預測結果顯示其位于細胞質內，BglEW14 的預測結果顯示其位于分泌內，BglHW14 的預測結果顯示其位于細胞膜。其中BglCW14 和BglFW14 在周質空間內有較多的占比，BglCW14 和BglFW14 具有部分可溶性可能與此相關。

表5 亞細胞定位Table 5 Subcellular localization

3 結論

1）本研究成功克隆到8 個來自植物乳桿菌WU14 的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶編碼基因。經SDS-PAGE 驗證可知8 個酶蛋白在大腸桿菌中異源表達成功，但只有3 個蛋白BglAW14、BglCW14和BglFW14 為部分可溶性表達，其余5 個酶蛋白為包涵體。

2）對8 個基因的編碼蛋白進行生物信息學分析，結果顯示：8 個基因都屬于GH1 家族，編碼6-磷酸-β-葡萄糖苷酶。編碼氨基酸具有GH1 家族6-磷酸-β-葡萄糖苷酶保守的兩個催化區域（NEP 和ENG）。編碼蛋白都無信號肽和跨膜結構、疏水性較強。亞細胞結構預測可知，除了BglEW14 主要存在于分泌結構內和BglHW14 主要存在于細胞膜，其余的6 個基因都存在于細胞質內。

3）研究表明BglAW14、BglCW14 和BglFW14在大腸桿菌中異源表達為可溶性蛋白，并純化獲得了單一目的條帶，但上述3 個可溶性蛋白以pNPG 為底物未檢測到β-葡萄糖苷酶活性，這與6-磷酸-β-葡萄糖苷酶具有特異降解6-磷酸底物，而不能高效水解pNPG 的酶學特性相一致。