不同組合菌種預處理對褐煤制生物甲烷的影響

王 磊，郭紅玉，趙樹峰，石尚威，趙國俊

(1.山西焦煤山煤國際大平煤業有限公司，山西 長治 046200； 2.河南理工大學 能源科學與工程學院，河南 焦作 454000； 3.山西小回溝煤業有限公司，山西 太原 030400)

我國褐煤資源儲量豐富，尤其是內蒙古自治區，占全國褐煤總儲量的77%，其次是云南省，占全國褐煤資源儲量的12.6%[1]。褐煤水分含量高、易風化，難以洗選和儲存，目前以粉煤鍋爐燃燒為主，也有傳統的煉焦、氣化和液化等處理方式[2-6]。但這些方法存在利用率低、成本較高、環境污染等問題，亟需一種清潔高效利用褐煤的方法。近年來，由于煤層氣生物工程的蓬勃發展[7]，人們對微生物增產煤層氣概念有了更加深入的了解，并且國內外開展了現場生物增產煤層氣的許多試驗，其中美國的Ciris Energy公司將營養液加入至循環水中以刺激煤層中現存細菌的生長，進而對煤炭進行降解，產生甲烷。2010年現場測試，注入營養液4個月后，煤層氣井甲烷產量迅速上升，相比注入前，產量提高了2～5倍[8]。我國華北油田公司，在山西晉城鄭1區塊煤層氣井鄭1-312開展試驗，煤層埋深780m，煤層溫度32℃。注入配液用煤層氣井排采水，2015年1月26日開始現場施工，總注入量230m3，營養劑關井反應60d后煤層產出液菌群濃度與措施前相比較增加了2～5個數量級，煤層營養物質被消耗，措施前平均日產氣16.81m3，措施后平均日產氣75.13m3，微生物措施起到了穩產增氣的目的[9]。因此，微生物降解煤產生物甲烷，成了國內外學者研究的熱點，由于其反應條件溫和、綠色環保、能耗低而備受關注[10-12]。

微生物降解煤產甲烷包括水解、產酸、產氫/產乙酸、產甲烷階段和多菌群的協同作用，而水解階段是整個過程中的限速階段[13]，預處理往往是解決限速階段的重要方法之一[14]。目前對煤進行預處理的方法分為物理、化學和生物三大類。物理預處理主要采用物理方法(超聲波、溶脹等)，旨在促進煤的溶解與降解過程[15，16]；化學預處理通過雙氧水、硝酸和高錳酸鉀等溶液打斷煤大分子間的化學鍵，將煤的復雜大分子結構解聚成小分子，從而促進煤的轉化[17，18]；生物預處理多采用細菌、放線菌、白腐菌、酵母菌等微生物對煤進行降解處理，使煤從大分子結構分解成小分子和酸類物質，從而更好地被產甲烷菌利用，實現煤的高效產氣[19-22]。

由于生物預處理具有成本低、條件溫和、環境污染小等特點，因此本文研究不同組合微生物處理褐煤對煤制生物甲烷的影響，對煤進行不用組合菌種的預處理，在不同組合菌種處理下研究煤的生物產氣特征，并通過動力學方程模擬不同組合菌預處理煤的最大甲烷產率和累計產氣潛力，以此探索提高褐煤生物產氣的新方法，為后續現場試驗提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗煤樣

本實驗煤樣采自內蒙古西烏珠穆沁旗白音華礦的新鮮褐煤，采集之后迅速進行密封處理，然后使用蒸餾水進行沖洗，使用高壓滅菌鍋在121℃下處理20min進行滅菌，再將處理后的煤樣放入60℃恒溫干燥箱中，等烘干至重量不變后將煤樣密封保存。實驗前需將煤樣破碎篩分至60～80目，采用國家標準GB/T 30732—2014和GB/T 31391—2015對煤樣進行了工業分析和元素分析，分析結果見表1。

表1 內蒙古白音華褐煤樣品的基本性質 %

1.2 產甲烷菌的富集培養

1)礦井水的采集。礦井水采自焦作古漢山礦新鮮的煤層水，將礦井水迅速放入容器中并使用N2進行密封，帶回實驗室后放入冰箱內保存，設置溫度為4℃，以備后續生物產氣實驗使用。

2)產甲烷菌群的富集培養。產甲烷菌群的培養基見表2。將礦井水和培養基的混合液pH值調為7.0，然后裝入無菌容器中，向其中充入氮氣5min，完成后迅速密封并放入恒溫培養箱，設置溫度為35℃，然后在厭氧環境進行為期4d的發酵，得到產甲烷菌群富集液。

1.3 預處理菌種的篩選與培養

1.3.1 菌種的篩選

目前可降解煤的微生物有許多種，包括細菌(如假單孢菌、巨大芽孢桿菌)、放線菌(如鏈霉菌)、酵母菌、真菌(如云芝、粉狀側孢菌、假絲酵母)等，總的來說，真菌類占比較大[23-25]。為驗證不同菌種的處理效果，同時滿足經濟性、適用性、以及無污染性等特點，實驗從細菌中選取假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，從放線菌中選取綠孢鏈霉菌(Streptomyces viridosporus)，從真菌中選取白腐菌(Phanerochaete ch-rysosporium)作為預處理菌種。菌種源是北納創聯生物科技有限公司和中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種基本信息見表3。

表2 產甲烷菌群培養基

表3 菌種基本信息

各菌種培養基的配制：

1)CM0841培養基：牛肉膏10g，酵母膏5.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖5.0g，瓊脂15.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1L，pH=7.2。

2)0038 ISP-2培養基：麥芽提取物10g，葡萄糖4g，瓊脂15g，酵母提取物4g，蒸餾水1L，pH=7.3。

3)綜合馬鈴薯培養基：葡萄糖20g，MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素0.008g，KH2PO43g，瓊脂15g，20%馬鈴薯汁1L，pH=6。

1.3.2 菌種的活化與培養

購買菌種均為凍干管模式，存放在安瓿內并處于密封狀態，該狀態不能直接進行實驗，需要先對其進行活化和富集，過程在固體斜面培養基上進行，在菌種活化富集完成后可進行煤樣預處理實驗。

培養操作：首先使用無菌吸管吸取約0.3～0.5mL的菌種對應液體培養基(不添加瓊脂)，然后滴入安瓿內，輕輕振蕩，直至凍干菌體溶解呈現出懸浮狀；之后吸取安瓿瓶內全部菌懸液，移入對應培養試管中，首次活化成功后不能直接用于實驗，在培養箱中使其再進行1～2次傳代以恢復活力，之后可對煤樣進行預處理。

1.4 菌種生長階段測定

論文選擇比濁法進行各個菌種生長階段的數據測量，該方法利用微生物懸液濃度與其渾濁度成正比的特性，使用分光光度計進行各細菌懸液的光密度的測定，從而得到各菌液的濃度并繪制出生長曲線，如圖1所示。

圖1 菌種生長曲線

由圖1可看出，假單胞菌、綠孢鏈霉菌和白腐菌三種菌的遲緩期為1～2d；對數期在2～3d，此時是所有菌種生長速率最快的時期；在第4～5d，菌種生長曲線有所下降；在第6d進入相對穩定期；在第15d后，菌種死亡率增加，菌種生長進入衰退期。為了提高菌種作用效果，選擇培養第2d(對數期)的菌種進行預處理實驗。

1.5 煤樣生物預處理

實驗前將使用電磁礦石粉碎機將煤樣粉碎，并使用標準篩選取60～80目之間煤樣，置于干燥樣品袋內保存。

在超凈工作臺進行煤樣的預處理實驗，實驗選用篩分至60～80目的煤樣，實驗前先對煤樣進行滅菌處理，然后再進行干燥，之后取10g煤樣放入無菌反應瓶中，向反應瓶中加入經過富集培養的菌液，使菌液淹沒煤樣，然后用棉塞塞住瓶口，棉塞中加入醫用棉，以防止預處理實驗中菌種被污染，并且使用棉塞能保證實驗過程中的有氧環境。不同組合菌種預處理煤樣見表4。

表4 生物預處理實驗分組

1.6 氣體組分含量測定

采用安捷倫7890 GC型氣相色譜儀進行氣體組分測定。采用進樣針手動進樣，每次進行體積為1mL，5A分子篩不銹鋼填充色譜柱，檢測溫度為100℃，載氣為氦氣，流速為30mL/min。

1.7 氣體體積測定

產氣量采用排水集氣法進行測量，每3 d測量一次，氣體體積為集水瓶中排出水的體積。

2 產氣特征分析

2.1 生物預處理對煤制生物甲烷的影響

為了研究生物預處理對煤制生物甲烷的影響，將預處理煤樣與原煤樣進行厭氧發酵生物產氣實驗，每3d測定各組煤樣產氣量直到無氣體生成，然后用氣相色譜儀對實驗所產氣體組分進行測定。

2.1.1 不同組合菌種預處理對產氣量的影響

菌種預處理后煤樣累計產氣量如圖2所示。對照組Y-H總產氣量為151.50mL，其中甲烷產量為52.33mL，甲烷濃度為34.54%；生物預處理組J-L-H、J-B-H、L-B-H、L-J-H、B-J-H和B-L-H的總產氣量分別為180.50mL、187.50mL、285.50mL、196.50mL、175.50mL、278.50mL，相比于對照組Y-H分別增長了19.14%、23.76%、88.45%、29.70%、16.23%和83.83%，各生物預處理組甲烷產量為68.50mL、96.30mL、106.49mL、89.15mL、82.71mL和118.98mL，相比于對照組分別增加了30.90%、84.02%、103.50%、70.36%、58.05%和127.36%。綜上，煤樣經過不同組合菌種預處理后其總產氣量、甲烷生成量以及甲烷濃度比原煤樣均有不同程度的提高，推測菌種在預處理過程中改變了煤的結構，使其更易向甲烷方向轉化。

圖2 菌種預處理后煤樣累計產氣量

2.1.2 不同組合菌種對階段產氣量的影響

煤樣經菌種預處理后的階段產氣量如圖3所示。由圖3可知，煤制生物氣實驗中，0～6d為產氣初期階段，此時各實驗組的產氣速率普遍較低；6～12d為快速產氣階段，此階段是產氣量的主要來源，到第12d產氣基本停止，累計產氣量基本穩定，只有L-B-H組(綠孢鏈霉菌+白腐菌+白音華原煤)和B-L-H組(白腐菌+綠孢鏈霉菌+白音華原煤)還繼續產氣，但產氣速率大幅降低；12～21d，L-B-H組和B-L-H組產氣逐漸停止，到第21d，所有實驗組停止產氣。

圖3 煤樣經菌種預處理后的階段產氣量

2.1.3 不同組合菌種預處理和產氣的關系

煤樣經菌種預處理后產氣甲烷濃度如圖4所示，J-L-H組與J-B-H組相比，兩組產氣總量相近，但后者的甲烷生成量和產甲烷濃度更高，說明假單胞菌+白腐菌的預處理順序比假單胞菌+綠孢鏈霉菌更好；L-B-H組與L-J-H組相比，前者的總產氣量和甲烷生成量高于后者，但產甲烷濃度低于后者；B-J-H組和B-L-H組相比，后者的總產氣量和甲烷生成量高于前者，但產甲烷濃度低于前者。

圖4 煤樣經菌種預處理后產氣甲烷濃度

產氣量較高的是L-B-H組和B-L-H組，甲烷生成量較高的也是L-B-H組和B-L-H組，但B-L-H組的甲烷濃度和甲烷生成量略高于L-B-H組；經過對比J-L-H組和L-J-H組，發現L-J-H組的產氣量、甲烷生成量和產甲烷濃度都高于J-L-H組，表明綠孢鏈霉菌+假單胞菌的預處理順序產氣效果較好；經過對比J-B-H組和B-J-H組，發現J-B-H組的產氣量、甲烷生成量和產甲烷濃度都高于B-J-H組，表明假單胞菌+白腐菌的預處理順序產氣效果較好。推測綠孢鏈霉菌和白腐菌對煤樣預處理產氣效果較好，并且加入順序對產氣總量影響不大，但先加入白腐菌比先加入綠孢鏈霉菌甲烷濃度高，J-B-H組的甲烷濃度最高，可達到51.36%，是原煤樣所產甲烷濃度的1.49倍。

2.2 Gompertz模型產氣擬合

Gompertz模型建立在特定生長率和種群密度之間的指數關系上，該模型被修改為用細菌生長期期間的指數生長率和滯后期 持續時間來描述細胞密度的函數[26]。

實驗采用改進Gompertz方程進行甲烷產生的模擬，對其產生的動力學作出評估。

y=ae-e[-k(x-xc)]

(1)

將實驗數據和擬合的R2值作為Gompertz方程的參數來源，見表5，擬合結果如圖5所示。

表5 Gompertz方程的參數

圖5 微生物預處理煤樣模擬累計產氣量

由表5和圖5可知，Gompertz方程的擬合度較高。相比于原煤樣Y-H，菌種預處理煤樣的最大產氣甲烷率都有不同程度的增加，J-L-H組增長29.35%，J-B-H組增長103.07%，L-B-H組增長50.77%，L-J-H組增長81.05%，B-J-H組增長64.80%，B-L-H組增長98.10%；菌種預處理煤樣的累計產氣潛力相比于原煤樣也有一定的增加，J-L-H組增長28.88%，J-B-H組增長86.85%，L-B-H組增長108.21%，L-J-H組增長73.19%，B-J-H組增長61.67%，B-L-H組增長132.40%。由此可知，菌種預處理對煤制生物氣的產生具有明顯的促進作用，可推斷煤樣經菌種預處理后，在生物產氣過程中將具有更大的最大甲烷產率和累計產氣潛力。

3 結 論

1)不同菌種兩兩組合按照不同順序進行預處理后，褐煤的產氣效果提高且各不相同，改進的Gompertz方程擬合發現，不同菌種預處理后的褐煤將具有更大產氣潛力。

2)不同類型的微生物對煤的降解機理不同，為掌握更多微生物降解轉化煤炭的機理和規律，需要對降解產物的組成、理化性質等特性進行更全面的研究。