AtRGS1胞吞動態調控G蛋白參與擬南芥生長發育和 抗性反應

古盼 齊學影 李莉 張曦 單曉昳，2

（1. 北京林業大學生物科學與技術學院，北京 100083；2. 清華大學生命科學學院，北京 100084）

異源三體G蛋白（heterotrimeric G protein）簡稱G蛋白，由Gα、Gβ和Gγ 3個亞基組成，是真核細胞中普遍存在的跨膜信號轉導分子［1］。動物細胞中有關G蛋白的研究較為深入，多種胞外信號分子激活不同的G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCR），進而通過G蛋白向下游效應因子傳遞信號，引發不同的細胞反應［2］。植物細胞中G蛋白組成及分子結構雖然與動物細胞相似，但通過與動物細胞不同的非典型信號轉導機制調控多種植物生長發育進程，并且在植物抵御多種非生物和生物脅迫過程中發揮重要作用［1］。本文綜述了擬南芥中G蛋白信號調節子AtRGS1（Arabidopsis regulator of G protein signaling 1）通過胞吞作用調控G蛋白參與的生長發育和抗性反應的分子細胞學機制研究進展。

1 植物細胞中異源三體G蛋白調控機制

1.1 植物細胞中異源三體G蛋白

自1990年起，相繼在模式植物擬南芥和水稻中克隆得到多個不同的G蛋白亞基。其中，擬南芥中具有1個Gα亞基AtGPA1（G protein alpha subunit 1）、1個Gβ亞 基 AGB1（GTP binding protein beta 1）、3個Gγ亞基 AGG1（G protein gamma subunit 1）、AGG2和AGG3，以及類似于Gα的3個大G蛋白XLG1（extra large G protein 1）、XLG2和XLG3［3-7］。 水稻中具有1個Gα亞基，1個Gβ亞基和5個Gγ亞基［8-10］。

目前，對模式植物擬南芥中異源三體G蛋白的分子結構了解比較清晰。擬南芥中的Gα亞基AtGPA1主要由螺旋結構域和Ras結構域組成，同時含有N端脂肪?；揎椢稽c、GTP結合與水解位點以及構象調節位點等［11］。XLGs蛋白含有N端的核定位信號和半胱氨酸富集結構域以及類似于Gα亞基的C端結構域，同樣具有結合和水解GTP的能力［7］。擬南芥中Gβ亞基AGB1的N端含有2個coil結構域，可以與Gγ亞基形成α螺旋相互纏繞的超二級結構［11］。Gα亞基可以單體形式存在，而Gβγ亞基通常以二聚體形式存在。Gα亞基和大G蛋白均可以與Gβγ二聚體發生相互作用形成異源三聚體。

以模式植物擬南芥和水稻為對象的研究表明，G蛋白不但調節種子萌發、幼苗生長、根系伸長以及花和果實發育等一系列植物營養生長和生殖生長過程，同時參與植物對干旱、鹽堿和臭氧等非生物脅迫以及細菌和真菌等生物脅迫的響應過程［1］。另外，G蛋白還作為重要的調節因子在多種植物激素（脫落酸、赤霉素、生長素、油菜素甾醇和茉莉素）信號轉導過程中發揮重要作用［1］。

1.2 植物細胞中RGS蛋白調控G蛋白活性

動物和真菌細胞中，7次跨膜受體蛋白GPCR負責調控G蛋白的活性［1］。GPCR主要由7個疏水肽段組成的跨膜α螺旋結構域組成，N端在細胞外，C端在細胞內，其中第5和第6個跨膜結構域之間的胞內環具有G蛋白結合位點。靜息狀態下，Gα亞基與GDP結合，并與Gβγ二聚體形成復合物，無法結合下游因子；外界信號刺激后，GPCR與相應配體結合，促進Gα亞基與GDP的解離及后續與GTP的結合。隨后Gα-GTP與Gβγ二聚體解離，二者分別與下游靶蛋白互作，激活G蛋白介導的信號傳遞。同時，與配體結合的GPCR可被G蛋白受體激酶GRKs（G-protein receptor kinases）磷酸化。磷酸化的GPCR被β-抑制素識別經網格蛋白介導的胞吞途徑進行胞吞。胞吞后的受體GPCR不再感知胞外信號，以避免細胞的過度反應。

迄今為止，植物細胞中尚未發現與動物和真菌細胞中GPCR結構和功能完全一致的G蛋白偶聯受體。2003年，Chen等［12］在模式植物擬南芥中鑒定出G蛋白信號調節子AtRGS1，也是擬南芥中唯一一個RGS蛋白。AtRGS1蛋白主要結構與GPCR的7次跨膜螺旋結構相似，但其C端在胞內多出一個RGS結構域，具有促進Gα亞基GTP水解的功能［12-13］。AtRGS1定位于細胞質膜上，負責響應不同胞外信號，調控G蛋白的活性，進而影響植物生長發育和抗性反應過程［1］。靜息狀態下，Gα亞基可在GDP結合模式和GTP結合模式間自由切換。其中，Gα-GDP為非活性模式，與Gβγ亞基結合形成復合物，而Gα-GTP與AtRGS1結合后，GTP可被催化水解為GDP。當外界信號存在時，AtRGS1蛋白通過胞吞作用與Gα亞基解離，從而解除對活性Gα-GTP的抑制作用，Gα-GTP和游離的Gβγ亞基均可向下游傳遞信號［1］。通過序列比對分析發現，雙子葉植物大豆和單子葉植物椰棗、云杉及卷柏中均存在RGS蛋白，但上述蛋白生物學功能研究尚不深入［1］。

2 植物細胞膜蛋白的胞吞調控

2.1 植物細胞膜蛋白的胞吞

細胞質膜是指圍繞在細胞最外層，由脂質、蛋白質和糖類等生物大分子組成的生物膜。細胞質膜不但維護細胞內微環境的相對穩定，并且介導細胞與外界環境間的物質、能量交換和信息傳遞。磷脂雙分子層是細胞質膜的骨架，為維持細胞質膜構象提供支撐。膜蛋白不僅是細胞質膜的重要結構組分，也是其生物學功能的主要承擔者［14］。根據功能特點不同，膜蛋白可分為通道及載體蛋白、受體蛋白、酶蛋白和結構支撐蛋白等，分別在物質跨膜轉運、信號感知和傳遞、能量代謝等方面發揮重要作用［15］。

膜蛋白一般在細胞質膜發揮作用，可通過胞吞胞吐循環調控其在質膜上的數量，以應答外界環境的刺激和自身生長發育階段的變化［16］。胞吞作用是指膜蛋白或胞外物質，通過質膜包裹并向內折疊凹陷形成胞內獨立囊泡，進而進行胞內轉運的一系列過程［17］。植物細胞膜蛋白胞吞后，首先轉運進入早期內含體（early endosome，EE），隨后發育成晚期內含體/多泡體（late endosome/multivesicular body，LE/MVB）（植物細胞中也稱為液泡前體prevacuolar compartment，PVC），進而轉運至液泡中降解從而抑制其生物學功能，或者暫存在內含體中，待需要時通過循環內含體（recycling endosome，RE）運回質膜重新發揮其膜上功能［18］。近期研究表明，少數植物膜蛋白胞吞后在內含體積累，起始信號轉導［19-20］。

植物細胞膜蛋白主要通過網格蛋白介導的胞吞途徑（clathrin-mediated endocytosis，CME）和膜筏微區介導的胞吞途徑（membrane microdomain-mediated endocytosis）2種方式進行胞吞［21-22］。其中，CME途徑在植物和動物細胞中高度保守，均需要網格蛋白（clathrin）和銜接蛋白（adaptor）復合體的參與［21］。AtFlot1（flotillin 1）參與了植物細胞中膜筏微區介導的胞吞途徑［23］。

2.2 磷酸化修飾調控植物細胞膜蛋白的胞吞

蛋白磷酸化修飾是指蛋白激酶將磷酸基團從ATP等轉移到底物蛋白絡氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基上的過程。細胞質膜蛋白的磷酸化修飾不但可以調節其三級結構、寡聚程度和生物學活性等，還可通過多種方式影響其胞吞循環：調控膜蛋白與胞吞復合體的互作直接影響其胞吞，或改變膜蛋白的構象間接影響其胞吞［24］。

定位于植物細胞質膜的多種通道或載體蛋白的磷酸化修飾參與調控其胞吞轉運。高鹽脅迫下，磷酸化的水通道蛋白PIP2；1（plasma membrane intrinsic protein 2；1）更多地駐留在質膜上，胞吞程度明顯下降［25］。低濃度硝酸根環境中，AtNRT1.1（nitrate transporter 1.1）發生磷酸化修飾，少量經CME途徑進行胞吞，大部分駐留在細胞質膜上；高濃度硝酸根環境中，AtNRT1.1蛋白維持去磷酸化狀態，大部分通過CME和膜筏微區介導的途徑胞吞，并直接通過LE/MVB進入液泡降解，少量駐留在細胞質膜上［20］。磷酸化的生長素輸出載體蛋白PIN（PIN-formed）與GNOM介導的向基循環途徑的親和性下降，從而更多地通過向頂循環途徑招募回質膜頂部［24］。定位于細胞質膜的多種受體激酶，如細菌鞭毛蛋白flg22受體FLS2（flagellin sensing 2）、真菌細胞壁組分幾丁質Chitin受體LYK5（lysin motifcontaining receptor like kinase 5）和藍光受體Phot1（phototropin 1）等的磷酸化修飾均會促進上述受體經相應配體處理后的誘導型胞吞，但是與下游信號轉導的關系仍需進一步明確［26-27］。

3 AtRGS1胞吞動態調控G蛋白參與的植物生長發育和抗性反應

當擬南芥細胞受到外界信號（葡萄糖、flg22、茉莉素和NaCl等）刺激時，AtRGS1胞吞進入細胞，解除其對下游G蛋白的抑制作用，游離的Gα-GTP、Gβγ亞基和定位于內含體的AtRGS1蛋白均可能調控相應的信號轉導，進而影響生長發育進程和抗性反應。磷酸化修飾在多種信號誘導AtRGS1胞吞過程中發揮重要調控作用，目前，已鑒定多個參與磷酸化過程的蛋白激酶并明確其催化位點。

3.1 AtRGS1蛋白胞吞參與調控擬南芥中葡萄糖信號轉導

植物細胞通過光合作用產生葡萄糖分子，不但為生命活動提供物質基礎和能量來源，還可轉運至胞外作為信號分子調控植物生長發育的各個過程。低濃度葡萄糖可促進植物的生長；高濃度葡萄糖則抑制種子的萌發和幼苗的早期發育，主要表現為胚后葉片缺失，主根變短，葉綠素缺乏和花色素苷積累等表型。正常糖濃度生長條件下，Gα亞基AtGPA1突變體gpa1暗中下胚軸生長和光下主根生長均受到抑制，而AtRGS1突變體表型與之相反，說明AtRGS1可能拮抗G蛋白的激活［12，28］。高濃度葡萄糖生長條件下，Gα亞基和Gβ亞基的突變均會導致對葡萄糖超敏的表型，例如種子萌發率更低，幼苗生長受抑制程度更高，而突變體rgs1-2表型與之相反，說明AtRGS1與G蛋白調控高濃度葡萄糖信號轉導的機制截然不同［29］。

擬南芥中，不同濃度葡萄糖調控AtRGS1蛋白胞吞的分子機制不盡相同。葡萄糖特異性地以濃度和時間交互作用方式誘導AtRGS1蛋白的胞吞。2%葡萄糖處理3 d后，AtRGS1的胞吞程度達到60%，4 d后接近峰值70%；而6%葡萄糖處理30 min后，AtRGS1的胞吞程度即達到90%［19，30］。WNK（with no lysine kinases）家族的3個蛋白激酶AtWNK1、AtWNK8和AtWNK10在葡萄糖誘導的AtRGS1胞吞中發揮關鍵調控作用，其中AtWNK8和AtWNK10響應高濃度葡萄糖信號，而AtWNK1響應低濃度葡萄糖信號［31］。

高濃度葡萄糖處理后，處于游離狀態的Gβγ二聚體將蛋白激酶AtWNK8和AtWNK10快速招募到細胞質膜（10 min以內），促進其與AtRGS1的互作，催化AtRGS1蛋白C末端Ser428、Ser435和Ser436等多個絲氨酸位點的磷酸化［19］（圖1-A）。磷酸化的AtRGS1蛋白胞吞進入細胞，游離的Gα-GTP單體及Gβγ二聚體均可能向下游傳遞信號［19］（圖1-A）。突變體wnk8-2和wnk8-2/wnk10-1經高濃度葡萄糖處理后TBL26（Trichome birefringence-like 26）的誘導表達受到抑制，同時幼苗生長受抑制的表型得到一定程度的緩解；而AtWNK8超表達植株生長受抑制程度更為嚴重，其超敏表型與Gα和Gβ亞基突變體一致，與AtRGS1突變體相反，說明胞吞進入細胞的AtRGS1也可能參與促進高濃度葡萄糖信號轉導［19］（圖1-A）。

低濃度葡萄糖處理較長時間后（如2%葡萄糖5 h），蛋白激酶AtWNK1才會與AtRGS1互作并催化其磷酸化［31］（圖1-A）。磷酸化的AtRGS1蛋白同樣胞吞進入細胞，解除對G蛋白信號傳遞的抑制作用［31］（圖1-A）。黑暗生長的突變體wnk1-1在低糖處理條件下下胚軸伸長明顯變短，與Gα亞基AtGPA1突變體趨勢一致，而與AtRGS1突變體相反，說明AtRGS1胞吞后游離的G蛋白可能參與促進低濃度葡萄糖信號的轉導［12，31］（圖1-A）。

圖1 AtRGS1調控G蛋白參與的植物生長發育和抗性反應Fig. 1 AtRGS1 is involved in G-protein-mediated plant development and stress responses

3.2 AtRGS1蛋白胞吞參與調控擬南芥中flg22信號轉導

為了抵御病原菌的侵害，植物進化出病原菌保守相關分子模式觸發的免疫反應（PAMP-triggered immunity，PTI）和病原菌效應因子觸發的免疫反應（effector-triggered immunity，ETI）2個層次的先天免疫系統反應［32］。在PTI反應中，病原菌表面的病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）可被定位于細胞質膜上的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別，并通過下游信號轉導引發植物的防御反應。

細菌鞭毛蛋白N端22個氨基酸的保守域（flg22）是目前研究最為深入的PAMP之一。靜息（未受外界信號刺激）狀態下，受體激酶FLS2與胞質類受體激酶BSK1（BR signaling kinase 1）和BIK1（Botrytisinduced kinase 1）形成復合體，共受體激酶BAK1（brassinosteroid associated kinase 1）被與其互作的BIR1（BAK1 interaction receptor like kinases 1）抑制活性［33］。植物細胞感知flg22后，BIR1與BAK1解離，受體FLS2得以與共受體BAK1互作并相互磷酸化；BSK1和BIK1也被磷酸化并與FLS2解離［33］。BSK1通過磷酸化將蛋白激酶MAPKKK5（MAP kinase kinase kinase 5）激活啟動PTI反應，BIK1通過磷酸化NADPH氧化酶RbohD（respiratory burst oxidase homolog D）調節ROS的迸發［33］。

擬南芥G蛋白是flg22信號轉導中的正調控因子。Gα亞基的突變體gpa1-4中flg22誘導的活性氧ROS迸發以及對細菌Psm ES4326的抗性均受到抑制；Gβ亞基突變體agb1中NADPH氧化酶RbohD的磷酸化受到影響進而減弱了ROS的迸發，從而導致對細菌Pst DC3000的超敏表型［34-35］。AtRGS1通過flg22誘導的胞吞調控G蛋白參與到PTI反應中（圖1-B）。靜息狀態下，AtRGS1、異源三體G蛋白和BAK1形成復合物，BIR1也與AtRGS1發生互作［34，36］。此時，BAK1通過其本底激酶活性催化AtGPA1 Thr19位點發生磷酸化［35］。Flg22誘導后，AtRGS1蛋白與BIR1解離，其C端被活化的BAK1催化發生磷酸化修飾，促進其胞吞［34，36］。與此同時，AtGPA1蛋白的Thr19位點發生去磷酸化，而其他絲氨酸或蘇氨酸位點被BAK1激酶磷酸化，促進其與AtRGS1蛋白的解離［35］。游離的AtGPA1-GTP和Gβγ二聚體可參與調控鈣離子內流和ROS迸發等PTI反應。

除了典型的異源三體G蛋白外，擬南芥中非典型的大G蛋白XLG2和XLG3也參與調控flg22誘導的PTI反應。單突變體xlg2和雙突變體xlg2xlg3中flg22誘導的H2O2的產生以及對細菌Pst DC3000的抗性相較于野生型植株均有不同程度的減弱，而單突變體xlg3的表型則與野生型植株相似，說明XLG2蛋白在其中發揮主要作用［37-38］。AtRGS1蛋白同樣參與調控大G蛋白介導的PTI反應。靜息狀態下，受體FLS2直接與AtRGS1互作，將XLG2蛋白維持在與GDP結合的非活性狀態［37-38］。受到flg22刺激后，FLS2與BAK1發生二聚化和互磷酸化，緊接著磷酸化BIK1蛋白?；罨腂IK1催化AtRGS1蛋白C端的Ser431和Ser428殘基磷酸化，同時催化XLG2蛋白N端的S148和S150殘基磷酸化，導致FLS2、AtRGS1與XLG2蛋白復合體的解體，其中是否涉及AtRGS1的胞吞尚未見明確報道［37-38］。磷酸化的XLG2最終在葉肉細胞中調控免疫反應。

3.3 AtRGS1蛋白胞吞參與調控擬南芥中茉莉素信號轉導

茉莉素（jasmonate，JA）是一類重要植物激素，包括茉莉酸及其環戊酮衍生物等具有相似活性的化合物。JA不但調控植物種子萌發、根系發育、雄性育性和葉片衰老等多個生長發育進程，還參與植物對腐生型真菌和昆蟲的抗性反應。異源三體G蛋白作為正調控因子參與JA信號轉導。與野生型植株相比，擬南芥Gα亞基突變體gpa1-4、Gβ亞基突變體agb1-2和雙突變體gpa1-4/agb1-2對JA抑制的主根伸長、JA誘導的花色素苷積累和抗性基因表達等多方面均呈現不同程度的低敏感性［39］。

AtRGS1的胞吞受到茉莉素的調控，從而影響G蛋白參與的茉莉素信號轉導［39］（圖1-C）。靜息狀態下，AtRGS1與AtGPA1互作抑制其活性；外源活性茉莉素分子茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）以磷酸化和C端依賴的方式誘導AtRGS1的胞吞，其在膜上的駐留時間顯著縮短。AtRGS1的胞吞促進其與AtGPA1的解離，游離的Gα亞基和Gβ亞基參與激活JA信號下游分子；而AtRGS1胞吞后并未發生明顯降解，可能后續會循環上膜繼續發揮功能。另外，MeJA處理可促進AtRGS1在膜上運動速率的提高，可能有助于其胞吞［39］。

3.4 AtRGS1蛋白胞吞參與調控擬南芥中鹽信號 轉導

土壤鹽漬化可對植物造成離子脅迫、滲透脅迫和氧化脅迫等多種傷害，是影響植物生長和作物產量的主要環境因子之一。NaCl是鹽堿土壤中最易溶、分布最廣、含量最豐富的鹽。中等鹽濃度條件下（50 mmol/L NaCl），擬南芥生長已經受到嚴重影響，表現為地上部分生長受抑制，葉片加速衰老等表型［40］。較高鹽濃度環境中（125 mmol/L NaCl），表現為幼苗生長完全受抑制，子葉花色素苷積累嚴重，無真葉萌出［40］。

Gα亞基AtGPA1和Gβ亞基AGB1分別作為細胞增殖促進因子和內質網脅迫釋放因子正調控植物對鹽脅迫的抗性［40］。與野生型植株相比，Gβ亞基突變體agb1-2在NaCl脅迫下幼苗更小，褪綠癥狀更顯著［40］。AGB1蛋白的W109和S129殘基突變后，Gα亞基與Gβγ二聚體的互作受到影響，但并不破壞其細胞膜定位，由此達到持續性激活Gα亞基和Gβγ二聚體的效果。在abg1-2突變體中表達AGB1W109A或AGB1S129A均可回補突變體鹽敏感的表型［40］。相反，Gα亞基突變體gpa1-4生長受抑制的程度明顯弱于Col-0［40］。這是由于即使AtGPA1缺失影響了植物細胞的增殖能力，卻可使膜上游離的Gβγ二聚體數量增多，通過內質網脅迫誘導的未折疊蛋白質反應（unfolded protein response，UPR），一定程度提高了植物的耐鹽性。

高濃度NaCl脅迫下，AtRGS1蛋白突變體rgs1-2存活程度顯著高于野生型植株和gpa1-4突變體，而rgs1-2agb1-2雙突表現出與agb1-2類似的超敏表型［40］。因此，AtRGS1作為上游負調控因子影響G蛋白的抗鹽活性。Na+可以特異性地誘導AtRGS1蛋白的胞吞，進而解除對G蛋白的抑制作用，激活其抗鹽能力［40］（圖1-D）。隨著NaCl處理濃度的提高，AtRGS1蛋白的胞吞程度隨之提升，即使添加蛋白合成抑制劑CHX（cycloheximide）處理也不會影響胞吞程度的變化；而KCl處理對AtRGS1蛋白的胞吞沒有顯著影響［40］。

4 總結與展望

近年來，綜合分子遺傳學和植物生理學等技術手段，對模式植物擬南芥和水稻中G蛋白生物學功能進行了較為深入和廣泛的研究。結果表明，G蛋白參與植物營養生長和生殖生長、激素和糖信號轉導以及抗性反應等一系列重要生物學過程。作為關鍵的G蛋白信號調節因子，定位于細胞質膜AtRGS1蛋白通過胞吞調控G蛋白的活性。葡萄糖、flg22、茉莉素和NaCl等多種外界信號誘導AtRGS1蛋白的胞吞，進而促進其與Gα亞基的解離。游離的Gα-GTP、Gβγ亞基和定位于內含體的AtRGS1蛋白均可能調控下游信號轉導，影響相應生物學過程。但是，目前對茉莉素和NaCl誘導AtRGS1蛋白胞吞的調控機制尚不完全清晰。例如，茉莉素誘導的AtRGS1胞吞中，哪些蛋白激酶催化AtRGS1的磷酸化？其磷酸化位點又是什么？NaCl誘導的AtRGS1胞吞與G蛋白信號激活的具體調控關系是什么？上述機理仍有待于進一步解析。

除上述生物學過程外，AtRGS1還參與脫落酸（abscisic acid，ABA）介導的信號轉導和干旱響應過程。ABA是一個 15 碳的倍半萜烯化合物，主要參與調節種子休眠和萌發、幼苗的生長和根系形態建成等生長發育過程，同時也調控保衛細胞運動從而影響植株的抗旱性。與野生型植株相比，外源ABA處理后AtRGS1超表達植株的種子萌發、子葉打開和變綠以及主根伸長等過程均受到顯著抑制，而AtRGS1突變體rgs1-2植株種子的萌發率則略高于野生型植株［41-42］。同時，AtRGS1超表達植株耐旱性更強，干旱脅迫條件下氣孔開度相對較小而干旱復水處理后存活率相對較高［41］。位于AtRGS1下游的G蛋白，在ABA抑制的種子萌發、幼苗生長和側根形成等過程中發揮負調控作用，而在ABA介導的保衛細胞運動過程中發揮正調控作用［1］。在上述生物學過程中，AtRGS1是否也通過胞吞調控G蛋白參與的ABA信號轉導？如果答案是肯定的，磷酸化修飾是否同樣影響ABA或干旱處理后的AtRGS1的胞吞？上述科學問題也有待于進一步研究。

除擬南芥中的AtRGS1外，豆科植物中RGS蛋白調控G蛋白參與的結瘤過程，但并不發生亞細胞定位的變化，而是經磷酸化修飾后駐留在細胞膜上發揮作用［43］。因此，針對其他物種特異性的生物學功能，RGS蛋白可能存在與擬南芥中AtRGS1不同的G蛋白調控機制。其他物種中RGS蛋白如何調控G蛋白活性？相同生物學功能的調控機制在不同物種中是否相對保守？物種特異性生物學功能的調控機制是否與擬南芥和水稻等模式植物存在差異？上述一系列問題研究還有待于在不同物種中更加廣泛地分析。對這些重要科學問題的探索，將使人們對RGS蛋白調控G蛋白的分子細胞學機制有更加全面和深入的認識，為理解植物G蛋白活性調節機制提供理論參考。