ABC轉運蛋白結構及其在細菌致病性中的研究進展

陳福暖 黃瑜 蔡佳 王忠良 簡紀常 王蓓

（廣東海洋大學水產學院 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室 廣東省水產經濟動物病害控制重點實驗室，湛江 524088）

ABC轉運蛋白超家族是一個古老的膜蛋白家族，細胞膜作為細胞質與外界環境的結構性屏障，細胞實現內外的物質交流一般是由細胞膜上的蛋白來決定的。其中主要包括兩種方式：（1）以離子通道及協助擴散的被動運輸方式使得底物溶質順著濃度梯度進行跨膜運輸；（2）以消耗能量的主動運輸方式進行底物溶質逆濃度梯度進行跨膜運輸?，F有研究證據表明，ABC轉運蛋白長期演變過程中進化出多種主動運輸模式，跨膜轉運多種底物以滿足物種不同的生理需求［1-2］。典型的ABC轉運蛋白是一種單向底物轉運體，可以通過結合ATP水解產生的能量來實現對各類底物分子的跨膜轉運，包括某些金屬離子、糖類、氨基酸、多肽、蛋白質、細菌分泌物及代謝產物和抗生素類藥物等。根據底物分子運輸方向，ABC 轉運蛋白可分為內向轉運蛋白和外向轉運蛋白兩類。ABC轉運蛋白通常由跨膜結構域（transmembrane binding domain，TMD）和核苷酸結合結構域（nucleotide binding domains，NBD）組成。TMD 作用是形成識別并介導底物穿過細胞膜機械性通道，NBD 則是作用于ATP的結合和水解。

早期對ABC 轉運蛋白研究表明，在細胞中ABC 轉運蛋白對有毒物質的耐受性和抵抗力方面起著關鍵作用，可以將有毒疏水性化合物隔離到特定的細胞器中，也可以引導它們分泌到細胞質中，而后經主動運輸排出體外［3］。正是由于需要運輸底物多樣性促使ABC轉運蛋白參與細胞的多種生理過程，迄今為止，已知人類的ABC家族相關蛋白變異可以引起多種疾病，如冠心病、慢性特發性黃疸、腎上腺腦白質失養癥、肺癌、免疫缺陷病、囊性纖維病、脂質代謝及免疫缺陷病等［4］；ABC 家族蛋白中的多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance，MDR1）的過量表達使得腫瘤細胞對部分化療藥物表現出較高的耐藥性；在細菌中，ABC 超家族則參與細菌生長各階段的營養物質的攝取、代謝產物與細菌毒性化合物的排出、細菌生物被膜的形成［5-6］。本綜述擬從ABC轉運體的結構、作用機制、細菌耐藥性及其在致病性中的作用等幾個方面來介紹ABC轉運蛋白的轉運機制及相應功能。

1 ABC轉運蛋白的結構

ABC 轉運蛋白核心結構由2個跨膜結合區和2個核苷酸結合區組成［7］。它們是通過形成同質或異質二聚體復合物來結合和水解ATP的一類轉運蛋白。目前為止，大腸桿菌（Escherichia coli）MsbA、BtuCD 及霍亂弧菌（Vibrio cholerae）MsbA轉運體NBD 和TMD 晶體結構已經被成功解析［8］，其作用方式為位于脂質雙分子層的TMD通過在細胞膜內形成識別并介導底物穿過細胞膜機械性通道；NBD則位于細胞質內，具有ATP結合位點，通過結合ATP水解產生的能量改變NBD蛋白的構象，二者相互協調以此完成對底物分子跨膜轉運。從結構與功能來看，NBD與TMD共同組成ABC轉運蛋白的核心部分，共同發揮ABC轉運蛋白轉運底物的功能。除此以外，有些亞家族比如CUTI（carbohydrate uptake transporter 1）和MOT1（modifier of Transcription 1），存在2個C端附加結構域，可能與NBDs二聚體的形態相關聯。

1.1 核苷酸結合域

NBD通常由200-300個氨基酸組成，包括兩個部分：Rec A-like亞結構域和螺旋亞結構域［9］。螺旋亞結構域是ABC轉運蛋白所特有的，與ATP水解偶聯底物跨膜轉運相關。所有ABC轉運體在NBD內有一個長約200個氨基酸的高度保守的片段（表1），包含3個模體（motif），分別是位于RecA-like亞結構域的WalkerA（GXXGXGKS/T，X代表氨基酸）、Walker B（ΦΦΦΦD，Φ代表疏水氨基酸殘基）和Walker C即信號基序（signature motif）（LSGGQ），Walker C是ABC轉運蛋白的特征性模體，比如ArsA轉運蛋白參與砷酸鹽的轉運，其ATP結合結構域僅具有Walker A和Walker B模體，但是沒有Walker C，因此不屬于ABC轉運蛋白家族成員［4］。

表1 核苷酸結合結構域保守基序的功能Table 1 Functions of conserved motifs in the nucleotide-binding domain

NBD中存在著幾個環（loop）區，其中Q-環與ATP的γ磷酸基團結合，連接Rec A-like亞結構域和螺旋亞結構域，可調節NBD和TMD之間的相互作用［10］；D-環則通過改變構象控制ATP水解，依托NBDs結構域實現細胞間信息的傳遞；H-環則在催化過程中形成一個活性的中心，連接水解過程中所需要的小分子以此加快催化水解ATP［11-13］。這些保守的基序在折疊的NBDs中聚集在一起形成ATP結合位點，并在ATP結合和水解以及能量傳遞中發揮重要作用［14］（圖1）。如Walker B基序的谷氨酸殘基催化ATP水解［15］。此外，最近研究表明，X-環僅存在于外向轉運蛋白中，位于TM螺旋亞結構域中的信號基序之前，在Sav1866中定義為TEVGERG序列［16］。

圖1 NBD二聚體結構示意圖（Orelle）Fig. 1 Schematic diagram of NBD dimer structure （Orelle）

1.2 跨膜結構域

相對于NBD，TMD保守性較差，這與TMD參與不同底物識別與轉移的功能有關［17］。對于ABC家 族蛋白的單個TMD一般由6個TM（transmembrane）螺旋構成，但也存在由多個TM螺旋構成，如大腸桿菌的藥物外向轉運蛋白Ydd A由5個TM螺旋構成［18］。在ABC外向轉運蛋白中，兩個TMD結構域形成一個二聚體結構，包含12個跨膜的TM螺旋；ABC內向轉運蛋白中則具有 10-20個TM螺旋。ABC外向轉運蛋白的TMDs具有兩個分別位于細胞外和細胞基質的環狀結構。在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ABC外向轉運蛋白Sav1866中，TMD 延伸到膜邊界外，其偶聯螺旋環ICL1（intracellular loops）向細胞質中突出約25?，在細胞質基質內的偶聯螺旋形成的環（ICL1和ICL2）與單個或兩個NBD結合形成NBD-TMD界面，并以此從NBD傳遞信息給TMD［19-20］。Q-環提供了與偶聯螺旋相互作用的氨基酸殘基［21］，同時有一個保守的位于X-環谷氨酸鹽可以與兩個偶聯螺旋結合，在NBDs與TMDs的相互作用中起重要作用［22］。隨著人們對這一大蛋白質家族結構和功能的認識，觀察到4個類型ABC轉運蛋白的3D結構［23］（圖2），產生了外向轉運蛋白以及I型和II型內向轉運蛋白分類［24-25］。近年來，又發現了一種結構上不同的蛋白質，存在于古細菌和細菌中的能量耦合因子（ECF）轉運蛋白［26-27］，被稱為III型內向轉運蛋白。

圖2 ABC轉運體結構（Locher）Fig. 2 Structure of ABC transporter（Locher）

2 ABC 轉運蛋白的作用機制

原核和真核生物ABC轉運蛋白結構的NBD保守性較高及其在結構功能方面的表現出的相似性，ABC轉運蛋白在不同物種中發揮的作用也應具有一定的相似性。ABC轉運蛋白中的外向轉運蛋白存在于所有生物體內，而內向轉運蛋白僅存在于細菌和植物中［28-29］。外向轉運蛋白的轉運過程是在胞內的底物分子直接與TMD結合啟動整個轉運過程，而內向轉運蛋白則是外周蛋白捕獲識別底物，進而形成底物-外周蛋白復合體，然后呈遞給TMD轉運蛋白結合形成SBP-TMD結構，處于外周蛋白中底物分子脫落通過TMD結構進入胞內。在細菌中，內向轉運蛋白就這種底物結合蛋白（substrate-binding protein，SBP）先與底物結合，隨后與TMD轉運蛋白結合，從而完成底物轉運過程。本節擬從ATP水解偶聯機制及轉運機制來介紹ABC 轉運蛋白的作用機制。

2.1 ATP水解偶聯機制

所有ABC蛋白通過NBD水解ATP為底物運輸提供能量，盡管介導的生理作用各不相同，但NBD的結構卻是高度保守的［30］。NBDs以二聚體形式頭尾相接聚集并于Walker C與另一個NBD上的Walker A之間結合ATP成三明治結構進而水解ATP（圖1）。NBD二聚體的聚合與ATP水解之間的這種關系是所有ABC蛋白中共有的保守特征，ABC轉運體也可以通過利用ATP以外的核苷酸來驅動轉運。多項研究表明，CTP、GTP和UTP與ATP的親和力非常相似，如鼠傷寒沙門氏菌麥芽糖轉運體MalK也可利用GTP和CTP作為能源物質，其中對GTP的親和力幾乎與ATP相同［31-33］。對于細胞內普遍核苷酸的濃度含量高，這一點值得重視。

對于外向運輸的ABC 轉運蛋白底物轉運，膜內側底物可被較高親和力的結合位點識別并結合；而構象變化后，結合位點親和力降低以至底物釋放到胞外。ABC轉運體的晶體結構為解析ATP水解耦合機制提供了依據。耦合過程需要利用底物并通過TM螺旋與NBDs的形成的溝槽相互作用將信號從NBDs傳輸到TMDs。已有研究表明，在未探明晶體結構的ABC轉運體中也存在類似的耦合界面［34］。ABC轉運體耦合螺旋與已知高分辨率結構的序列比對表明，耦合螺旋是一個功能上相似的基序但其序列并不保守的，這種現象解釋為耦合螺旋與ABC轉運體中的NBD的相互作用依賴于特定的側鏈接觸。

2.2 ABC轉運蛋白轉運機制

基于目前已經解析晶體結構的ABC轉運蛋白可見，SBP與TMD，TMD之間是通過改變構象來完成對底物攝取、傳輸和釋放［21］（圖3）。在不同的轉運階段，兩個NBD的結合狀態與開口方向是動態變化的，NBD通過控制TMD形成的通道來調節膜內外的開放，偶聯ATP的水解產生能量對底物進行轉運［23］。ABC內向轉運蛋白轉運過程是：兩個TMD形成一個親水性的底物分子通道，當內向轉運蛋白處于靜息狀態時，靠近外周質且開口向外的通道處于開放狀態，而朝向胞質面的通道則處于關閉狀態；當膜外結合蛋白結合底物轉運時，需要與底物結合蛋白（substrate binding protein，SBP）形成復合體，將底物分子傳遞到TMD形成SBP-TMD結構，并通過TMD將信號傳遞到NBD，NBD則激活啟動結合ATP水解，隨后NBD的構象發生改變形成SBPTMD-NBD結構，底物進入通道后最終被送到胞內。然而ABC外向轉運蛋白則從胞內把底物，如代謝產物、細菌毒性化合物及藥物轉運到胞外。雖然已經報道了一些高分辨率結構，但還沒有為ABC外向轉運蛋白建立明確的共同的機制。其一，大多數結構因其疏水性以及低親和力結合而不能揭示結合確切的底物分子。其二，當從膜上去除ATP等能源物質時，ABC外向轉運蛋白NBDs顯現開口向內的構象［35］。

圖3 ABC轉運體功能示意圖（Locher）Fig. 3 Schematic diagram of ABC transporter function（Locher）

3 細菌多藥ABC轉運體類別與功能

在細菌中存在多種藥物轉運能力的ABC轉運蛋白，由于其功能具有重疊性，因此不易確定具體的ABC轉運蛋白，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌可能攜帶多達30個藥物外向轉運蛋白［14，36-37］。除此之外，一些ABC轉運體通常與雙組分調節系統相關，使其對抗菌肽產生耐藥性［38］。目前，對于確定多藥ABC轉運體的方法有3種：基因敲除、細菌分離培養以及大腸桿菌過表達轉運蛋白。以下對于已確定多藥ABC轉運蛋白結構特點進行介紹。

3.1 具有相同NBD轉運體/同源二聚體的ABC轉運蛋白

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）中發現第一個同源二聚體多藥ABC轉運蛋白LmrA［39］。通過在大腸桿菌過表達lmrA的藥敏實驗中，LmrA的過表達導致了對多種的藥物產生耐藥性［40］，如乙啡啶、羅丹明、道諾霉素和TPP+等，此外，道諾霉素在倒置膜泡中的積累依賴于ATP水解，并受到藥物流出泵抑制劑利血平的抑制。此外對與LmrA的具有高度同源性的枯草芽孢桿菌的一個膜蛋白BrmA進行了研究，同樣證明其運輸多種藥物的能力，如阿霉素和7-氨基放線菌素D，還有來自大腸桿菌的MacAB/TolC、波賽鏈霉菌（Streptomyces peucetius）的DrrAB［41-44］。

3.2 具有非對稱NBD的轉運體/異源二聚體ABC轉運蛋白

非對稱的NBD的多藥轉運體形成的主要原因是NBD的信號基序中的一些殘基被其他殘基取代。乳酸乳球菌中主要的多藥耐藥轉運蛋白LmrCD，其表達受到名為LmrR的轉錄抑制因子的控制［45-46］，藥物結合LmrR降低其對LmrCD啟動子的親和力，從而誘導轉運子的表達，BmrCD是枯草芽孢桿菌轉運蛋白，抗生素靶向蛋白合成通過核糖體介導的轉錄衰減機制誘導其表達［47］。在大腸桿菌細胞膜中過表達時，BmrCD可轉運多種藥物，如阿霉素或米托蒽醌等，PatAB在肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）多藥耐藥中的意義首次得到證實，其基因失活增加了細菌對幾種藥物的敏感性：溴化乙硫、小檗堿、吖啶黃和諾氟沙星［48］。將實驗室所培育的菌株暴露于環丙沙星后，分離出一株多藥耐藥菌株，發現其PatA和PatB基因表達上調［49］。對大腸桿菌中過表達轉運蛋白的研究表明，只有異源二聚體具有藥物外排的功能，PatAB強烈傾向于將GTP作為能量來源來外排藥物，特別是在37℃時［50］。

4 細菌致病過程中ABC轉運蛋白發揮的的相應功能

4.1 外向轉運蛋白與細菌致病性的聯系

外向轉運蛋白是ABC轉運蛋白家族中普遍存在的一個分支，其存在于幾乎所有生命體中。目前原核生物中已確認的外向轉運蛋白亞族有40種，這些蛋白密切參與生物合成途徑［51］（圖4），如禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）ABC轉運FgArb1通過調控病原菌對氧化和細胞壁脅迫的響應、DON毒素的合成，從而調控病菌在寄主組織中的侵染生長，現有研究表明對FgArb1進行基因敲除發現禾谷鐮刀菌突變體完全喪失致病性［52］；通過對變形假單胞桿菌（Pseudomonas plecoglossicida）ABC轉運蛋白基因進行穩定沉默后侵染斜帶石斑魚轉錄組分析，病原菌的大量差異基因集中在新陳代謝的過程中，證明ABC轉運蛋白確實起著重要的轉運物質功能［53］；同時參與糖綴合物的合成、磷壁酸、蛋白質分泌以及細胞表面蛋白等［12，54-55］。

圖4 革蘭氏陰性細胞中ABC轉運蛋白參與細菌致病性的作用（Victoria）Fig. 4 Roles associated with ABC transporters involved in bacterial pathogenicity in a model Gram-negative cell（Victoria）

4.1.1 糖綴合物的合成 原核生物有3種細胞表面糖綴合生物合成途徑，根據其內膜運輸機制分為Wzx/Wzy依賴途徑、ABC轉運體依賴途徑和合酶依賴途徑。ABC轉運蛋白依賴途徑介導了所有主要類型的細胞表面糖綴合物的糖鏈的轉運，包括糖蛋白、磷壁酸、莢膜多糖（CPS），這些糖綴合物在細胞內膜以糖基轉移的方式完成聚合；然后，ABC轉運蛋白以ATP依賴的方式將完整的糖綴合物轉運到膜外。目前在大腸桿菌和流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）中CPS生物合成的研究中，ABC外向轉運蛋白參與了多聚糖外排［56-57］。向外分泌的多糖如O抗原、磷壁酸、CPS和EPS（Exopolysaccharide）都在致病菌的毒力中發揮重要作用，它們在細胞信號傳遞、生物被膜形成和逃避宿主免疫應答方面發揮著多種作用。

4.1.2 磷壁酸 在革蘭氏陽性菌中，肽聚糖是細胞壁中重要組成部分，其周圍密布著磷壁酸，磷壁酸通過ABC轉運蛋白分泌到細胞表面，并以共價鍵的方式連接在肽聚糖中［12］。對于ABC轉運蛋白對磷壁酸的轉運，在枯草芽孢桿菌［58］和金黃色葡萄球菌［59］中被證明對細菌生存至關重要。磷壁酸在幾種致病菌中是一種非蛋白黏附素毒力因子，在金黃色葡萄球菌中磷壁酸有助于其在宿主細胞內黏附與定植，最顯著的是在宿主定植過程中對人類上皮細胞和內皮細胞的黏附，如在條件致病性的表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）中，磷壁酸與纖維蛋白黏附有關［60-61］，然而，尚未確定表皮葡萄球菌的磷壁酸分泌系統。

4.1.3 蛋白分泌 原核生物蛋白分泌主要通過II型分泌系統，但同時也存在I型、III型和VI型分泌系統［62-63］。其中I型分泌途徑是依賴ABC轉運體的機制。迄今為止，超過25個ABC外向轉運蛋白家族（TCIDs：3.A.1.109-113，116，118，119，123，124，126-134）已被證實與I型蛋白分泌功能有關，它們分別對毒素、抗菌肽、鐵載體蛋白、水解酶和細胞表面蛋白等均有轉運功能。許多分泌蛋白在入侵或定植方面發揮作用，而抗菌肽在與其他細菌競爭中發揮作用，但目前研究中，此類蛋白分泌與它們的毒力的強弱沒有直接關系。

4.1.4 細胞表面蛋白 細胞表面蛋白在蛋白質水解、肽聚糖分解代謝、黏附和免疫逃避中發揮重要作用［64］。其通常由單一蛋白或糖蛋白組成。大多數細菌的細胞表面蛋白是通過II型分泌途徑輸出的，但也發現了許有3種I型分泌細菌表面蛋白：Crs、CsxA和CsxB［65］。這些蛋白是毒力因子，與逃避宿主防御有關，如血清的吞噬和殺菌活性［66］。

4.1.5 毒素 最典型的I型分泌系統屬于RTX（repeats-in-toxin）蛋白家族，位于蛋白質羧基末端區域富含重復的甘氨酸和天冬氨酸形成鈣離子結合位點，蛋白家族成員大小從40-600 kD不等［67］。同時RTX毒素是一種I型分泌系統依賴性分泌蛋白，并且廣泛存在于多種革蘭氏陰性哺乳動物病原體中［68］，如尿道致病性大腸桿菌α-hemolysin（Hly）分泌系統中的HlyA，hlyCABD操縱子編碼 I 型分泌系統和 HlyA 合成所需的基因，而其所在的Hly轉運子屬于ABC轉運蛋白，由HlyB、HlyD、TolC組成，HlyC則是參與HlyA成熟的?；D移酶。在細胞內HlyA觸發HlyB與HlyD相互作用在細胞膜上形成TMD-NAD通道，由TolC呈遞到胞外，并通過自身空間折疊形成具有生物活性的毒素，以單體的形式嵌入細胞膜靶位形成親水孔道，將細胞內K+和細胞外Ca+交換導致溶血，進而感染尿道，出現急性膀胱炎和腎盂腎炎，病情嚴重者可導致溶血性尿毒癥發生［12，69］。

4.2 內向轉運蛋白與細菌致病性的聯系

ABC內向轉運蛋白有助于從細菌從外環境中獲得必需物質，這類ABC轉運蛋白在原核生物、古細菌和植物中被發現，但在真核生物中卻不存在。ABC內向轉運蛋白根據結構特征被進一步細分為兩類，I型內向轉運蛋白和II型內向轉運蛋白［21］。I型內向轉運蛋白與小分子運輸有關，如離子和氨基酸，在每個TMD亞基中有5-8個TM螺旋。II型內向轉運蛋白與大分子運輸有關，如金屬螯合物和維生素，并且在每個TMD亞基中有10個TM螺旋［70］?，F有研究表明，結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）ABC內向轉運蛋白LpqY/SugABC，轉運二糖及海藻糖與細菌毒力有關聯。海藻糖作為結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）細胞被膜的關鍵組成部分，通過LpqY/SugABC介導海藻糖逆濃度運輸進入胞內進而形成胞內外循環來維持結合分枝桿菌毒力［71］；此外，在人感染無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）CS101過程中，一類參與氨基酸攝入、血紅素合成、孢子形成以及與主要毒力因子SpeB半胱氨酸蛋白酶的表達有關的Opp（oligopeptide）ABC內向轉運蛋白，通過降低纖維蛋白原結合蛋白FbsA的表達觀察到粘附上皮細胞的減少，證明肽攝取在病原菌入侵中起著重要作用，但其機制可能是通過環境感應［51］。

在宿主體內存在先天性防御機制限制病原微生物營養的利用，以防止病原微生物的定植。因此，一些ABC內向轉運蛋白也在體內定植和傳播中發揮重要作用。例如宿主體內維生素B12在自然殺傷細胞的激活和淋巴細胞的產生中起著重要作用，有人提出細菌通過清除體內維生素B12來增加在宿主體內生存率，現已在大腸桿菌里鑒定出依賴維生素B12內向轉運蛋白BtuCED（TCID 3.A.1.13）［72］，但是，尚未在體內感染中確定ABC內向轉運蛋白利用轉運維生素B12定植宿主體內這一作用機制；同樣還有Mn/Zn/Fe螯合轉運體家族，奈瑟氏菌FbpA的親和力使其能夠直接從載鐵蛋白中剝離出Fe3+，供病原體使用［73-74］、錳轉運蛋白是來自人類主要病原體鏈球菌肺炎的PsaBCA滲透酶缺失將導致體內毒力完全衰減［75-76］。

5 總結與展望

原核生物的ABC轉運體表現出顯著的功能多樣性，其中一些功能是致病菌的毒力所必需的。然而，許多ABC轉運系統的生理功能仍有待闡明。盡管ABC轉運蛋白對毒力方面有明顯的作用，但與在真核生物疾病中ABC轉運蛋白的作用不同，原核生物ABC轉運蛋白很少與多藥外排相關。在致病菌中，ABC轉運蛋白可發揮逃避或抵抗宿主防御的作用，同時還具有定殖在宿主體內功能，因此，與ABC轉運蛋白相關的細胞表面或分泌因子很可能是抗菌療法或疫苗開發的作用靶點，為細菌性疾病的預防提供了新的思路。然而，在這方面的應用依賴于對ABC轉運體明確的生理功能和毒性作用機制，因此顯然需要對ABC轉運蛋白在細菌致病性中的作用這一前沿領域進行更多的研究。