兔源F型多殺性巴氏桿菌環介導等溫擴增快速檢測方法的建立

王錦祥，孫世坤，陳巖峰，陳冬金，桑 雷，謝喜平

(福建省農業科學院 畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013)

兔巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌感染兔引起的一種傳染性疾病，該病是兔的常發病和多發病。臨床上，患兔主要表現為呼吸道癥狀，如咳嗽、流漿液性或膿性鼻涕，也可表現為中耳炎和結膜炎等病癥[1-2]。該病常年發生，所有品種和日齡的兔均易感，是危害兔產業發展的重要疾病[1-2]。F型多殺性巴氏桿菌首次分離自火雞[3]，前期研究表明該菌主要感染禽類，且對禽具有強致病性，能引起禽霍亂[4-5]。2004年，JAGLIC等[6]首次證實F型多殺性巴氏桿菌也存在于兔群中，且該菌通過皮下和滴鼻2種途徑攻毒均能引起試驗兔的死亡[7]。2012年，張娜等[8]首次報道在我國山東的兔群中分離到F型多殺性巴氏桿菌，該分離菌對兔的致病性也很強，攻毒后對仔兔的呼吸道能造成嚴重的病理損害，并導致仔兔死亡。此后的研究表明，F型多殺性巴氏桿菌在我國不同地區的兔群中均有流行，且該菌的感染與兔的呼吸道疾病直接相關[9]。由此可見，F型多殺性巴氏桿菌對兔具有很強的致病性，如果其在兔群中廣泛流行必將阻礙兔產業的發展。因此，建立F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測方法，掌握該菌在兔群中的流行情況，有助于實現對該菌的有效防控，對保障兔產業的發展具有重要意義。目前，用于F型多殺性巴氏桿菌的實驗室檢測方法有細菌分離鑒定[8]、雙重PCR方法[10]和多重PCR方法[11]，還未見LAMP方法的報道。本試驗針對編碼F型多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的fcbD基因的保守序列設計了外引物和內引物，建立了檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的LAMP快速檢測方法，為兔源F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株兔源A型、D型和F型多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,P.multocida)、支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,B.bronchiseptica)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia,K.pneumonia)、大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)等臨床分離株由本實驗室分離保存。

1.2 主要試劑Brain Heart Infusion購自Oxoid公司；EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(EE161-01)購自北京全式金生物技術有限公司；熒光及可視化LAMP試劑盒(200921W)購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.3 引物設計與合成根據GenBank登錄的編碼F型多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的fcbD基因(AF302467)，利用在線軟件PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/e/)設計了2對特異性引物。外引物序列為fcbD-F3：5′-GCCTGTTTGGTCAATCAGAA-35′/fcbD-B3：5′-GTTGTGGTGCCATATCGC-3′；內引物序列為fcbD-FIP：5′-TTGCACAATGGTAAGTAAGTTTTCCACAA-ACTACCCATTTGAAGTC-3′/fcbD-BIP：5′-GGA-TATCAATTGTGTGCAGTCAGATCGAGACA-AAATCATACTTTGC-3′。引物由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。

1.4 LAMP方法的建立按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書，提取兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，利用針對F型多殺性巴氏桿菌fcbD基因的特異性LAMP引物建立檢測F型多殺性巴氏桿菌的LAMP方法。LAMP方法反應體系為：4×熒光及可視化LAMP MagicMix 5 μL，基因組DNA 1 μL，外引物fcbD-F3/fcbD-B3(10 μmol/L)各0.4 μL，內引物fcbD-FIP/fcbD-BIP(10 μmol/L)各3.2 μL，滅菌ddH2O 6.8 μL，共計20 μL。LAMP方法反應條件為：65℃ 90 min。反應結束后，觀察反應產物的顏色，并將反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 LAMP方法的優化將反應體系中混合引物的終濃度保持為3.4 μmol/L不變，將外引物和內引物的濃度比設為1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7和1∶8，將反應溫度設為62，63，64，65，66，67，68℃，將反應時間設為30，45，60，75，90，105 min，對LAMP方法進行優化，確定最佳的反應條件。

1.6 LAMP方法的特異性試驗按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書，分別提取兔源A型、D型和F型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的基因組DNA。分別以這些細菌的基因組DNA為模板，同時設置陰性對照，應用建立的LAMP方法進行檢測，驗證該方法的特異性。

1.7 LAMP方法的敏感性試驗將兔源F型多殺性巴氏桿菌的基因組DNA進行連續的10倍倍比稀釋，使LAMP反應體系中的DNA模板濃度為1×108～1×100拷貝/μL，應用建立的LAMP方法進行檢測，驗證該方法的敏感性。

1.8 LAMP方法的重復性試驗取60份已知結果的病死兔肺臟樣品，平均分為3組，每組20份(A型多殺性巴氏桿菌樣品3份、D型多殺性巴氏桿菌樣品3份、F型多殺性巴氏桿菌樣品3份、支氣管敗血波氏桿菌樣品2份、肺炎克雷伯菌樣品2份、大腸桿菌樣品2份、金黃色葡萄球菌樣品2份和陰性樣品3份)。按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書分別提取上述樣品的基因組DNA，應用建立的LAMP方法分3批次檢測這些樣品，根據檢測結果統計批內和批間變異系數，評估該方法的重復性。

1.9 臨床樣品的檢測取90份來自福建省不同地區養兔場病死兔的肺臟樣品，按照EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit說明書分別提取上述樣品的基因組DNA。應用本試驗建立的LAMP方法和已報道的雙重PCR方法[10]同時檢測這些樣品，比較兩種檢測方法的結果，評估該LAMP方法的臨床實用性。

2 結果

2.1 F型多殺性巴氏桿菌fcbD基因的擴增結果顯示，擴增結果可通過肉眼判讀，陽性樣品的產物為藍色，而陰性樣品的產物為淺藍色(圖1)。進一步將擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，陽性樣品的擴增產物為特征性的階梯狀條帶，而陰性樣品則無此特征性條帶(圖1)。

M.DL2000 DNA Marker;1.F型多殺性巴氏桿菌;2.陰性對照

2.2 LAMP方法的優化在LAMP方法建立的基礎上，對該方法的反應條件進行優化。結果顯示，反應體系中引物終濃度保持為3.4 μmol/L不變，外引物和內引物的濃度比為1∶6～1∶8時，該LAMP方法擴增效果較優，本試驗取中間值即1∶7為該方法的最優外引物和內引物的濃度比(圖2)；當反應溫度為65℃時，該LAMP方法擴增效果最優(圖3)；當反應時間為30 min時，該LAMP方法有擴增，且該LAMP方法的擴增效果隨擴增時間的增加而增強，因有些臨床樣品中目的基因的含量可能較低，為了使該LAMP方法既有較好的擴增效果(不產生假陰性)又能實現快速檢測的目的，本試驗選取60 min作為最佳反應時間(圖4)。綜上所述，該LAMP方法的最佳反應條件確定為：外引物和內引物的濃度比為1∶7，反應溫度為65℃，反應時間為60 min。

M.DL2000 DNA Marker;1～6.1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8

M.DL2000 DNA Marker;1～7.62，63，64，65，66，67，68℃

M.DL2000 DNA Marker;1～6.30，45，60，75，90，105 min

2.3 LAMP方法的特異性試驗結果顯示，該LAMP方法僅對兔源F型多殺性巴氏桿菌有擴增，對其他常見兔源病原菌包括，A型和D型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌以及陰性對照(滅菌ddH2O)均無擴增(圖5)。結果表明，該LAMP方法特異性強。

M.DL2000 DNA Marker;1.F型多殺性巴氏桿菌;2.A型多殺性巴氏桿菌;3.D型多殺性巴氏桿菌;4.支氣管敗血波氏桿菌;5.肺炎克雷伯菌;6.大腸桿菌;7.金黃色葡萄球菌;8.陰性對照

2.4 LAMP方法的敏感性試驗結果顯示，該LAMP方法的最低檢出限為1×102拷貝/μL，比雙重PCR方法的高10倍，表明該方法具有良好的敏感性(圖6)。

A,B.LAMP方法檢測結果;C.雙重PCR方法檢測結果 M.DL2000 DNA Marker;1～9.1×108～1×100 拷貝/μL的F型多殺性巴氏桿菌基因組DNA模板;10.陰性對照

2.5 LAMP方法的重復性試驗結果顯示，3批次的檢測結果均與已知結果完全一致，表明該LAMP方法具有良好的重復性。

2.6 臨床樣品的檢測該LAMP方法檢出兔源F型多殺性巴氏桿菌陽性樣品6份，陰性樣品84份，檢測結果與雙重PCR方法的檢測結果完全一致，表明該LAMP方法準確性高，該方法臨床實用性好。

3 討論

兔巴氏桿菌病是兔的重要疫病，該病能通過飛沫、污染的飼料和飲水等在兔群中快速傳播，各品種和日齡的兔均易感，危害嚴重[1-2]。已有研究表明，兔巴氏桿菌病主要由A型和D型多殺性巴氏桿菌引起[12-13]。然而，近年來F型多殺性巴氏桿菌感染兔的多發及該菌對兔表現出的強致病性使兔巴氏桿菌病的病因更加復雜，也使該病的確診更加困難。

LAMP首次建立于2000年，是一種新型的核酸快速擴增方法[14]，該方法與傳統的PCR不同，可以在恒溫條件下實現核酸的擴增，而不需要在變性、退火和延伸3個溫度條件下進行，且該方法的擴增結果可通過簡單的設備(紫外燈)判讀或通過肉眼直接判讀。因此，自LAMP建立以來已廣泛地應用于畜禽疫病的快速檢測[15-17]。多殺性巴氏桿菌血清型眾多，根據莢膜抗原的不同可將其劃分為5種血清型(A、B、D、E和F)，且各血清型菌株之間無交叉免疫[18]。fcbD基因是F型多殺性巴氏桿菌的特異性基因，其編碼的是F型多殺性巴氏桿菌莢膜成分中的軟骨素[11]。已有研究表明，基于fcbD基因能建立特異的鑒定F型多殺性巴氏桿菌莢膜血清型的多重PCR方法和檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的雙重PCR方法[10-11]。由此可見，以該基因為目的基因能建立特異的檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的LAMP方法。

本試驗根據fcbD基因的保守序列設計了2對引物，建立了檢測兔源F型多殺性巴氏桿菌的LAMP方法。該方法對常見兔源病原菌，包括A型和D型多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均無交叉反應，特異性強。此外，該方法還易于推廣應用。由此可見，該方法的建立為兔源F型多殺性巴氏桿菌的快速檢測提供了依據。