1株牛源致病性蠟樣芽孢桿菌特征分析

雨，王 娟，楊增岐

(西北農林科技大學 動物醫學院，陜西 楊凌 712100)

蠟樣芽孢桿菌是蠟樣芽孢桿菌群中一種產芽孢、無莢膜的革蘭陽性兼性厭氧菌[1-2]，對外界環境有較強的適應能力，能夠廣泛存在于土壤、河流等自然環境和人類食物當中[3-4]。

蠟樣芽孢桿菌由于能夠導致多種疾病而被廣泛關注[5-7]，其能夠引起全身性和局部感染，在免疫功能缺陷個體中能夠導致死亡[8]。蠟樣芽孢桿菌最常引起的是以腹瀉和嘔吐為主要癥狀的食源性疾病，分別由腹瀉相關毒素(HBL、NHE、CYTK)和嘔吐毒素引起[9-11]。關于蠟樣芽孢桿菌引起食品污染和食物中毒在我國多有報道[12-13]，除此之外蠟樣芽孢桿菌還可以引起牛猝死和奶牛乳房炎[14-15]，但由于其引起的猝死癥狀與產氣莢膜梭菌相似，臨床上常被混淆[16]。

為進一步了解蠟樣芽孢桿菌疾病在奶牛養殖中的危害并對蠟樣芽孢桿菌疾病的診斷和防治提供參考。本試驗以全基因組測序、藥敏檢測以及小鼠感染模型的建立為基礎對1株分離自猝死荷斯坦奶牛肝臟的蠟樣芽孢桿菌進行了特征分析。

1 材料與方法

1.1 樣品來源2020年末，陜西省華陰縣某規?；膛ｐB殖場出現零星荷斯坦奶牛猝死。剖檢顯示，猝死荷斯坦奶牛肝臟和腸道發生明顯病變，初步懷疑為產氣莢膜梭菌感染；無菌采集1頭猝死荷斯坦奶牛肝臟和小腸，送至西北農林科技大學獸醫傳染病實驗室進行細菌分離鑒定。

1.2 主要試劑細菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；昆明小鼠購自西安交通大學實驗動物中心；細菌培養96孔板為廣州潔特生物過濾股份有限公司產品；2×Taq PCR StarMix為北京GenStar生物科技有限公司產品；藥品購自上海源葉生物科技有限公司；胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸(TSC)培養基、厭氧肉肝湯培養基、CAMHB肉湯、LB肉湯和普通營養瓊脂購自青島海博生物技術有限公司。

1.3 細菌分離鑒定常規細菌分離培養：取猝死荷斯坦奶牛肝臟切面涂布接種于2個5%綿羊血平板，分別置于37℃溫箱和厭氧培養箱中培養20 h；接種環挑取過夜培養的菌落，劃線接種于5%綿羊血平板進行細菌純化，分別置于37℃厭氧培養箱中培養20 h。

產氣莢膜梭菌分離培養：取部分肝臟和腸道內容物接種于厭氧肉肝湯培養基，培養18 h進行增菌，取菌液進行3 000 r/min離心2 min后劃線接種于TSC培養基置于厭氧培養箱37℃培養24 h，若出現顏色變黑的菌落則將其平板劃線至5%綿羊血平板進行進一步分離純化。

菌種鑒定：細菌培養完成后分別進行細菌菌落形態觀察、革蘭染色鏡檢、16S rRNA序列PCR擴增并送至西安擎科澤西生物技術有限公司進行測序。

1.4 分離菌株全基因組測序將分離菌株接種于LB肉湯中過夜培養，無菌條件下取過夜培養菌液3 mL，25℃、12 000 r/min離心2 min，按照細菌DNA提取試劑盒流程提取分離菌株DNA并送至金唯智生物科技有限公司進行全基因組測序。

1.5 分離菌株藥敏試驗通過微量肉湯稀釋法對分離菌株進行藥敏檢測，在96孔細菌培養板每孔加入50 μL CAMHB肉湯，并將阿莫西林、氨芐西林、恩諾沙星、氟苯尼考、磷霉素、壯觀霉素、萬古霉素、慶大霉素、四環素、乙酰甲喹在96孔細菌培養板上進行梯度稀釋。5% 綿羊血平板上刮分離菌株菌落，生理鹽水稀釋為麥氏濁度為0.5的菌液，每60 μL 菌液與5 mL CAMHB混合均勻后，按照每孔50 μL加入96孔細菌培養板，37℃培養20 h。通過觀察孔內菌株生長情況統計所選抗生素對試驗菌株的最小抑菌濃度(MIC)。

1.6 小鼠致病性試驗自5%綿羊血平板上刮取分離菌株菌落，用無菌生理鹽水稀釋均勻后按照1∶100接種于150 mL LB肉湯中，37℃培養。每1 h取菌液進行10倍梯度稀釋后取50 μL涂布接種于5%綿羊血平板進行活菌計數，并繪制該菌株在12 h內的生長曲線。

20只小鼠隨機均分為5組，將使用生理鹽水2倍梯度濃度稀釋的分離菌株菌液0.2 mL/只腹腔注射攻毒各組小鼠，并對各梯度稀釋的菌液進行活菌計數，初步確定該菌株對小鼠的半數致死量所在區間。另取40只小鼠隨機均分為5個試驗組，在預試驗得出的區間內按照0.7倍進行梯度濃度稀釋后0.2 mL/只腹腔注射攻毒試驗組小鼠，統計各試驗組小鼠死亡情況并使用IBM SPSS Statistics 26計算該菌株對小鼠的半數致死量。全程取8只小鼠0.2 mL/只腹腔注射生理鹽水，給予與試驗組小鼠相同飼養條件作為對照組。

將試驗組死亡小鼠與對照組小鼠進行剖檢，對比觀察試驗組死亡小鼠的病理變化；并將病變組織器官進行常規石蠟制片和組織病理學觀察。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定厭氧和需氧條件下，肝臟切面涂板的5%綿羊血平板上均分離到灰白色、表面粗糙、邊緣不整齊并帶有淡綠色溶血環的較大菌落(圖1)；TSC培養基上未發現符合產氣莢膜梭菌特征的菌落，但同樣分離得到了表面粗糙、邊緣不整齊的較大菌落；革蘭染色鏡檢顯示其為革蘭陽性中等大小桿菌、多成對或鏈狀排列(圖1),16S rRNA序列測序結果Blast顯示分離菌株為蠟樣芽孢桿菌。

圖1 分離菌株的菌落特征及革蘭染色鏡檢(10×100)

2.2 全基因組分析經CGE (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)和 VFDB (http://www.mgc.ac.cn/VFs/)分析，得知該蠟樣芽孢桿菌分離株基因組大小為5.51 Mb，MLST分型屬于ST1150，菌株基因組攜帶有磷霉素耐藥基因fosB以及多種毒素基因(表1)。使用MEGA 7.0以及在線工具iTOL (https://itol.embl.de/)對該蠟樣芽孢桿菌分離株(BN)與NCBI上記錄的我國和其他國家蠟樣芽孢桿菌進行進化樹分析表明，相比于國內蠟樣芽孢桿菌菌株，印度和美國的蠟樣芽孢桿菌菌株與本次分離的蠟樣芽孢桿菌之間具有更近的進化關系，表明本試驗所分離蠟樣芽孢桿菌可能是由國外傳入我國(圖2)。

表1 蠟樣芽孢桿菌分離株所攜帶毒素基因

圖2 不同地區蠟樣芽孢桿菌菌株進化樹分析

2.3 分離菌株藥敏試驗常用抗生素對該菌株的MIC顯示(表2)，氨芐西林、頭孢他啶、乙酰甲喹、磷霉素和壯觀霉素對該菌株的MIC較高(>64 mg/L)，乙酰甲喹對該菌株的MIC處于中等水平(16 mg/L)，萬古霉素、四環素、恩諾沙星、氟苯尼考和慶大霉素對該菌株的MIC較低(<0.5～2 mg/L)。結果表明，萬古霉素、四環素、恩諾沙星、氟苯尼考和慶大霉素更適合蠟樣芽孢桿菌疾病的臨床用藥。

表2 蠟樣芽孢桿菌分離株對多種抗生素MIC值 mg/L

2.4 小鼠致病性試驗本試驗中，該蠟樣芽孢桿菌生長曲線顯示其對數生長期為2～5 h，5 h后活菌數目穩定在7.5×108CFU/mL上下。該菌株12 h培養過程中，菌液D600持續上升，對數生長期菌液對應D600值在0.1～1.35之間(圖3)。

圖3 蠟樣芽孢桿菌分離株生長曲線

不同攻毒劑量下小鼠的死亡情況不同(表3)，在95%置信區間內該蠟樣芽孢桿菌對小鼠的半數致死量的估計值為1.247×107CFU，對應的下限和上限分別為 1.023×107，1.507×107CFU(表4)。

表3 不同攻毒劑量下小鼠死亡情況

表4 不同死亡概率對應攻毒劑量及95%置信區間

攻毒后1 h左右小鼠開始呈現持續性匍匐爬行姿態，死亡時間集中在12 h內，死亡小鼠病變主要集中于肺臟、肝臟和腸道(圖4)，表現為肺臟嚴重出血(圖4D)、肝臟質地變脆、顏色變灰白(圖4E)、腸壁水腫并伴有出血(圖4F)，死亡小鼠肝臟進行細菌分離鑒定仍能分離到該蠟樣芽孢桿菌。病理切片觀察可見死亡小鼠腸黏膜脫落、腸絨毛破碎；肝細胞腫大出現空泡變性、肝細胞索狀排列結構紊亂、肝血竇變窄等病變(圖5)。

A.～C.對照組小鼠肺臟、肝臟、腸道；D～F.試驗組小鼠肺臟、肝臟、腸道

A.、B.對照組腸道、肝臟；C、D.試驗組腸道、肝臟

3 討論

該蠟樣芽孢桿菌自猝死荷斯坦奶牛肝臟分離，基因組攜帶有多種毒素基因，腹腔注射攻毒1 h左右小鼠開始呈現持續性的匍匐姿態，攻毒 1×107CFU 水平時即可引起小鼠死亡；且死亡小鼠出現與猝死奶牛相似病變并能從肝臟分離到該蠟樣芽孢桿菌?？膳袛嘣摼昃哂休^強的毒力，與荷斯坦奶牛的猝死密切相關。

死亡小鼠的肝臟、腸道和肺臟均出現明顯病變，生產中綜合肝臟、肺臟和腸道等多種組織器官病變對蠟樣芽孢桿菌疾病進行診斷能夠使診斷結果更加準確。藥敏試驗顯示氨芐西林、頭孢他啶、乙酰甲喹、磷霉素和壯觀霉素對該蠟樣芽孢桿菌作用較弱，慶大霉素、萬古霉素、恩諾沙星、四環素與氟苯尼考對該蠟樣芽孢桿菌作用明顯。作為參考，畜牧生產中針對于蠟樣芽孢桿菌疾病的用藥可以優先選擇慶大霉素、恩諾沙星、四環素與氟苯尼考。

本研究表明，我國奶牛養殖中存在攜帶有多種毒素基因且對某些常用抗生素具有較強抵抗力的強毒力蠟樣芽孢桿菌菌株，與奶牛猝死密切相關。在畜牧生產中應加強對蠟樣芽孢桿菌疾病的診斷和合理用藥，防止相應蠟樣芽孢桿菌菌株經奶制品對人類造成感染。