運動對顆粒物暴露幼鼠呼吸道p38MAPK 通路的影響

吳杰妍 凌欽亮

廣州中醫藥大學第三附屬醫院 廣東 廣州 510378

近10 年來，國內的嬰幼兒哮喘累及發病率增加超過50%，患病率增加超過50%，嚴重影響嬰幼兒的生長發育［1，2］。懸浮于空氣的顆粒物（particulate matter，PM）是大氣污染的罪魁禍首，顆粒物具有顆粒小及表面積大的特點，可引起呼吸道病變，隨著病程的進展，氣道可產生不可逆的重塑或縮窄，嚴重時可引起呼吸困難。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，p38MAPK 是MAPKs 家族中的主要成員，p38MAPK 通路受到炎性因子、細菌病原體或應激刺激等胞外刺激而被激活，通過磷酸化轉錄因子調節細胞因子效應基因表達，如激活轉錄因子、蛋白激酶或核內蛋白質等，影響RNA 轉錄及蛋白合成，進而調節特定基因表達，引起系列生物學反應而參與細胞生長、發育、分化及凋亡等過程。研究顯示與呼吸道病變的氣道炎癥 與 氣 道p38MAPK 通 路 活 化 有 關［3，4］。本 研 究 將幼鼠暴露于模擬的顆粒物環境，分析顆粒物對幼鼠呼吸道的影響及對p38MAPK 通路的調控作用，為嬰幼兒呼吸疾病研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級健康幼年SD 大鼠（以下簡稱幼鼠），雌雄各半，購自南方醫科大學實驗動物中心，合格證號：4402102032，體質量（180±15）g，年齡4～5 周。適應性飼養1 周后開展試驗。本研究獲我院動物實驗倫理委員會批準，實驗過程符合科技部制定的《善待實驗動物的指導性原則》。

1.2 試劑及藥物PM 標準品（SRM1649a），成分為多環芳烴類及多氯聯苯類，顆粒直徑6.7～100 μm，均值24.4 μm，購自美國商務部國家標準技術委員會；白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factors，TNF）-α 與C 反應蛋白（C reactive protein，CRP）酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海濟寧酶有限公司；lysis buffer A、DAB 顯色試劑盒、BCA 蛋白質濃度測量試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒、蛋白質提取試劑盒均購自上海生工生物技術有限公司。兔抗鼠P-p38MAPK、p38MAPK（美國Abcam 公司）。Heraeus 型賀力氏臺式高速冷凍離心機（美國索福公司原杜邦離心機部和德國賀利氏儀器公司）；6010 型紫外可見分光光度儀（美國Agilent Technology 公司）；AE200 電子分析天平（上海天平儀器廠）。

1.3 建模方法將幼鼠分為4 組：對照組、PM 暴露組、PM 暴露+運動干預1 組和PM 暴露+運動干預2 組，每組10 只，雌雄各半。將SRM1649a 置于滅菌的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，使用前采用超聲儀超聲5 min，采用多功能霧化器，密閉環境的PM 劑量為（150±10）μg/m3，每天將PM 暴 露 組、PM 暴 露+運 動 干 預1 組 和PM 暴露+運動干預2 組的幼鼠置于霧化器中6 h（9：00—12：00，14：00—17：00），連續霧化12 周。對照組同期給予PBS 液霧化吸入。

1.4 運動對PM 暴露+運動干預1 組和PM 暴露+運動干預2 組在霧化同期進行運動干預，運動為縱跳和游泳：PM 暴露+運動干預1 組大鼠縱跳跳箱和電刺激箱作為大鼠縱跳的練習平臺。跳躍第1天至第3 天的跳躍高度為10 cm，第4 天開始每天升高2 cm，直至24 cm，每天跳躍20 次，4 d/周；第1 天游15 min，連續3 d，第4 天游20 min，連續3 d，第8天開始每天游泳30 min，水溫（29±l）℃，游泳池水深40 cm，4 d/周。PM 暴露+運動干預2 組在運動1 組基礎上，次數或時間增加1 倍，即每天跳躍40 次，第1 天游30 min，連續3 d，第4 天游40 min，連續3 d，第8 天開始每天游泳60 min。所有運動均持續12 周，霧化結束，運動干預結束。對照組、PM 暴露組不給予運動干預。

1.5 指標檢測

1.5.1體質量 霧化及運動結束后，稱重各組幼鼠。

1.5.2氣道反應性 霧化及運動結束后，采用Buxco 系統檢測幼鼠氣道的反應性。采用戊巴比妥鈉腹腔注射，全麻幼鼠，氣管插管并依次霧化吸入鹽 酸 組 胺，濃 度 分 為0、0.01、0.02、0.04、0.08 及0.16 mg/mL，各持續20 s，以鹽酸組胺0 mg/mL 的阻力值為基礎值1.0，換算其余濃度的阻力值。

1.5.3炎癥因子 霧化及運動結束后，全麻幼鼠，開腹，吸取腹主靜脈血5 mL，置于非抗凝管。取一硬硅膠管固定在左主支氣管內，用37 ℃無菌生理鹽水對左肺行支氣管肺泡沖洗得到支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），將靜脈血和BALF 分別離心得血清和BALF 上清，采用酶聯免疫吸附法測定血清BALF 中的IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 與CRP 水平。

1.5.4肺、脾和胸腺的臟器指數、HE 染色 安樂處死各組幼鼠，取幼鼠的肺臟、胸腺和脾臟，稱重，計算脾臟和胸腺的臟器指數，臟器指數=（幼鼠臟器質量/幼鼠體質量）×100%。取氣道，置于中性甲醛溶液中固定48 h，HE 染色，鏡下觀察。

1.5.5p38MAPK 通路相關蛋白 用Western Blot法測定氣道p38MAPK 通路相關蛋白質。取1.5.4項下氣道，加組織完全裂解液lysis buffer A 在冰上超聲混勻，以打破組織，離心棄去上清，用PSB 溶液重懸，室溫孵育，離心收集上清，用BCA 法測定蛋白濃度，經SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉至PVDF 膜上，封閉并加兔抗鼠p38MAPK 一抗、兔抗鼠p-p38MAPK 抗體與兔抗鼠β-actin 一抗，4 ℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標記二抗孵育，顯影，用QuantityOne 5.0 軟 件 得 到 P-p38MAPK 及p38MAPK 相對表達，p38MAPK 激活程度=P-p38MAPK/p38MAPK。

1.6 統計學方法采用SPSS 17.0 進行統計學分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNQ檢驗，檢驗水平α=0.05，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組幼鼠的體質量、肺指數、胸腺指數和脾臟指數比較與對照組比，PM 暴露組體質量明顯降低（P＜0.05），肺指數、胸腺指數和脾臟指數均明顯增高（P＜0.05）；與PM 暴露組比，PM 暴露+運動干預1 組和PM 暴露+運動干預2 組體質量明顯增高（P＜0.05），肺指數、胸腺指數和脾臟指數均明顯降低（P＜0.05），且與運動干預量呈依賴性趨勢，見表1。

表1 各組幼鼠的體質量、肺指數、胸腺指數和脾臟指數比較

2.2 各組幼鼠的氣道反應性比較與對照組比，PM 暴露組氣道反應性明顯增高（P＜0.05）；與PM暴露組比，PM 暴露+運動干預1 組和PM 暴露+運動干預2 組氣道反應性明顯降低（P＜0.05），且與運動干預量呈依賴性趨勢，見表2。

表2 各組幼鼠的氣道反應性(cmH2O/(mL·s)

2.3 各組幼鼠血清和BALF 中炎癥因子比較與對照組比，PM 暴露組 血清和BALF 的IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 和CRP 均 明 顯 增 高（P＜0.05）；與PM 暴 露 組 比，PM 暴 露+運 動 干 預1 組 和PM 暴露+運動干預2 組血清和BALF 的IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 和CRP 均明顯降低（P＜0.05），且與運動干預量呈依賴性降低趨勢，見表3 和表4。

表3 各組幼鼠血清炎癥因子比較(ng/mL, n=10)

表4 各組幼鼠BALF 炎癥因子比較(ng/mL, n=10)

2.4 各組幼鼠氣道的HE 比較正常組的氣道結構正常，細胞排列緊密，PM 暴露組的氣道存在明顯的凹陷，氣道周圍炎性細胞浸潤明顯，運動干預組的氣道存在輕微凹陷，氣道周圍存在部分炎性細胞浸潤，且與運動干預量呈依賴性降低趨勢，見圖1。

2.5 各組幼鼠氣道p38MAPK 通路相關蛋白及激活程度比較P-p38MAPK 與p38MAPK 主要表達在細胞核及細胞質。與對照組比，PM 暴露組氣道P-p38MAPK、 p38MAPK 和 P-p38MAPK/p38MAPK 均明顯增高（P＜0.05）；與PM 暴露組比，PM 暴露+運動干預1 組和PM 暴露+運動干預2 組 P-p38MAPK、p38MAPK 和 P-p38MAPK/p38MAPK 均明顯均明顯降低（P＜0.05），且與運動干預量呈依賴性降低趨勢，見表5、圖1 和圖2。

圖1 各組幼鼠氣道組織HE 染色(×200，標尺：50 μm)

表5 各組幼鼠氣道p38MAPK 通路相關蛋白及激活程度比較

圖2 各組幼鼠氣道p38MAPK 通路相關蛋白及激活程度比較(Western Blot 法)

圖3 各組幼鼠氣道p38MAPK 通路相關蛋白表達（×200）

3 討論

與健康成人相比，嬰幼兒的呼吸道、肺、胸腺及脾等呼吸及免疫器官的發育尚未完全，對空氣污染物的敏感性較高，更易產生負面的健康效應，增加了嬰幼兒的呼吸系統疾病的發病率［5］。本實驗也顯示，與對照組比，PM 暴露組經12 周持續的模擬大氣PM 霧化，氣道已顯出炎癥反應，肺、脾和胸腺指數增大，提示大氣PM 污染可引發氣道慢性炎癥。

MAPK 是存在于細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過將細胞外的刺激傳入細胞核并引起生物學反應。p38MAPK 是MAPKs 家族中的主要成員，由360 個氨基酸構成的蛋白質，參與“刺激信號-活 化 因 子-MAPKKK-MAPKK （MAKK）-MAPK（P38MAPK）-底 物”的 酶 促 級 聯 反 應。P-p38MAPK 可激活T 環上三肽基“TXY”中鄰近的T（酪氨酸）與Y（蘇氨酸）的雙重磷酸化，作為p38MAPK 的活化形式，即p38MAPK 通過磷酸化轉錄因子來調節細胞因子效應基因的表達，P-p38MAPK 改變蛋白構象，激活各種底物，參與多種 反 應，P-p38MAPK/p38MAPK 越 高，p38MAPK活化程度越高。炎性因子或應激刺激等多種因素可激活p38MAPK 通路，被激活的p38MAPK 可作用下游特定的效應器，如激活轉錄因子、蛋白激酶或核內蛋白質等，影響RNA 轉錄及蛋白合成，調節特定基因表達［6］。

呼吸道病變的最大病理特征在于炎癥反應。研究發現呼吸道病變與炎癥相關的通路較多，如NLRP3/IL-1β/TGF-β1、IRF7-IFN-α 和MAPK，其中研究較多較成熟的是MAPK 信號通路［7］。如本研究結果顯示，與對照組比，PM 暴露組氣道反應性明顯增高，且外周血及BALF 中的IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α 和CRP 水 平 明 顯 增 高，同 時p38MAPK 信號轉導通路相關蛋白p38MAPK 和P-p38MAPK 表 達 增 高，P-p38MAPK/p38MAPK 也增高，提示PM 暴露可刺激炎癥反應，激活p38MAPK 信號通道，p38MAPK 信號轉導通路的激活與炎癥反應密切相關，該結果與文獻報道類似。如Huang 等［8］研究顯示，顆粒物可以通過氧化應激和炎癥反應引起肺損傷，氧化應激和炎癥反應可激活p38MAPK 通路。Zhen 等［9］認為顆粒物誘導細胞凋 亡 和MAPK 通 道，MAPK 信 號 通 路 在PM2.5 誘導的皮膚損傷中起關鍵作用。

研究顯示，運動可顯著減輕炎癥反應，可能與運動調控氣道的p38MAPK 信號通道相關［10］。運動可通過抑制p38MAPK 信號通道減輕疾病嚴重程度，如龔彥豪等［11］發現運動通過調控MAPK 信號通道的ERK 和p38MAPK 水平達到保護急性力竭心臟損傷；Baghaiee 等［12］認為早期運動干預通過降低心臟組織p-p38 MAPK 蛋白表達改善心臟組織的重塑病變；王洋等［13］對雄性SD 大鼠給予運動干預，結果顯示運動通過調控p38MAPK 蛋白表達增加了骨骼肌總蛋白的合成，預防骨骼肌萎縮。但也有研究［14，15］顯示，過度運動可促進炎癥反應，誘發哮喘或其他病變，如李改新［16］研究表明對哮喘兒童進行不同方式一次運動均可使外周白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞計數增高；鄭嫵媚等［6］研究顯示，過度運動或高強度運動可上調心肌組織的p38MAPK 表達，增強炎癥反應，給予p38MAPK 抑制劑SB203580 可顯著降低炎癥反應；Zhang 等［17］研究認為，運動可用于預防血壓升高和改善血管功能，與運動調控p38MAPK 通道進而調控血管平滑肌細胞表型轉換相關。本課題設定了2 種不同量的運動干預，大量指標顯示出運動量相關的趨勢變化，可見本研究的運動劑量尚未達到過度的程度，而且運動在調控p38MAPK 存在雙向效應，因此下一步研究有必要考察運動強度、持續時間及運動間隔等與p38MAPK 通路的關聯。

綜上，顆粒物可激活幼鼠呼吸道的p38MAPK通路，給予運動干預可降低p38MAPK 通路的P-p38MAPK、p38MAPK 蛋白表達，降低炎性反應，改善肺、脾和胸腺的臟器指數。長期暴露在大氣污染的環境可激活呼吸道的p38MAPK 通路，引發炎癥反應，適當運動可抑制p38MAPK 通路活性，降低炎癥，改善肺功能及免疫功能。