丙泊酚通過激活Nrf2/HO-1 減輕膿毒癥小鼠腦損傷

羅 濤 付湘云 黃 蕊 劉方燕 劉永芳 劉志剛

武漢大學人民醫院麻醉科 湖北 武漢 430060

膿毒癥（sepsis）是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，嚴重時常伴有危及生命的器官功能障礙，是全世界ICU 入院和死亡的主要原因［1］。中樞神經系統是膿毒癥進程中最容易受損的系統之一，臨床表現為膿毒癥相關性腦?。╯epsis associated encephalopathy，SAE），可導致膿毒癥患者急性和慢性認知功能障礙，并且增加死亡率［2］。因此尋找能有效減輕膿毒癥導致的腦損傷的藥物，對于降低膿毒癥患者的死亡率和改善預后具有重要意義。

丙泊酚作為一種代謝迅速、無蓄積的靜脈麻醉藥，廣泛用于臨床麻醉和重癥監護室患者的鎮靜。除鎮靜和催眠作用外，已有研究報道丙泊酚對膿毒癥導致的肺、肝、腎等多器官損傷具有保護作用［3-5］。核因子E2 相關因子2/血紅素加氧酶-1（Nrf2/HO-1）是機體發揮內源性抗氧化作用的關鍵通路之一，先前的研究表明Nrf2/HO-1 通路與膿毒癥腦損傷關系密切，激活Nrf2 抗氧化信號通路，能夠減輕膿毒癥小鼠的血腦屏障損傷和認知功能障礙［6］。此外，有研究發現丙泊酚可激活Nrf2/GSH 信號通路，減輕膿毒癥急性肺損傷［7］。然而，丙泊酚是否能減輕膿毒癥導致的腦損傷及其具體機制尚不清楚，因此本研究擬探討丙泊酚對膿毒癥小鼠腦損傷的影響及其與Nrf2/HO-1 通路的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57BL/6 小鼠購自武漢大學人民醫院動物實驗中心，SPF 清潔級，雄性，6～8 周，體質量18～20 g。所有動物在本院動物房中常規飼養1 周，采用晝夜交替光照，相對濕度50%～60%，溫度保持約22～25 ℃，小鼠自由攝食、飲水，定期更換墊料。本實驗經本院動物實驗倫理委員會審核批準（編號：WDRM20191004 號）。

1.2 主要試劑和儀器脂多糖（O111：B4），純度98%，批號：L2630，購自美國Sigma 公司；丙泊酚注射液（批號：RJ816），英國AstraZenec 公司；脂肪乳注 射 液（GM2007029），廣 州Baxter 公 司；ML385（abs819623），二甲基亞砜（abs9187），上海absin 公司；小鼠腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA 試劑盒（ml002095），小鼠白細胞介素（IL）-6 ELISA 試劑盒（ml002293），上海酶聯生物技術公司；總超氧化物歧 化 酶（SOD）活 性 檢 測 試 劑 盒（WST -8 法）（S0101S），脂質氧化檢測試劑盒（S0131S），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0012），上海碧云天公司；兔源Nrf2 一抗（16396-1-AP），兔源HO-1 一抗（10701-1-AP），山羊抗兔二抗（SA00001-2），美國Proteintech公司；兔源β-actin 一抗（GB11001），RIPA 裂解液（G2002），武漢Servicebio 公司等。

1658001 型電泳儀、熒光定量PCR 儀和Chemi-Doc MP System 型全能型成像系統均購自美國Bio-Rad 公司；EnSight 多功能酶標儀購自Perkin Elmer公司；CX43 型光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；低溫高速離心機購自德國Eppendorf 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1動物分組和造模 選取60 只C57BL/6 小鼠，采用隨機數字表法分為對照（Con）組、膿毒癥（LPS）組、脂肪乳（Lip）組、丙泊酚（PF）組、丙泊酚（PF）+Nrf2 抑制劑（ML385）組，每組12 只。參照文獻［8］和［9］中ML385 的使用方法，PF+ML385組于造模前1 周開始，每天腹腔注射抑制劑ML385 30 mg/kg，每天一次，連續7 d。除Con 組注射等劑量生理鹽水外，LPS、Lip、PF 和PF+ML385 組小鼠均采用腹腔注射LPS 10 mg/kg 構建膿毒癥小鼠腦損傷模型［10］。參照文獻［4］和預實驗結果，本研究選擇丙泊酚50 mg/kg 進行實驗。注射LPS 30 min后，PF 組小 鼠腹腔注射50 mg/kg 丙泊酚，Lip 組注射等體積的脂肪乳，Con 組和LPS 組注射等體積的生理鹽水，12 h 后重復給藥一次。

1.3.2小鼠神經行為評分 注射LPS 24 h 后，分別采用耳廓反射、捏尾反射、角膜反射、逃避反射、翻正反射對小鼠神經功能進行評分，正常為2 分，反射減弱（10 s＜間隔時間≤30 s）為1 分，反射喪失（間隔時間＞30 s）為0 分，最高評分為10 分［11］。

1.3.3HE 染色觀察腦組織病理變化 注射LPS 24 h 后，各組選取3 只小鼠，腹腔注射10%水合氯醛0.1 mL 麻醉小鼠后立即處死，分離出完整腦組織，4%多聚甲醛4 ℃浸泡后依次經梯度乙醇脫水、石蠟包埋、組織切片、脫蠟后HE 染色，置于400 倍光學顯微鏡下觀察海馬CA1 區損傷情況。

1.3.4ELISA 法 檢 測 血 清TNF-α 和IL-6 水 平注射LPS 24 h 后，各組隨機選取6 只小鼠，麻醉后經左心室取血0.5～1.0 mL，置于低速離心機中3 000 r/min 離心10 min，取上清液，按照試劑盒的說明操作，采 用ELISA 法 檢 測 血 清 中TNF-α 和IL-6 的 含量。處死小鼠取海馬組織，于-80 ℃備用。

1.3.5檢測腦組織中SOD 和丙二醛（MDA）活性 取出備用的海馬組織，加入預冷的RIPA 裂解液制備成10% 的組織勻漿，12 000 r/min 離心15 min 后取上清液，嚴格按照試劑盒操作說明。

1.3.6Western Blot 法檢測Nrf2 和HO-1 蛋白表達 取適量海馬組織，加入預冷的RIPA 裂解液，提取出總蛋白后，用BCA 法測蛋白濃度，分別取20 μg蛋白與5×上樣緩沖液混勻并煮沸，經SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，依次加入一抗兔抗Nrf2（1∶1 000）、兔抗HO-1（1∶2 000）和兔抗β-actin（1∶1 000），4 ℃孵育過夜。然后加入HRP 標記的山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，洗膜后加入增強化學發光液ECL，采用凝膠成像系統拍照并用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值。以各條帶灰度值與內參β-actin 條帶灰度值的比值，為目的蛋白的相對表達量。

1.3.7RT-PCR 檢測Nrf2 和HO-1 基因表達 用TRIzol 法提取小鼠海馬組織總RNA。逆轉錄試劑盒合成cDNA，再使用綠色熒光定量PCR 試劑盒檢測待測基因的相對表達量。引物由南京金斯瑞設計 及 合 成。Nrf2：Forward 5＇-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT - 3＇，Reverse 5＇ - CCTTCTGGAGTTGCTCTTG-3＇，擴 增 產 物 長 度191 bp；HO-1：Forward 5＇-ACAGCCCCACCAAGTTC-3＇，Reverse 5＇-GGCGGTCTTAGCCTCTTC-3＇，擴 增產物長度101 bp；內參β-actin：Forward 5＇-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3＇，Reverse 5＇-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3＇，擴 增 產 物 長 度154 bp。PCR 擴增程序：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s（40 個循環）；72 ℃10 min。按2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達量，實驗重復3 次。

1.3.8統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計學分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s），組間比較采用單因素方差分析，并采用LSD 法進行組間的兩兩比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丙泊酚對小鼠神經功能評分的影響與Con組相比，LPS 組小鼠的神經功能評分降低（P＜0.05）；與LPS 組相比，Lip 組差異無統計學意義（P＞0.05），PF 組小鼠的神經功能評分升高（P＜0.05）；相較于PF 組，PF+ML385 組的神經功能評分降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠神經功能評分結果（n=6，±s）

表1 各組小鼠神經功能評分結果（n=6，±s）

與Con 組比較，aP＜0.05；與LPS 組比較，bP＜0.05；與PF 組比較，cP＜0.05

神經功能評分10.00±0.00 5.42±0.79a 5.25±0.87 7.75±1.14b 5.58±0.90c組別Con LPS Lip PF PF+ML385

2.2 丙泊酚減輕膿毒癥小鼠海馬CA1 區損傷Con 組小鼠海馬CA1 區神經元結構正常，排列整齊，細胞核清晰；LPS 組和Lip 組小鼠海馬CA1 區神經元神經元排列紊亂，細胞核皺縮，結構不清晰；與LPS 組相比，PF 組小鼠上述病理改變減輕；與PF 組相比，PF+ML385 組海馬CA1 區神經元病理改變加重。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬CA1 區病理變化（HE×400）

2.3 丙泊酚對膿毒癥小鼠血清TNF-α 和IL-6 的影響與Con 組比較，LPS 組小鼠血清TNF-α、IL-6顯著增加（P＜0.05）。與LPS 組相比，Lip 組小鼠TNF-α、IL-6 含量無明顯變化（P＞0.05），PF 組小鼠TNF-α、IL-6 含量明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與PF 組 相 比，PF+ML385 組 小 鼠TNF-α、IL-6 含量增高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠炎癥因子和氧化應激指標的比較（n=6，±s）

表2 各組小鼠炎癥因子和氧化應激指標的比較（n=6，±s）

與Con 組比較，aP＜0.05；與LPS 組比較，bP＜0.05；與PF 組比較，cP＜0.05

組別Con LPS Lip PF PF+ML385 TNF-α（pg/mL）71.80±1.67 219.04±8.45a 216.25±4.56 141.95±2.94b 190.10±3.01c IL-6（pg/mL）43.33±4.53 98.95±13.00a 90.84±9.43 53.07±2.96b 84.27±10.65c SOD（U/mg）7.87±0.39 4.53±0.50a 5.02±0.39 6.40±0.43b 3.99±0.38c MDA（nmol/mg）1.52±0.12 2.43±0.13a 2.43±0.09 1.86±0.08b 2.65±0.11c

2.4 丙泊酚對膿毒癥小鼠海馬SOD 和MDA 含量的影響與Con 組相比，LPS 組小鼠海馬中SOD 活性顯著降低，而MDA 含量顯著增加（P＜0.05）。與LPS 組 相 比，Lip 組 小 鼠SOD 活 力 和MDA 含 量 無顯著性差異（P＞0.05），PF 組小鼠海馬SOD 活力明顯升高，MDA 含量明顯降低（P＜0.05）；與PF 組相比，PF+ML385 組 小 鼠 海 馬SOD 活 力 降 低，MDA含量增高（P＜0.05）。見表2。

2.5 丙泊酚對膿毒癥小鼠Nrf2 和HO-1 蛋白水平的影響與Con 組相比，LPS 組小鼠Nrf2 和HO-1蛋白表達增高（P＜0.05）；與LPS 組相比，Lip 組無明顯變化（P＞0.05），PF 組Nrf2 和HO-1 進一步升高（P＜0.05）；相較于PF 組，PF+ML385 組Nrf2 和HO-1 明顯降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠海馬組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達情況

2.6 丙泊酚對膿毒癥小鼠Nrf2 和HO-1 mRNA 表達的影響與Con 組相比，LPS 組小鼠Nrf2 和HO-1 mRNA 表達上調（P＜0.05）；與LPS 組相比，Lip組無明顯變化（P＞0.05），PF 組中Nrf2 和HO-1 mRNA 明顯上調（P＜0.05）；相較于PF 組，PF+ML385 組小鼠Nrf2 和HO-1 mRNA 表達明顯下調（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠海馬組織Nrf2 和HO-1 的mRNA 表達水平（n=6，±s）

表3 各組小鼠海馬組織Nrf2 和HO-1 的mRNA 表達水平（n=6，±s）

與Con 組比較，aP＜0.05；與LPS 組比較，bP＜0.05；與PF 組比較，cP＜0.05

HO-1 mRNA 0.84±0.15 2.51±0.20a 2.20±0.25 4.34±0.32b 0.58±0.12c組別Con LPS Lip PF PF+ML385 Nrf2 mRNA 0.94±0.06 2.03±0.25a 1.87±0.02 3.06±0.21b 0.61±0.03c

3 討論

本研究參照文獻［9］采用腹腔注射LPS 的方法制備膿毒癥小鼠腦損傷模型。結果表明，造模24 h后小鼠出現精神萎靡、豎毛、呼吸頻率加快、眼角膿性分泌物、拒食或少食等癥狀，神經功能評分降低，病理學結果顯示神經元排列紊亂、核固縮、結構不清晰，提示膿毒癥小鼠腦損傷模型制備成功。

膿毒癥腦損傷是膿毒癥常見的臨床并發癥之一，可引起意識水平的改變和急、慢性認知功能障礙，嚴重影響膿毒癥患者的預后。海馬是邊緣系統學習記憶的關鍵部位，其中CA1 區是缺血損傷和氧化應激的敏感腦區，CA1 區神經元損傷會嚴重影響認知功能［12］。本研究采用HE 染色觀察小鼠海馬CA1 區的病理變化，結果顯示，膿毒癥小鼠的海馬CA1 區神經元排列紊亂、核固縮、結構不清晰，而丙泊酚能明顯減輕膿毒癥小鼠海馬CA1 區的神經元損傷，說明丙泊酚對膿毒癥腦損傷具有保護作用。

過度的炎癥反應和氧化應激被認為是膿毒癥腦損傷的潛在機制。TNF-α 和IL-6 作為早期促炎細胞因子，可激活TLR4/NF-κB 信號通路及損傷內皮細胞功能，增加血腦屏障的通透性，導致神經毒性因子和炎性細胞進入腦組織，在易受損傷的腦區誘導神經元凋亡［13］。本研究發現，丙泊酚可明顯降低膿毒癥小鼠血清TNF-α 和IL-6 水平，表明丙泊酚具有較強的抗炎作用，可抑制膿毒癥小鼠的全身炎癥反應。另外，膿毒癥過程中大量中性粒細胞和巨噬細胞激活，發生呼吸爆發，過量產生的活性氧（ROS）能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化［14］。與Zhu 等［15］研究結果一致，本研究發現膿毒癥小鼠海馬中脂質過氧化物MDA 含量增加，抗氧化酶SOD 活性降低，而丙泊酚能顯著抑制腦組織中MDA 產生，增強SOD 活性，說明丙泊酚能抑制膿毒癥小鼠腦組織氧化應激反應，進而發揮抗氧化保護作用。

Nrf2 作為機體抵抗外界氧化刺激的關鍵轉錄因子，生理情況下Nrf2 與Kelch 樣ECH 相關蛋白1（Keap1）結合存在于細胞質中，當受到外界氧化應激因子或親核物質刺激后，Nrf2 和Keap1 解離，Nrf2轉位進入細胞核，與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）結合來激活下游靶蛋白的轉錄，調控Ⅱ相解毒酶（phase Ⅱdetoxifying enzymes）及抗氧化酶的表達，以清除ROS 等有害物質，維持氧化 還原平衡［16］。HO-1 是參與Nrf2-ARE 抗氧化系統的主要抗氧化酶之一，通過膽綠素還原酶降解血紅素為膽綠素、一氧化碳（CO）和亞鐵，構成內源性保護物質來調節多種細胞活動［17］。膽綠素與膽紅素是機體內源性的強氧化劑，可抑制細胞脂質過氧化，清除氧自由基，直接發揮抗氧化應激的效應；CO 有強大的抗炎作用，可選擇性抑制LPS 誘導的TNF-α 和IL-6 等 炎 性 因 子 產 生，促 進IL-10 等 抗 炎因子產生［18］。以上說明HO-1 及血紅素降解產物具有抗炎、抗氧化應激及調控細胞凋亡等生物學作用，靶向調控Nrf2 及下游的HO-1 也許能減輕膿毒癥所致器官功能障礙。

在LPS 刺激的巨噬細胞中，激活Nrf2/HO-1 通路能減少促炎因子釋放及活性氧的產生，而HO-1選擇性抑制劑或使用siRNA 沉默HO-1 可消除這種抗炎和抗氧化作用，提示Nrf2/HO-1 通路是調節機體免疫反應的重要靶點［19］。Yu 等［20］研究發現，激活Nrf2/HO-1 通路可升高膿毒癥肺組織抗氧化蛋白SOD 和CAT 水平，同時降低MDA 和炎性因子含量，提高小鼠存活率，而敲除Nrf2 可消除氫氣對膿毒癥小鼠的肺保護作用。上述研究說明激活Nrf2/HO-1 通路可上調如SOD、CAT 等抗氧化酶水平，同時抑制活性氧及促炎因子釋放，發揮內源性保護作用。目前有文獻［21］報道，丙泊酚能通過調節GSK-3β/Nrf2/HO-1 通路減輕心肌缺血再灌注損傷，但尚未見關于丙泊酚對膿毒癥腦損傷及Nrf2/HO-1 的影響的相關報道。本研究結果顯示，膿毒癥小鼠腦組織中Nrf2 和HO-1 表達增加，而丙泊酚可進一步激活Nrf2 和HO-1 表達，增加SOD 含量同時抑制TNF-α、IL-6 和MDA 水平，說明丙泊酚可能通過上調Nrf2/HO-1 表達來發揮抗氧化應激和抗炎作用。為進一步明確Nrf2/HO-1 通路與丙泊酚發揮腦保護作用的關系，我們使用Nrf2 特異性抑制劑ML385 進行干預。結果顯示，ML385 能明顯下調Nrf2/HO-1 相關蛋白的表達，拮抗丙泊酚對膿毒癥小鼠的腦保護作用，進一步證實丙泊酚減輕膿毒癥小鼠腦損傷的機制可能與激活Nrf2/HO-1 通路有關。楊博等［22］實驗發現丙泊酚預處理可抑制膿毒癥大鼠中樞和外周的炎癥反應，減輕大鼠的認知障礙，但其具體的分子機制尚未明確。與該研究不同，本實驗研究的是丙泊酚后處理對膿毒癥小鼠認知功能的影響并對可能的作用機制進行了探討，臨床上由于膿毒癥事件的不可預知性限制了藥物預處理的應用，因而藥物后處理更具有臨床意義。

綜上所述，丙泊酚通過抑制炎癥反應和氧化應激進而減輕膿毒癥小鼠腦損傷，其機制與激活Nrf2/HO-1 通路有關。