Box-Behnken 響應面法結合多指標綜合評分法優化龍眼葉提取工藝Δ

黃光強，鄭飄雪，梁 潔，2，3，4，5#a，陳奎奎，曹玉嬪，胡 玨，安施佳，梁晶春，劉星晨，朱曉峰（.廣西中醫藥大學藥學院，南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術研究中心，南寧 530200；3.廣西優勢中成藥與民族藥開發工程技術研究中心，南寧 530200；4.中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心華南分中心，南寧 530200；5.暨南大學中醫學院，廣州 50632）

龍眼葉為無患子科龍眼屬植物龍眼Dimocarpus longanLour.的葉或嫩芽，味甘淡、性平，具有解表清熱、解毒利濕等功效[1]。龍眼葉作為廣西民間常用中藥，分布廣泛且資源豐富。有研究表明，龍眼葉具有降血糖、抗氧化等作用[2－4]。本課題組前期證實，龍眼葉主要含有沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸乙酯、山柰酚、木犀草素、槲皮素、槲皮苷和紫云英苷等成分[5－6]。其中，沒食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚可通過抑制α-葡萄糖苷酶的活性，而發揮降血糖的作用[5]；沒食子酸和原兒茶酸等酚酸類成分具有抗氧化活性[7－9]。這表明龍眼葉的活性成分為黃酮類和酚酸類成分。雖然本課題組前期已測定了龍眼葉中黃酮類成分的含量，但指標成分主要為槲皮素、木犀草素、山柰酚等成分[10]，單一指標并不能系統全面地反映龍眼葉的質量。因此以黃酮類和酚酸類成分作為考核指標，可以對龍眼葉提取工藝進行更全面的評價。

Box-Behnken響應面法能直觀反映各影響因素之間的交互關系，可對多因素、多水平結果進行分析，具有實驗次數相對較少、檢測精確度高等優點[11]；同時其可通過對各因素的顯著性及相互作用進行分析，確定工藝條件的最佳組合[12]。目前，有關龍眼葉提取工藝的研究較少，主要為龍眼葉中總黃酮的提取工藝研究[13－14]?；诖?，在前期研究的基礎上[15]，本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法同時測定了龍眼葉中沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚的含量；同時以乙醇體積分數、料液比、提取時間為考察因素，上述6種成分含量的綜合評分為考察指標，采用Box-Behnken 響應面法優化龍眼葉的提取工藝，旨在為龍眼葉的綜合評價及資源開發提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC 2030 型Plus HPLC 儀（日本Shimadzu 公司），SQP 型萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]，XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司），DZG-303A 型超純水儀（重慶頤洋企業發展有限公司），H1650-W型離心機（長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

沒食子酸對照品（批號RP1911126，純度99.99%）、原兒茶酸對照品（批號RP190605，純度99.99%）、沒食子酸乙酯對照品（批號RP200120，純度99.85%）、槲皮素對照品（批號RP200602，純度99.25%）、木犀草素對照品（批號RP191106，純度98.66%）、山柰酚對照品（批號RP200312，純度99.83%）均購自成都麥德生科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

8 批龍眼葉藥材（編號S1～S8）于2019 年11 月采集于廣西不同產地，經廣西中醫藥大學藥學院滕建北教授鑒定為無患子科植物龍眼D.longanLour.的葉。8 批龍眼葉藥材來源信息見表1。

表1 8批龍眼葉藥材來源信息

2 方法與結果

2.1 沒食子酸等成分的含量測定

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚對照品適量，用甲醇溶解并定容，制成上述各成分質量濃度分別為204.00、17.46、21.30、235.40、6.30、65.70μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取龍眼葉藥材粉末2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇-鹽酸（體積比為9∶1，下同）16 mL[3]，稱定質量，水浴提取90 min，放冷，再次稱定質量，用乙醇-鹽酸補足減失的質量，于13 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 以InertSustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～14 min，10%A→26%A；14～26 min，26%A→28%A；26～38 min，28%A→40%A；38～54 min，40%A→75%A）；檢測波長為280 nm（沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸乙酯）、360 nm（槲皮素、木犀草素、山柰酚）；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為5 μL。

2.1.4 系統適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液（甲醇）適量，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1 可知，各色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數均不低于5 000，空白對照溶液不干擾測定。

圖1 6種成分的混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液的HPLC圖

2.1.5 線性關系考察 分別精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10μL，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以各待測成分的進樣量為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。結果見表2。

表2 6種成分的回歸方程與線性范圍

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.1”項下混合對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚峰面積的RSD 分別為0.10%、0.27%、0.52%、0.16%、0.32%、0.11%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S1），分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12、24 h 時按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚峰面積的RSD 分別為0.35%、1.01%、1.86%、0.15%、0.97%、0.11%（n＝7），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.8 重復性試驗 取龍眼葉藥材（編號S1），共6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。結果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚含量的RSD 分別為1.77%、1.62%、2.29%、1.50%、1.26%、1.23%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取已知含量的龍眼葉藥材（編號S1），每份約1 g，共6 份，精密稱定，分別精密加入沒食子酸對照品1.452 0 mg、原兒茶酸對照品0.162 8 mg、沒食子酸乙酯對照品0.188 6 mg、槲皮素對照品1.764 0 mg、木犀草素對照品0.050 0 mg和山柰酚對照品0.455 8 mg，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定并計算加樣回收率。結果見表3。

表3 6種成分的加樣回收率試驗結果（n＝6）

2.2 沒食子酸等成分的提取方法選擇

取龍眼葉藥材（編號S1）2 g，精密稱定，加入乙醇-鹽酸10 mL，分別考察不同提取方法（水浴提取法、超聲提取法和回流提取法）對沒食子酸等6 種成分含量的影響。結果顯示，超聲提取法中沒食子酸等6種成分的總含量低于水浴提取法和回流提取法結果，且水浴提取法中沒食子酸、槲皮素的含量較高，其他成分的含量相差不大，綜合考慮選擇水浴提取法。結果見表4。

2.3 綜合評分計算公式的確定

根據表4 結果，按含量高低分別賦予各指標成分權重系數。水浴提取法中沒食子酸等6種成分的總含量為5.002 0 mg/g，其中沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚的含量分別占總含量的30.10%、3.22%、21.24%、35.12%、1.72%、8.61%，因此將權重系數設置4個梯度：沒食子酸和槲皮素的含量較高，權重系數設置為30%；沒食子酸乙酯的含量居中，權重系數設置為20%；山柰酚的含量其次，權重系數設置為10%；原兒茶酸和木犀草素的含量最低，權重系數設置為5%。據此得到實際綜合評分（Y）＝ΣDiJ×權重系數[16－17]，即Y＝DiJ沒食子酸×30%×100+DiJ原兒茶酸×5%×100+DiJ沒食子酸乙酯×20%×100+DiJ槲皮素×30%×100+DiJ木犀草素×5%×100+DiJ山柰酚×10%×100[17]，式中DiJ 表示某指標的含量。

表4 不同提取方法對6 種成分含量的影響（n＝3，mg/g）

2.4 單因素實驗

2.4.1 乙醇體積分數 取龍眼葉藥材（編號S1），每份約2 g，共7 份，精密稱定，分別加入不同體積分數的乙醇（50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、無水乙醇）各10 mL，于80 ℃水浴提取50 min，考察不同乙醇體積分數對綜合評分的影響。結果顯示，當乙醇體積分數為100%（無水乙醇）時，綜合評分最高，故選擇乙醇體積分數為80%～100%進行后續實驗。結果見圖2A。

圖2 乙醇體積分數等因素對綜合評分的影響

2.4.2 料液比 取龍眼葉藥材（編號S1），每份約2 g，共7份，精密稱定，分別按不同料液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，g/mL）加入無水乙醇，于80 ℃水浴提取50 min，考察不同料液比對綜合評分的影響。結果顯示，當料液比為1∶7時，綜合評分最高，故選擇料液比為1∶4～1∶10進行后續實驗。結果見圖2B。

2.4.3 提取溫度 取龍眼葉藥材（編號S1），每份約2 g，共7 份，精密稱定，加入無水乙醇14 mL，于不同水浴提取溫度（40、50、60、70、75、80、90 ℃）提取50 min，考察不同水浴提取溫度對綜合評分的影響。結果顯示，雖然提取溫度為90 ℃時的綜合評分最高，但與80 ℃時的綜合評分相差不大。從節約能源考慮，故選擇提取溫度為80 ℃。結果見圖2C。

2.4.4 提取時間 取龍眼葉藥材（編號S1），每份約2 g，共7份，精密稱定，加入無水乙醇14 mL，于80 ℃水浴分別提取不同時間（30、50、70、90、110、130、150 min），考察不同提取時間對綜合評分的影響。結果顯示，當提取時間為70 min 時，綜合評分最高，故選擇提取時間為50～90 min進行后續實驗。結果見圖2D。

2.5 Box-Behnken響應面法優化龍眼葉的提取工藝

2.5.1 實驗設計與結果 根據Box-Behnken 響應面法的設計原理[18]及單因素實驗結果，以乙醇體積分數（A）、料液比（B）、提取時間（C）為考察因素，以綜合評分（Y）為考察指標對龍眼葉的提取工藝進行優化。Box-Behnken響應面法優化龍眼葉提取工藝的因素與水平見表5，實驗設計方案與結果見表6。

表5 Box-Behnken響應面法優化龍眼葉提取工藝的因素與水平

表6 Box-Behnken響應面法優化龍眼葉提取工藝的實驗設計方案與結果

2.5.2 模型建立與方差分析 采用Design-expert 8.0.6軟件對表6中的數據進行多元回歸擬合，得二次多項回歸方程為Y＝73.07+11.82×A+11.72×B+4.79×C－1.22×AB+1.39×AC－2.33×BC+5.03×A2－12.20×B2+1.59×C2。方差分析結果顯示，所建模型有顯著性差異（P＜0.01），表明該模型的可信度較高；模型的失擬項無顯著性差異（P＞0.05），表明可以用此模型進行分析和預測。決定系數（R2）為0.996 6，表明該模型擬合度較好，實驗的誤差較小。因素A、B、C、BC、A2、B2、C2的影響顯著（P＜0.05），因素AB、AC的影響不顯著（P＞0.05）。結果見表7。

表7 Box-Behnken響應面法優化龍眼葉提取工藝回歸模型的方差分析結果

2.5.3 各因素交互作用 利用Design-expert 8.0.6 軟件繪制各因素的響應面圖。當固定其中某一因素時，可以分析其余任意2個因素交互作用對綜合評分的影響，響應面的曲面越陡峭，表示因素交互作用越明顯[18]。結果顯示，因素B與因素C的交互作用顯著，因素A與因素B、因素A與因素C的交互作用均不顯著。結果見圖3。

圖3 各因素交互作用對綜合評分的響應面圖

2.5.4 最優提取工藝的確定及驗證 利用Designexpert 8.0.6 軟件得到龍眼葉的最優提取工藝為A3B2C3，即乙醇體積分數100%，料液比1∶7（g/mL），提取時間90 min，提取溫度80 ℃。在此最優提取工藝條件下進行3次實驗驗證（以編號S1樣品驗證）。結果顯示，沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸乙酯、槲皮素、木犀草素和山柰酚的平均含量分別為1.493 6、0.084 4、0.291 7、2.061 6、0.048 7、0.518 0 mg/g，平均綜合評分為97.54 分（RSD＝0.33%，n＝3），與預測綜合評分（99.05分）的相對誤差為1.55%，表明優化所得工藝穩定、可行。結果見表8。

表8 最優提取工藝的實驗驗證結果（n＝3）

2.5.5 樣品含量測定 取8批龍眼葉藥材粗粉約2 g，精密稱定，按最優提取工藝制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品含量。每樣品平行測定3次。結果見表9。

表9 8 批龍眼葉藥材中6 種成分的含量測定結果（n＝3，mg/g）

3 討論

參考相關文獻及本課題組前期研究發現，沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸乙酯在280 nm波長處有較強的紫外吸收，且干擾較少；槲皮素、木犀草素、山柰酚在360 nm 波長處吸收較強[15，19]，故本研究采用雙波長切換法（280 nm 波長處測定沒食子酸、原兒茶酸和沒食子酸乙酯，360 nm波長處測定槲皮素、木犀草素和山柰酚）同時測定龍眼葉中沒食子酸等6種成分的含量。

本研究結果顯示，采用超聲提取法時，沒食子酸等6種成分的總含量低于回流提取法和水浴提取法；進一步對比回流提取法和水浴提取法后發現，采用水浴提取法時，沒食子酸、槲皮素的含量較高，其他4種成分的含量相差不大。同時，考慮到回流提取法的裝置復雜且操作繁瑣，故選擇水浴提取法。此外，本研究還考察了甲醇、乙醇、甲醇-鹽酸、乙醇-鹽酸等不同提取溶劑對沒食子酸等6 種成分含量及色譜圖的影響，結果發現，以乙醇-鹽酸為提取溶劑時，沒食子酸等6種成分均能完全出峰且色譜圖基線平穩，干擾較小，故選擇乙醇-鹽酸為提取溶劑。

本研究得到的龍眼葉最優提取工藝為乙醇體積分數100%，料液比1∶7（g/mL），提取時間90 min，提取溫度80 ℃。經驗證，沒食子酸等6種成分的平均綜合評分為97.54 分，與預測綜合評分（99.05 分）的相對誤差為1.55%；表明所得提取工藝穩定、可行，可用于龍眼葉提取工藝的優化。

綜上所述，Box-Behnken 響應面法結合多指標綜合評分法可用于龍眼葉的提取工藝優化，且所得最優提取工藝穩定、可行。