基于指紋圖譜和化學模式識別分析的車前子與炒車前子質量評價Δ

何子驥，伍斌璽，李雨昕，沈志濱，劉奇越，王秋紅，#（.廣東藥科大學中藥學院，廣州 50006；.黑龍江中醫藥大學教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室/黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，哈爾濱 50040；.廣州采芝林藥業有限公司，廣州 5045）

車前子為車前科植物車前Plantago asiaticaL.或平車前Plantago depressaWilld.的干燥成熟種子[1]，其性寒，味甘，具有清熱利尿通淋、滲濕止渴、明目、祛痰的功效，主要用于治療熱淋濕痛、水腫脹滿、暑濕泄瀉、目赤腫痛、痰熱咳嗽等[2]。車前子主要含有多糖類、苯乙醇苷類、環烯醚萜類、三萜類、黃酮類、甾醇及生物堿類等化學成分[3]，具有利尿、消炎、降血糖、降血壓、調血脂、抗氧化和調節免疫等藥理作用[4]。

炒車前子為車前子炒制后的炮制品，除用于便秘的療效顯著外[5]，還可增強清熱利尿、滲濕通淋的功效[6]。目前，關于炒車前子的研究主要為其炮制工藝優化[7－9]，以及以京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含量為指標的質量標準研究[10]，加之關于車前子炒制前后整體化學成分變化以及炒車前子指紋圖譜的研究較少，這使得難以綜合評價車前子炒制前后的整體質量和特征成分。

中藥指紋圖譜技術結合聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘回歸分析等化學模式識別分析能更加客觀、全面地反映藥材質量，已被廣泛用于中藥材的質量控制研究[11]。本課題組前期以2020年版《中國藥典》（一部）車前子藥材項下的京尼平苷酸、毛蕊花糖苷含量為指標，對車前子及炒車前子進行含量測定，結果顯示，車前子中京尼平苷酸的含量為0.51%～1.38%，毛蕊花糖苷的含量為0.67%～1.06%；炒車前子中京尼平苷酸的含量為0.98%～1.47%，毛蕊花糖苷的含量為0.54%～0.94%，均符合藥典規定[1]?；诖?，本研究在車前子及炒車前子含量符合《中國藥典》規定的基礎上，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法建立了15批車前子與15批炒車前子的指紋圖譜，同時結合化學模式識別分析方法比較車前子與炒車前子的質量差異，旨在為完善車前子與炒車前子的質量標準提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Waters Alliance 型HPLC儀（美國Waters公司），MS105DU型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司），Milli-Q Advantage A10 型臺式純水系統（德國Millipore 公司），C21-WK2102 型多功能電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

京尼平苷酸對照品（批號MB6001-S，純度＞98%）、毛蕊花糖苷對照品（批號MB6742，純度＞98%）均購自大連美侖生物技術有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

15 批車前子藥材（編號S1～S15）均于2019 年購自廣州采芝林藥業有限公司，經廣東藥科大學中藥學院中藥資源系劉基柱教授鑒定為車前科植物車前P.asiaticaL.的干燥成熟種子。取15 批干凈的車前子藥材（編號S1～S15）適量，置于預熱電磁爐中，炒至略有爆聲并有香氣逸出時，取出放涼，即得炒車前子（對應編號為S16～S30）。15批車前子與15批炒車前子來源信息見表1。

表1 15批車前子與15批炒車前子來源信息

2 方法與結果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 以SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-0.5%乙酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～5 min，5%A；5～15 min，5%A→20%A；15～25 min，20%A→60%A；25～30 min，60%A；30～35 min，60%A→5%A）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 取車前子或炒車前子樣品粉末（過三號篩）1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密稱定，加60%甲醇50 mL，精密稱定；連接冷凝管加熱回流提取2 h，放冷，再次精密稱定，用60%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過；取續濾液，于25 ℃以13 000 r/min離心10 min，取上清液，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取京尼平苷酸、毛蕊花糖苷對照品各0.1 mg，分別加60%甲醇，制成京尼平苷酸、毛蕊花糖苷質量濃度均為0.1 mg/mL 的單一對照品溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S11），按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣測定6 次，以京尼平苷酸為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.37%（n＝6），相對峰面積的RSD 為0.56%～1.62%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S11），分別于室溫下放置0、2、4、6、8、16、18、24 h 時按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以京尼平苷酸為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD 為0.09%～0.41%（n＝8），相對峰面積的RSD 為0.63%～1.95%（n＝8），表明供試品溶液于室溫下放置24 h 內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 取車前子（編號S11），共6 份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以京尼平苷酸為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD 為0.05%～0.41%（n＝6），相對峰面積的RSD 為0.27%～1.75%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.1.7 HPLC 指紋圖譜的建立 分別取15 批車前子及15 批炒車前子樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，將得到的色譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，采用中位數法，車前子以S11樣品為對照圖譜，炒車前子以S26 樣品為對照圖譜（因S11、S26 樣品的色譜峰峰形較好），時間窗寬度設置為0.2，得到15 批車前子及15 批炒車前子的HPLC 疊加指紋圖譜和對照圖譜。結果顯示，15批車前子有18個共有峰，15批炒車前子有13個共有峰。經對比發現，車前子與炒車前子共有8個共有峰，即車前子指紋圖譜中的峰1～峰3、峰6、峰13～峰16，炒車前子指紋圖譜中的峰1～峰3、峰7、峰10～峰13（車前子中的峰6、峰13～峰16 分別與炒車前子中的峰7、峰10～峰13對應，為方便后文描述，將對應的共有峰依次標記為峰A～峰H）。15批車前子與15批炒車前子的HPLC疊加指紋圖譜見圖1，對照圖譜見圖2。

圖1 15批車前子與15批炒車前子的HPLC疊加指紋圖譜

圖2 車前子與炒車前子的對照圖譜

2.1.8 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）》對15 批車前子及15 批炒車前子進行相似度評價。結果顯示，30批樣品與對照圖譜的相似度均大于0.920，表明車前子炒制前后的化學成分種類相似。結果見表2。

表2 15批車前子與15批炒車前子的相似度評價結果

2.1.9 共有峰的指認 將車前子及炒車前子的對照圖譜（圖2）與對照品的色譜圖（圖3）進行比較，共指認了2個共有峰，分別為車前子中的峰6（京尼平苷酸）、峰13（毛蕊花糖苷），炒車前子中的峰7（京尼平苷酸）、峰10（毛蕊花糖苷）。由于京尼平苷酸的分離度較好，含量較高，鄰近峰較少，易于區分，故選擇京尼平苷酸為參照峰，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，車前子中各共有峰相對保留時間的RSD 為0.08%～0.55%，相對峰面積的RSD為3.86%～44.09%；炒車前子中各共有峰相對保留時間的RSD 為0.08%～0.64%，相對峰面積的RSD 為12.51%～58.61%。各樣品相對保留時間的RSD 差異較小，相對峰面積的RSD差異較大，表明同一品種、不同產地、不同批次車前子炒制前后所含化學成分的種類具有較高的相似度，但含量存在較大差異。

圖3 京尼平苷酸與毛蕊花糖苷對照品的HPLC圖

2.2 聚類分析

以15批車前子與15批炒車前子共有峰的峰面積為變量進行標準化處理，使用SPSS 25.0軟件，采用質心聚類法，以平方歐氏距離為測度進行聚類分析。結果顯示，當歐氏距離為5時，30批樣品可聚為6類，其中S1為一類，S2～S5 為一類，S6～S15 為一類，S16～S17 為一類，S18～S20 為一類，S21～S30 為一類；當歐氏距離為10 時，30 批樣品可聚為3 類，其中S1～S5 為一類，S6～S15、S21～S30為一類，S16～S20為一類；當歐氏距離為16 時，30 批樣品可聚為2 類，S1～S5、S16～S20 為一類，S6～S15、S21～S30為一類。結果見圖4。

圖4 15批車前子與15批炒車前子的聚類分析樹狀圖

2.3 主成分分析

以15批車前子與15批炒車前子共有峰的峰面積為變量，使用SPSS 25.0軟件進行主成分分析。結果顯示，前2 個主成分的累計方差貢獻率為82.575%，表明前2個主成分可以反映樣品的質量。通過碎石圖可知，前2個主成分的曲線陡峭，后面6個主成分的曲線較平緩，表明前2個主成分在車前子及炒車前子中具有重要作用。結果見表3、圖5。

圖5 車前子與炒車前子的主成分分析碎石圖

表3 8個共有峰的特征值及方差貢獻率

主成分載荷的絕對值越大，表示主成分的變量代表性越大[12]。采用SPSS 25.0 軟件進行主成分因子載荷矩陣。結果顯示，峰A、峰C、峰E、峰F、峰H在主成分1上具有較高的載荷值，表明這5 個峰對主成分1 的影響較大；峰D、峰G在主成分2上具有較高的載荷值，表明這2個峰對主成分2 的影響較大；峰B 在主成分1、主成分2上的載荷值均不高，表明其對主成分1、主成分2的影響較小。結果見表4。

表4 車前子與炒車前子的主成分因子載荷矩陣

綜合評分能夠反映樣品的整體質量，評分越高表明樣品的整體質量越好[13]。采用方差貢獻率計算15 批車前子與15批炒車前子的綜合評分。使用SPSS 25.0軟件得到主成分1（Z1）和主成分2（Z2）的評分分別為Z1＝0.445×峰A－0.326×峰B+0.347×峰C－0.165×峰D－0.433×峰E+0.418×峰F+0.266×峰G－0.339×峰H；Z2＝0.081×峰A－0.378×峰B+0.062×峰C+0.631×峰D+0.199×峰E－0.029×峰F+0.532×峰G+0.356×峰H。其中，峰A～峰H 為共有峰的峰面積，Z1、Z2的系數為主成分1、2的載荷值與特征值開平方的比值，按公式計算綜合評分（Z），Z＝Z1×主成分1的方差貢獻率+Z2×主成分2的方差貢獻率。結果顯示，車前子的綜合評分均小于0，炒車前子的綜合評分均大于0（S24樣品除外），表明綜合評分可以較好地區分車前子與炒車前子。結果見表5。

表5 15 批車前子與15 批炒車前子的綜合評分結果及排序

2.4 正交偏最小二乘回歸分析

以15批車前子與15批炒車前子共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA-P 14.1軟件進行正交偏最小二乘回歸分析。結果顯示，車前子均位于得分圖的左側，炒車前子均位于得分圖的右側，二者能明顯分開。模型累計解釋能力參數R2X（cum）為0.991，R2Y（cum）為0.965，模型預測度Q2（cum）為0.942，均大于0.500，表明模型構建成功，預測能力較強，擬合度好[14]。結果見圖6。

圖6 15 批車前子與15 批炒車前子的正交偏最小二乘回歸分析得分圖

當變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值大于1 時，表示變量對整體的貢獻較大[15]，故以VIP 值大于1 為標準，得到貢獻相對較大的3個峰，分別為峰E（毛蕊花糖苷）、峰D（京尼平苷酸）、峰G，表明這3個峰對車前子與炒車前子的貢獻較大，推測其可能是影響車前子與炒車前子質量差異的標志性成分。變量的點距離原點的距離越遠，表示變量對模型的影響越大[16]。結果顯示，峰E、峰D、峰G 對車前子與炒車前子的影響較大。結果見圖7、圖8。

圖7 8個共有峰的VIP值

圖8 15 批車前子與15 批炒車前子的正交偏最小二乘回歸分析載荷圖

3 討論

本課題組前期分別對不同流動相（甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.5%乙酸溶液）、不同流速（0.5、1.0 mL/min）、洗脫時間（35、45、55 min）、柱溫（30、35 ℃）等進行考察。結果顯示，采用本研究所用的色譜條件時，各色譜峰均能較好地分離，基線相對平穩。

指紋圖譜結果顯示，15批車前子有18個共有峰，炒車前子有13個共有峰，車前子與炒車前子共有8個共有峰，共指認了2 個共有峰，分別為車前子中的峰6（京尼平苷酸）、峰13（毛蕊花糖苷），炒車前子中的峰7（京尼平苷酸）、峰10（毛蕊花糖苷）。15批車前子與對照圖譜的相似度均大于0.980，15 批炒車前子與對照圖譜的相似度均大于0.920，相似度較高，表明不同產地車前子、炒車前子的化學成分種類相似，具有較好的一致性。

聚類分析結果顯示，當歐氏距離為10時，30批樣品可聚為3類，其中S1～S5為一類，S6～S15、S21～S30為一類，S16～S20 為一類；當歐氏距離為16 時，30 批樣品可聚為2 類，S1～S5、S16～S20 為一類，S6～S15、S21～S30 為一類，表明江西省和山東省產車前子有一定的相似性，能與湖北省產車前子區分開。主成分分析結果顯示，前2個主成分的累計方差貢獻率為82.575%，車前子的綜合評分均小于0，炒車前子的綜合評分均大于0（S24 樣品除外），表明炒車前子的整體質量較好。正交偏最小二乘回歸分析結果顯示，峰E（毛蕊花糖苷）、峰D（京尼平苷酸）和峰G 可能是影響車前子與炒車前子質量差異的標志性成分，其可能與地理環境、氣候條件、種植模式、采收期等有關。

綜上所述，本研究所建指紋圖譜穩定、簡便快速，結合化學模式識別分析可用于評價車前子與炒車前子的質量。毛蕊花糖苷、京尼平苷酸和峰G所代表的成分可能是影響車前子與炒車前子質量差異的標志性成分。