VSMC源KLF5對腹主動脈瘤形成中作用及機制的研究*

孟 麗 朱 艷 徐彥楠 馬 冬 周晨明

河北醫科大學 1 電鏡實驗中心 2 教學實驗中心，河北省石家莊市 050017； 3 華北理工大學公共衛生學院

腹主動脈瘤(Abdominal aortic aneurysm, AAA)是一種常見的老年退行性血管疾病，大多數AAA患者常無癥狀，然而瘤體一旦破裂預后極差，病死率高達90%，目前其發病機制仍不明確，未見有效預防和治療的藥物[1-2]。轉錄因子KLF5是血管重塑相關重要因子[3]。課題組前期研究發現，小鼠髓系細胞KLF5表達缺失能夠抑制AAA的形成[4]，而細胞血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)中KLF5表達缺失將對AAA的表型產生何種影響尚鮮有研究報道。因此，本研究采用CaPO4誘導VSMCKLF5-/-小鼠和野生型小鼠(Wild type，WT)AAA模型并對瘤體組織進行病理分析、基因芯片篩查和差異表達基因的生物信息學分析及驗證，探討VSMC中KLF5表達在早期AAA發病中的分子機制，為尋找潛在治療靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性的C57BL/6小鼠，SPF級，由河北醫科大學實驗動物中心提供。實驗分為VSMCKLF5-/-組和WT組。VSMCKLF5-/-組為3只6～8周齡雄性VSMCKLF5-/-小鼠；WT組為3只6～8周齡雄性WT小鼠，均由本實驗室繁殖提供。購買血管平滑肌特異性表達Cre重組酶工具小鼠與引進的KLF5flox/flox轉基因小鼠交配，獲得Cre-flox/+/KLF5-cre小鼠。再利用Cre-flox/+/KLF5-cre小鼠互相交配，獲得血管平滑肌特異性KLF5基因條件敲除(VSMCKLF5-/-)小鼠。鼠尾采血PCR法鑒定基因型，Western blot證實血管組織中KLF5表達的缺失。

1.2 方法

1.2.1 CaPO4誘導小鼠AAA模型[5]:將小鼠進行持續麻醉，無菌條件下進行腹部手術，暴露腹主動脈血管，分離腎動脈分支至髂總動脈血管，先后包裹浸有CaCl2和PBS的無紡布條10min和5min，取出布條后用生理鹽水沖洗，縫合。術后14d，再次以10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，剖腹，分離小鼠腹主動脈，并測量腹主動脈最大直徑(d2)和瘤旁血管直徑(d1)，以計算出d2/d1小鼠腹主動脈直徑膨脹度，此比值≥2為模型構建成功的客觀指標。隨后取出腹主動脈組織進行石蠟包埋和液氮凍存。

1.2.2 蘇木精—伊紅染色(Hematoxylin-Eosin staining):對石蠟包埋組織進行切片，厚度4μm。取主動脈瘤部位切片，將切片脫蠟至水。參考試劑盒說明書稀釋染液并進行染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用×50和×400放大倍數進行鏡檢。

1.2.3 血管組織總RNA的提取及mRNA表達譜的檢測：剪碎小鼠損傷腹主動脈組織，置于RNA-Solv的勻漿套管中勻漿(冰盒中操作)，試劑盒提取總RNA濃度>1μg，OD260/280比值在1.8～2.0范圍內?；蛐酒瑱z測由康成生物有限公司完成。

1.2.4 差異表達基因的富集分析：將芯片篩查的Fold Change Absolute>2的全部上調基因或下調基因輸入Metascape在線分析網站，對差異表達基因進行GO和KEGG pathway富集分析，分別得到差異基因在生物學過程、分子功能和細胞成分三個方面的富集分析和KEGG通路富集分析(P值分別設為0.01和0.05)。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達：取瘤樣病變血管組織50mg，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑冰浴勻漿，離心取上清，BSA法測定總蛋白濃度。取蛋白樣品加5×電泳緩沖液，加熱至變性，后凝膠電泳，轉膜，脫脂牛奶封閉，一抗采用兔抗Stk3、Rassf4、Wwtr1抗體4℃孵育過夜(Proteintech)，HRP標記羊抗兔二抗孵育，洗脫、發光，曝光顯色。采用Image J軟件進行光密度掃描進行半定量分析。

2 結果

2.1 HE染色觀察VSMC中KLF5基因缺失對AAA的膨脹變化 HE染色結果顯示VSMCKLF5-/-組和WT組小鼠膨脹度均達到AAA標準，VSMCKLF5-/-組術后膨脹度明顯大于WT組(3.25±0.35 VS 2.31±0.27)，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1～2。

圖1 腹主動脈HE染色切片a.WT組(第一張×50, 第二張×400) b.VSMCKLF5-/-組(第一張×50, 第二張×400)

圖2 腹主動脈直徑膨脹度測量結果與WT組相比，*P<0.01，n=3

2.2 CaPO4損傷小鼠腹主動脈組織中mRNA表達譜分析 mRNA表達譜前50個基因表達差異熱圖分析結果如圖3所示，排名前10的上調和下調差異基因的表達倍數見表1。組織芯片結果顯示：與WT組比較，VSMCKLF5-/-組Hippo信號通路失調相關基因Stk3、Rassf4、Wwtr1分別表達上調3.73、2.34、2.06倍。

表1 VSMCKLF5-/-和WT小鼠AAA組織mRNA表達譜

圖3 CaPO4誘導VSMCKLF5-/-和WT小鼠AAA組織差異表達基因熱圖分析a.前50個上調差異基因表達的熱圖 b.前50個下調差異基因表達的熱圖

2.3 GO功能和KEGG pathway富集分析 為了探討VSMC中KLF5調節差異表達基因在AAA形成中的生物學功能，利用Metascape在線數據庫進行GO富集分析。分析發現，上調差異表達基因的生物學功能主要富集在轉錄共激活因子活性、細胞骨架重塑等。下調差異表達基因的學功能主要富集在前體代謝產物和能量的產生等。為了篩查VSMC中KLF5調節相關基因參與AAA形成中的信號通路，筆者對差異表達基因進行KEGG pathway分析，結果如圖4所示：上調差異基因KEGG分析中，Hippo信號通路富集最為顯著；下調基因KEGG分析中，碳代謝、丙酮酸代謝、線粒體代謝、檸檬酸循環、磷酸戊糖途徑等與細胞能量代謝相關的通路富集顯著。

圖4 差異基因的KEGG pathway分析a.上調基因KEGG的pathway分析 b.下調基因KEGG的pathway分析

2.4 Hippo信號通路相關基因的蛋白表達分析 為了進一步證實VSMC中KLF5調節相關基因影響AAA形成的重要分子通路，采用Western blot 進一步證實，與CaPO4誘導的WT小鼠AAA組織比較，Stk3、Rassf4、Wwtr1在CaPO4誘導的VSMCKLF5-/-小鼠AAA血管組織中表達明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 Western blot檢測來自小鼠CaPO4損傷的血管組織中Stk3、Rassf4、Wwtr1蛋白表達與WT組比較，*P<0.05， **P<0.01，n=3。

3 討論

KLFs家族作為基礎轉錄因子，廣泛存在于真核生物中，在細胞發育、分化、生長及凋亡等過程中發揮重要的調控作用[6]。KLF5屬于其中一員，調控多種與心血管相關基因的表達，先前的研究表明KLF5在應對外部壓力及心血管重構中起著重要的作用[7]。也有研究證實 KLF5在巨大的未破裂動脈瘤中高表達[8]。提示KLF5與AAA的形成和發展有關。VSMC在維持動脈功能方面起著重要的作用，其結構功能的失調導致正常收縮狀態的喪失以及增殖與凋亡動態平衡的打破均是促進動脈瘤形成的原因[9]。本課題組通過前期的研究發現，小鼠髓系細胞KLF5表達缺失能夠抑制AAA的形成[4]，而VSMC中KLF5表達缺失將對AAA表型產生的影響尚未有報道。因此，本研究通過CaPO4誘導VSMCKLF5-/-和WT小鼠產生的AAA模型進行KLF5 在VSMC中表達的作用機制的研究。

HE染色結果顯示，VSMKLF5-/-組和WT組小鼠膨脹度均達到AAA標準，且血管正常結構破壞，中膜變薄，VSMCKLF5-/-組術后膨脹度明顯大于WT組。提示VSMC中KLF5表達缺失可促進AAA的形成。通過mRNA芯片篩查并對差異基因進行生物信息學分析，并發現證實了Hippo信號通路中Stk3、Rassf4、Wwtr1蛋白表達參與AAA的形成。通過GO分析顯示上調差異基因在生物學功能方面富集于轉錄共激活因子活性、微管正端結合、細胞骨架、紡錘體等；下調基因在生物學過程中富集在前體代謝產物和能量的產生等。KEGG分析發現Hippo信號通路在AAA形成中受KLF5調節影響最為顯著，該通路主要通過調節細胞增殖、分化、凋亡、能量代謝在器官生長、發育、干細胞穩態、癌癥和心血管疾病發生發展中發揮著重要作用[10]，Hippo信號通路主要由MST1/2、LATS1/2、YAP、TAZ(WWTR1)組成[11]，其中YAP誘導VSMCs表型轉換，參與主動脈壁的重構，促進由收縮表型的 VSMCs向合成表型的VSMCs轉化，主要改變為收縮功能消失，粗面內質網和高爾基體等細胞器增多，合成和分泌功能增強[12-14]，導致膠原蛋白和基質金屬蛋白酶的合成增加，而這兩者都可以促進膠原蛋白的沉積和彈性蛋白的降解，因而造成主動脈壁的彈性下降，最終導致主動脈瘤[15]。為了進一步證實VSMC中KLF5調節相關基因影響AAA形成的重要分子通路，本研究選擇Hippo信號通路相關基因蛋白Stk3、Rassf4、Wwtr1進行分析。MST激酶(MST1/2，其中MST2即STK3)通過調控LATS激酶促進心血管細胞凋亡[16-17]，并且影響YAP的磷酸化；Rassf4通過激活MST1[18-19]來對主動脈瘤起作用；Wwtr1和YAP功能相似[20]，Wwtr1表達上調可能會影響YAP的表達及磷酸化，但尚未有研究證實。通過Western blot證實Stk3、Rassf4、Wwtr1在VSMCKLF5-/-組中表達明顯升高，提示VSMCKLF5-/-組小鼠VSMC中敲除KLF5后通過上調Hippo信號通路相關基因蛋白Stk3、Rassf4、Wwtr1促進AAA的形成。

另外，本研究結果與課題組前期關于小鼠髓系KLF5缺失研究結果正好相反，提示不同細胞中KLF5基因表達變化在AAA形成中的生物學功能是不同的。因此，在進行關于KLF5的表達和細胞生物學功能在心血管疾病中的研究中應考慮到異種細胞的差異性。

綜上所述，本研究利用VSMCKLF5-/-小鼠、高通量基因芯片篩查和生物信息學分析方法，并通過實驗證實血管平滑肌細胞中敲除KLF5后，通過上調Stk3、Wwtr1和Rassf4的表達參與Hippo信號通路的調節，進而促進AAA的發生，即血管平滑肌細胞中KLF5可能通過調控Hippo通路維持血管穩態并抑制AAA的形成。這也為AAA的發病機制及靶向藥物的研發提供實驗依據。