綠色低共熔溶劑提取黃酮類化合物的研究進展

付佳樂，耿 直

(陜西國際商貿學院醫藥學院，陜西 西安 712046)

黃酮類化合物是一類具有2-苯基色原酮結構的化合物。因其第一位上的氧原子與強酸結合成鹽，衍生物多呈黃色，故又稱黃堿素或黃酮。黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌、促進機體微循環、降低膽固醇等多種藥理活性，可以降低心腦血管疾病的發生率，也可以改善心腦血管疾病的癥狀。

作為一種新型的環境友好型綠色溶劑，且能增強微波和超聲的提取效果，低共熔溶劑在中藥有效成分的提取方面有著巨大優勢，在替代傳統溶劑和毒性溶劑上存在巨大潛力。作者介紹了低共熔溶劑的分類，綜述了低共熔溶劑提取黃酮類化合物的研究進展，以期為后續黃酮類化合物的開發應用和低共熔溶劑的使用提供參考。

1 低共熔溶劑的分類

文獻[1,4]報道，根據氫鍵供體與氫鍵受體種類的不同，將低共熔溶劑分為6類。

1.1 季銨鹽-無水金屬氯化物

這是早期研究最多的一種低共熔溶劑體系，其金屬氯化物部分為AlCl3或Fe、Ag、Cu、Cd、Zn、Sn、La等的氯化物，其使用會受到環境濕度的影響。

1.2 季銨鹽-含結晶水金屬氯化物

為擴大適用范圍，引申出該類低共熔溶劑。該類金屬氯化物含有一定的水分，生產成本更為低廉，且不受生產環境濕度的影響，因此，能夠廣泛應用于工業化大生產。

1.3 季銨鹽-酰胺、羧酸、醇等

季銨鹽組分常選用氯化膽堿。氯化膽堿無毒，能夠進行批量生產，成本非常低廉，且能夠生物降解，適用于大規模應用。酰胺、羧酸、醇等組分，通常采用碳酰胺、乙酰胺、乙酸、檸檬酸、苯甲酸、戊二酸、丙三醇、丙二醇、1,4-丁二醇等。該類低共熔溶劑在中藥活性成分的提取中較為常用。

1.4 有機配體(尿素、乙酰胺、乙二醇等)-金屬鹵化物

無機陽離子因其本身結構性質特點不能形成低熔點的共熔物，因此加入有機配體如尿素、乙酰胺、乙二醇等，混合得到過渡金屬共熔物，但該類低共熔溶劑在非水體系中不能離子化。

1.5 天然氨基酸-天然植物酸

以L-脯氨酸-草酸、L-脯氨酸-葡萄糖、甜菜堿-蘋果酸、鹽酸甜菜堿-檸檬酸等為代表的天然低共熔溶劑，其分子間氫鍵作用更為明顯，并與水發生劇烈反應。該類低共熔溶劑在天然產物的開發研究中具有廣闊前景。

1.6 三元組分體系

隨著學者對低共熔溶劑研究的不斷深入，逐漸衍生出如以多元醇-酰胺-銨鹽體系(如1,2-丙二醇-氯化膽堿-尿素)或甜菜堿-脯氨酸-蔗糖(或葡萄糖)等三元組分體系，進一步拓寬了低共熔溶劑的應用領域。

2 低共熔溶劑提取黃酮類化合物的影響因素

低共熔溶劑提取黃酮類化合物的影響因素主要包括低共熔溶劑的種類、組分物質的量比、料液比、含水量、提取溫度、提取方法和提取時間等。

2.1 低共熔溶劑的種類

作為影響低共熔溶劑提取黃酮類化合物的最直接因素，不同的氫鍵供體和氫鍵受體會直接影響低共熔溶劑的極性，也會影響低共熔溶劑的黏度。李吉超[6]研究了以氯化膽堿為氫鍵受體，多元醇(乙二醇、1,2-丙二醇、丙三醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、二乙二醇、三乙二醇)為氫鍵供體的低共熔溶劑體系對銀杏葉黃酮的提取，獲得氯化膽堿-乙二醇、氯化膽堿-1,4-丁二醇、氯化膽堿-三乙二醇3種體系的關聯模型。姚金昊等[7]研究了天然低共熔溶劑體系對銀杏葉中黃酮的提取，采用COSMO-RS方法篩選以氯化膽堿為氫鍵受體，尿素、甘油、乳酸、檸檬酸、丙二酸、草酸為氫鍵供體的低共熔溶劑體系，篩選出氯化膽堿-甘油為最佳低共熔溶劑體系。劉丹寧[8]考察了14種氫鍵供體與氯化膽堿、2種乙酸鈉/乙酸銨和乳酸體系對枳實黃酮類化合物的提取，篩選出氯化膽堿-醋酸為最佳低共熔溶劑體系。都宏霞等[9]研究了茉莉花黃酮的提取，篩選出甜菜堿鹽酸鹽-蔗糖為最佳低共熔溶劑體系；研究了桂花黃酮的提取，篩選出氯化膽堿-山梨醇-1,2-丙二醇為最佳三元低共熔溶劑體系?？梢?，提取黃酮類化合物時，氫鍵受體多用氯化膽堿，其它低共熔溶劑體系報道較少。

2.2 低共熔溶劑組分的物質的量比

文獻報道，低共熔溶劑組分的物質的量比對有效成分提取率的影響并不十分顯著，部分研究中并不將其作為影響因素考察[9-11]，也有學者對低共熔溶劑組分的物質的量比進行了較為系統的研究。李吉超[6]分別制備了組分物質的量比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6的低共熔溶劑體系，研究了銀杏葉黃酮的提取。Wei等[12]采用BBD實驗設計法，對黃芩中的4種黃酮類化合物進行提取，發現以氯化膽堿和乳酸組成的低共熔溶劑體系，在其物質的量比為1∶2時，4種黃酮類化合物的提取率最高。Qi等[13]采用氯化膽堿-甜菜堿鹽酸鹽-乙二醇低共熔溶劑體系，在其物質的量比為1∶1∶2時，犬問荊中4種黃酮類化合物的提取率均達到最高。夏伯侯等[14]研究了6種不同低共熔溶劑體系提取夏枯草總黃酮，發現隨氯化膽堿-乙二醇的物質的量比的增大，總黃酮提取率呈上升趨勢，隨氯化膽堿-丙三醇、氯化膽堿-2,3-丁二醇的物質的量比的增大，總黃酮提取率呈先升高后下降的趨勢；氯化膽堿-1,2-丙二醇、氯化膽堿-1,4-丁二醇則在物質的量比較小時，表現出較高的總黃酮提取率。

2.3 料液比

料液比是低共熔溶劑對活性成分提取率影響最主要的因素，料液比的減小(即提取溶劑用量的增加)會提高體系的溶解性，但料液比超過一定值后，對活性成分的提取趨于飽和。熊蘇慧等[15]以醋酸鈉-乳酸提取玉竹總黃酮，研究料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g∶mL，下同)對總黃酮提取率的影響。都宏霞等[9]研究低共熔溶劑提取茉莉花黃酮類化合物，在料液比分別為1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160時，茉莉花黃酮提取率在6～13 mg·g-1范圍內。隨著料液比的減小，物質與溶劑的接觸面積增大，有益于有效成分的浸出，但料液比過小時，溶液稀釋，提取率反而下降，這也證實隨著提取溶劑用量的增加，有效成分提取率升高，但溶劑用量過多亦會使提取量達到飽和狀態。且若采用超聲輔助低共熔溶劑法進行提取，料液比過小，還會引起因溶劑過多，超聲波能量傳導受阻，從而抑制有效成分的提取[9-10]。

2.4 含水量

低共熔溶劑一般黏度較大，主要原因可能是氫鍵供體和氫鍵受體間產生氫鍵吸附作用，從而導致低共熔溶劑組分的流動性降低，一般來說，低共熔溶劑比傳統的提取溶劑黏度大1～2個數量級，這也限制了低共熔溶劑的使用，因此在進行活性成分提取時，研究人員常引入一定量的水，以降低低共熔溶劑的黏度[3]。熊蘇慧等[15]在研究低共熔溶劑提取玉竹總黃酮時發現，當低共熔溶劑含水量為22%時，提取率最高；當含水量進一步升高時，提取率反而下降，這也與氫鍵吸附原理的預測相一致。也有學者指出，雖然含有一定的水能夠加速植物藥材的膨脹，但是過高的含水量會使得溶劑極性增大，反而不利于黃酮類化合物的浸出[16]。

2.5 提取溫度

一般來說，提取溫度越高，有效成分的提取率越高，但過高的提取溫度可能會導致細胞破壞，同時升高提取溫度會降低低共熔溶劑的黏度。研究[11,17]發現，控制提取溫度在50～80 ℃范圍內，能夠較好完成對黃酮類化合物的提取。結合超聲方法對植物中黃酮類化合物進行提取，當提取溫度達到70 ℃時，提取率最高；提取溫度高于70 ℃時，則可能由于黃酮類化合物基本結構被破壞，提取率下降。這一提取溫度恰與大多數低共熔溶劑熔點在70 ℃以內這一現象相吻合。因此，在低共熔溶劑提取過程中，控制提取溫度在50～80 ℃范圍內，一方面保護了黃酮類化合物結構，另一方面也滿足了低共熔溶劑呈液態提取這一參數條件。

2.6 提取方法

低共熔溶劑提取黃酮類化合物的方法除一般提取法外，還包括超聲提取法、微波輔助提取法、負壓空化提取法和冷凍輔助法等。熊蘇慧等[15]采用超聲輔助提取法，以醋酸鈉-乳酸為提取溶劑，玉竹總黃酮的提取率達20.13 mg·g-1，比傳統溶劑提取高1.51～2.26倍。Wei等[12]采用微波輔助法對黃芩中4種黃酮類化合物進行提取，提取時間為12 min，提取率相比于傳統工藝大幅提升。Wang等[17]通過微波輔助法和超高壓輔助法提取黃芩中黃芩苷，其提取率分別為10.696%和11.680%。此外，還有團隊研究酶法提取技術，以氯化膽堿-尿素為提取溶劑，進行生物提取，黃芩苷轉化率達90%以上[18]。崔琦[19]比較了微波輔助法和超聲輔助法對沙棘葉中5種黃酮類化合物的提取效果，結果發現，微波輔助法提取率明顯優于其它方法。Qi等[13]結合負壓空化法對比傳統的甲醇提取法和超聲輔助提取法對犬問荊中4種黃酮類化合物的提取效果，結果表明，負壓空化提取法在低共熔溶劑的應用方面也具有良好的發展前景。Nam等[20]提出采用冷凍輔助法對槐花中黃酮類化合物進行提取，結果表明，提取率比傳統提取法的高14%。

2.7 提取時間

提取時間延長，可以促進物質有效成分的溶出，但提取時間過長又會導致物質成分結構因熱效應而遭到破壞。采用超聲輔助、微波輔助等技術可以顯著縮短提取時間。孫平等[11]采用超聲輔助法提取野菊花中黃酮類化合物，發現當提取時間為40 min時，提取率最高，但提取時間延長到60 min時，提取率反而下降，這可能是由于超聲波的強機械效能導致物質發生分解。在微波輔助提取過程中，提取時間一般為10～15 min[17,19]。負壓空化提取法提取時間則為4 min左右[20]，明顯提高了提取效率。

3 低共熔溶劑提取黃酮類化合物的其它研究

3.1 生物活性

文獻報道，黃酮類化合物具有顯著的抗氧化活性，但經低共熔溶劑提取的黃酮類化合物比傳統方法具有更高的抗氧化活性，值得學者關注和研究。Nam等[20]通過冷凍輔助法，以L-脯氨酸-甘油(2∶5，體積比)為提取溶劑對槐花中黃酮類化合物進行提取，并對其抗氧化活性進行研究，結果顯示，低共熔溶劑提取物比傳統溶劑提取物具有更顯著的抗氧化活性。孫悅等[21]采用氯化膽堿-檸檬酸為溶劑提取鷹嘴豆黃酮，并研究其對DPPH自由基、·OH、ABTS自由基的清除作用，以抗壞血酸(VC)為對照，結果顯示，當黃酮濃度達到0.5 mg·mL-1和1.5 mg·mL-1時，黃酮類化合物均具有明顯的抗氧化活性。崔琦[19]通過微波輔助法，以氯化膽堿-1,4-丁二醇為提取溶劑，結合大孔樹脂純化沙棘葉中黃酮類化合物，通過計算IC50值研究其抗氧化活性。除抗氧化作用外，劉丹寧[8]采用超聲輔助法優化枳實黃酮的低共熔溶劑提取工藝，并對腹瀉小鼠模型進行給藥，結果發現，低共熔溶劑提取枳實黃酮對于腹瀉小鼠癥狀有明顯改善，并且對豐富腸道菌群有明顯促進作用。

3.2 低共熔溶劑的回收

目前，低共熔溶劑在使用過程中存在低揮發性的難題，使得提取物難以與低共熔溶劑分離，因此，一般情況下常通過大孔樹脂對溶劑進行回收，從而達到與提取物分離的目的?；诰G色環保理念，回收后的低共熔溶劑仍可再利用。Gu等[22]運用HPLC對回收的低共熔溶劑進行分析，結果發現，回收的低共熔溶劑與新制備低共熔溶劑基本一致。崔琦[19]采用PD-826、DM-130、D-3520、NKA-9、AB-8和D101等6種大孔樹脂對提取得到的沙棘黃酮進行分離和富集，結果發現，AB-8型大孔樹脂對黃酮類化合物的回收率最高，這也為其它黃酮類化合物的分離提供借鑒，分離后的低共熔溶劑仍可再利用。

4 展望

低共熔溶劑雖在中藥有效成分的提取方面應用較晚，但因其成本低廉、制備簡單、配比選擇廣泛、提取率高、綠色無毒、可回收再利用，有著不可替代的優勢。但是低共熔溶劑在應用過程中仍存在一定的局限性：溶劑黏度過大導致提取物與溶劑不易分離，也有研究報道可采用加入一定比例(5%～20%)的水以降低溶劑黏度，或可采用大孔樹脂分離技術對溶劑進行回收[19]；溶劑配比現主要局限于以氯化膽堿為氫鍵受體，其它報道則較少，且在研究中多研究二元體系，對三元體系的研究較少。在今后的研究中，應加強低共熔溶劑種類研究，擴大選擇范圍；雖然低共熔溶劑是一種綠色溶劑，絕大多數無毒，但少數也具有毒性，低共熔溶劑的毒性和致毒原因也應加強研究；在低共熔溶劑提取黃酮類化合物過程中，加強提取新技術的研發，提高有效成分的提取率。低共熔溶劑提取物的生物活性研究較傳統溶劑的少，也是值得研究的方向。隨著國內外對綠色化學越來越重視，綠色低共熔溶劑對中藥活性成分高效提取的應用值得持續深入研究，對綠色溶劑的標準化建立也是今后綠色化學發展的趨勢和分支。