高等植物氫化酶活性研究進展

宋怡菲， 謝飛， 馬晨， 馬雪梅

北京工業大學環境與生命學部，北京 100124

氫化酶是一類金屬酶，它能夠催化一個簡單的可逆反應，即氫氣的氧化或質子的還原。氫化酶活性已被證實廣泛分布于一些原核生物與衣藻等低等真核生物中，且主要存在于厭氧微生物體內。高等植物的產氫現象也已經在多個研究中得到了報道，如在大麥［1］、擬南芥［2］等植物種子萌發階段的產氫現象［3］，以及豌豆和菠菜葉綠體的產氫現象［4］。除了植物的產氫能力，另一方面，外加氫干預或內源氫氣的產生對植物生長也會產生顯著影響。一些研究表明，H2可能增強植物對生物或非生物脅迫的耐受性［5-9］，并改善蔬菜、鮮花和水果的品質［10-13］。植物生長代謝與氫氣的密切關系暗示了植物體內氫化酶活性存在的可能性，然而，H2在不同植物中引發生理影響的機制及其信號級聯反應目前尚不清楚。研究已經證實植物葉綠體的產氫活性，但鑒于多種植物種子萌發時能夠產氫的現象，結合氫化酶在進化上與線粒體復合物Ⅰ的同源性［14-15］，可以推測植物產氫能力可能是由于其線粒體中存在氫化酶活性。氫化酶體的產氫特性及其與線粒體在進化上的密切關系也提示氫氣的作用目標可能在線粒體內。

近年來，隨著人口增長、氣候變化、自然災害、環境污染和食品安全等問題的加劇，全球農業面臨著重大挑戰。氫分子對作物生長產生良性影響的眾多研究成果表明，氫農業作為氫氣生物學的一種新興應用，可能有助于緩解農業發展中的諸多挑戰。因此，高等植物體內氫化酶活性的研究作為氫農業的理論基礎，值得我們進一步探究。同時，若高等植物線粒體具有氫化酶活性的假說最終能被證實且線粒體中氫化酶的具體定位與其催化特性可以被明確，將有助于理解真核生物的進化過程，同時也會對高等植物線粒體的功能有全新的認識。

1 氫化酶簡介

氫化酶是一類金屬酶，它能夠催化一個簡單的可逆反應，即氫氣的氧化或質子的還原：H2（?H++H-）? 2H++2e-［16］。根據氫化酶催化的特性，可將其分為吸氫酶、放氫酶和雙向氫化酶等類型。根據活性中心所含金屬組成不同，氫化酶可分為三類，即鎳鐵（［Ni-Fe］）、鐵鐵（［Fe-Fe］）和唯鐵（［Fe］）氫化酶［17］。

［Ni-Fe］氫化酶是分布最廣泛的氫化酶，大多數［Ni-Fe］氫化酶都是吸氫型的，主要存在于細菌和古細菌中。雖然［Ni-Fe］氫化酶可以是多聚體，但其至少包含一個異源二聚體核心成分，其中包括一個大的α亞基（約60 kD）和一個小的β亞基（約30 kD），含有鐵硫簇（Fe-S），活性中心鐵原子被小的無機配體（CO和CN-）連接。［Ni-Fe］氫化酶根據系統發育和生理功能可分為5個亞組。這類氫化酶最常見的生理特性是對氧氣耐受和對氫氣的低親和力［16］。

［Fe-Fe］氫化酶主要存在于一些厭氧原核生物和綠藻中。［Fe-Fe］氫化酶可以是單體或二聚酶、三聚酶或四聚酶，含有兩個鐵原子的活性中心（稱為H簇）以及Fe-S簇。［Fe-Fe］氫化酶嚴格厭氧，活性部位會因氧氣暴露而發生變性。大多數［Fe-Fe］氫化酶只產生氫氣，但也有少數具有吸氫酶活性。［Fe-Fe］氫化酶是目前唯一已被證實的在真核生物中存在的氫化酶類型，在綠藻中該酶為單一亞基，定位于細胞的葉綠體內［16］。

［Fe］氫化酶由2個38 kD的同型二聚體組成，催化中心有1個Fe原子。與［Ni-Fe］和［Fe-Fe］氫化酶相比，［Fe］氫化酶不含Fe-S簇。該酶目前只在古細菌中發現，且不被氧氣滅活［16］。

氫化酶的催化中心非常復雜，通常需要一個組裝成熟過程。例如，［Fe-Fe］氫化酶催化中心核心結構Fe-S簇或H簇需要3種成熟酶蛋白HydE、HydF和HydG的協助參與組裝［18］。在含有氫化酶的微生物，尤其是一些厭氧細菌中，產生或消耗氫氣的能力與其代謝和生物學功能密切相關，在這些微生物中氫氣能作為一個可擴散的電子載體來傳遞電子。

2 不同生物中的氫化酶活性

2.1 原核生物的氫化酶活性

氫化酶相關研究最早起源于對一些原核生物氫代謝現象的研究。1931年，研究人員在微生物體內發現了一種能夠將甲酸分解，同時引起氫氣產生的物質，并將其命名為氫化酶［19］。1974年，Chen等［20］從巴氏梭菌W5中分離純化出了可溶性氫化酶。后來，在幾乎所有的固氮型藍藻中都發現了具有消耗H2的氫化酶活性，且在非固氮型藍藻中存在雙向氫化酶活性［21］。

2.2 低等真核生物的氫化酶活性

低等植物中的氫代謝現象多發現于藻類中，且以在萊茵衣藻中的研究居多，如Happe等［22-23］在1993年和1994年的研究中發現，單細胞綠藻萊茵衣藻具有一種高活性的［Fe-Fe］氫化酶HydA1，且其定位于葉綠體中。后續研究發現，當衣藻細胞處于硫元素缺乏的環境時，在數天的光依賴反應中可產生大量H2［24］。另一項研究在萊茵衣藻中分離并鑒定出了除HydA1外的另一種氫化酶 HydA2 的表達［25］。此外，研究證實，添加光合抑制劑能夠顯著抑制柵藻和胞藻的氫化酶活性，減少氫氣的產生［26-27］。低等動物中也有相關報道，例如，Nyvltová等［28］在原生動物的胞漿和線粒體中均發現具有固氮作用的氫化酶樣蛋白的存在。

2.3 高等植物的氫化酶活性

本小節主要從高等植物的氫代謝現象和氫干預對高等植物生長的影響兩方面介紹高等植物氫化酶活性的相關研究進展。

2.3.1 高等植物的氫代謝現象 由于藻類產生的氫氣可以作為生物能源，這在新能源領域有重要價值，因此目前植物中的氫氣代謝研究主要集中于藻類等低等植物。高等植物的氫氣代謝研究相對進展緩慢。1946年，Boichenko等［29］發現體外分離的藻類葉綠體可以產生氫氣，由此推測在某些高等植物體內可能也存在氫化酶。1964年，Renwick等［30］研究證實冬黑麥、蘿卜、豌豆、西紅柿這幾種植物的種子在萌發過程中具有產氫能力。1982年，Mal'tsev等［31］發現離體豌豆葉綠體能夠產生和消耗氫氣，但并無后續研究，此前有關高等植物吸氫酶活性只有這一篇報道。之后，有研究進一步揭示了豌豆葉綠體中的產氫位點位于光系統Ⅱ［4］。近年來，研究陸續發現水稻、苜蓿和擬南芥等高等植物均可產生內源性氫氣［5-6，32］。另外，本團隊的最新研究表明，從綠豆芽下胚軸與辣椒幼苗莖段純化出的質膜中存在同時具有產氫和吸氫活性的氫化酶樣蛋白［33］。不同種高等植物中的氫代謝現象匯總見表1。

表1 不同高等植物中的氫代謝現象Table 1 Hydrogen metabolism in different higher plants

2.3.2 氫干預對高等植物生長的影響 與氫氣的醫學效應相比，氫氣的植物學效應（氫農業相關）研究相對滯后。目前已有研究證據表明，氫氣對植物的生長發育和抗逆性有積極影響［34］。這主要體現在：一方面氫氣可提高植物對生物和非生物脅迫的抗/耐性，如增強耐旱性和耐鹽性、抵御重金屬離子脅迫、緩解冷脅迫和熱脅迫、減輕紫外線或高光傷害、提高抗病性等；另一方面氫氣還參與調控植物生長發育和改善營養品質，如促進種子萌發、參與調控植物不定根和側根的發育、提高蔬菜營養品質、參與水果和花卉保鮮等。氫分子對高等植物的一些生理過程調控匯總詳見表2。雖然已經發現了氫氣的多種植物學效應，但是這些植物學效應的分子機理目前尚未明確。初步研究表明，氫氣植物學效應的分子機制可能涉及miRNA、基因與蛋白表達、激素水平和蛋白翻譯后修飾的調控、還原Fe3+、調節酶活性等［34-35］。

表2 氫分子對高等植物生理過程的調控Table 2 Regulation of some physiological processes in higher plants by hydrogen molecules

3 高等植物線粒體具有氫化酶活性的猜想與依據

3.1 高等植物氫化酶研究現狀與猜想

盡管高等植物產氫現象已有報道，但是目前對催化產氫的關鍵酶蛋白還了解較少。根據與綠藻、細菌中的［Fe-Fe］氫化酶序列同源性，人們已經在擬南芥、苜蓿和水稻中發現了一些［Fe-Fe］氫化酶樣蛋白。擬南芥中的［Fe-Fe］氫化酶樣蛋白被稱為核構架相關蛋白-1（nuclear architecture-related protein 1，NAR-1），該蛋白定位在細胞漿中，參與FeS蛋白的組裝過程，與對非生物脅迫的響應有關［41］。在苜蓿中，［Fe-Fe］氫化酶樣蛋白稱為GOLLUM，定位于核質區域，該蛋白在植物適應環境中氧分壓的改變時發揮重要作用，同時在植物生長發育和細胞周期進程中也是必需的［42］。然而在這些研究中并沒有檢測［Fe-Fe］氫化酶樣蛋白是否能產氫。在另一項研究中雖然檢測到水稻幼苗的產氫特性，同時通過蛋白同源性分析預測了水稻中的氫化酶基因（OsHydA1、OsFhdB和OsHypB），并發現當水稻幼苗的根在受到鹽脅迫時這些基因的表達水平顯著升高，同時檢測到幼苗產氫量也明顯升高［32］，但是該研究沒有對氫化酶蛋白做進一步鑒定，同時也沒有明確幼苗產氫是否由氫化酶催化。

一些研究發現真核細胞線粒體中可能有氫化酶存在，如2013年Nyvltová等［28］在原生動物的胞漿和線粒體中均發現有氫化酶樣蛋白的存在，但目前在高等植物線粒體中還沒有關于氫化酶活性的報道。綜合目前的研究來看，高等植物的氫代謝以及氫化酶研究還處于初步階段。但是結合已有的高等植物的產氫現象和氫干預對植物的明顯影響，植物無葉綠體部分也具有產氫能力的現象以及上述高等植物中發現的氫化酶同源基因與氫化酶樣蛋白的存在，可以初步提出高等植物線粒體具有氫化酶活性的猜想。除了上述猜想依據外，下文將從線粒體與氫化酶體在進化上的同源性以及線粒體復合物Ⅰ與氫化酶的關系進行分析，進一步為該猜想提供更多依據。

3.2 高等植物線粒體具有氫化酶活性的依據

3.2.1 線粒體與氫化酶體在進化上的同源性 線粒體作為真核細胞的最原始特征之一，于不同種真核生物的獨立進化過程中，在形式和功能上逐漸出現多樣化，由此產生了一系列具有不同蛋白質組和表型的同源細胞器。氫化酶體便是在厭氧型原生動物和厭氧型真菌中發現的一種線粒體同源細胞器［43］，它是一種由膜包裹的球狀細胞器，內含氫化酶和氧化還原酶類，可利用［Fe-Fe］氫化酶產生 H2［44］。

關于氫化酶體的起源，目前有兩種假說。第一種假說認為，原始的線粒體內共生體產生了需氧代謝型的線粒體，線粒體隨后通過獲得編碼無氧代謝所必需酶的基因進化為氫化酶體，即氫化酶體是線粒體的進化產物。第二種假說認為，氫化酶體和線粒體起源于同一個兼性厭氧內共生體的祖先，然后在真核生物進化過程中逐漸分化為需氧型和厭氧型。Boxma等［45］的研究表明，在纖毛蟲（Nyctotherus ovalis）中存在一種氫化酶體，其保留了編碼線粒體電子傳遞鏈成分的原始基因組。另外，他們也證實了該氫化酶體對線粒體復合物Ⅰ的抑制劑敏感，并且具有厭氧線粒體的典型生化特性——產生琥珀酸作為一個主要的代謝終產物［46］，這些研究結果為氫化酶體起源于一種厭氧線粒體的觀點提供了新的支持。綜上，線粒體和氫化酶體這種具有氫代謝能力的細胞器的密切關系提示氫氣的作用目標可能在線粒體內。

3.2.2 線粒體復合物Ⅰ與氫化酶的關系 1990年，B?hm等［47］發現線粒體復合物Ⅰ和［Ni-Fe］氫化酶存在同源關系，［Ni-Fe］氫化酶能把氫氣氧化和質子跨膜轉運偶聯起來，這就類似線粒體復合物的功能。2011年，Moparthi等［48］研究發現，復合物Ⅰ的NADH脫氫酶模塊中的G亞基與［Fe］氫化酶類似，而醌模塊中的B和D亞基分別與可溶性［Ni-Fe］氫化酶的小亞基和大亞基相似。同時，在超高溫古生菌強烈熾熱球菌中發現了一種包含14個亞基的膜結合氫化酶，該氫化酶中的膜錨定模塊在結構上與復合物Ⅰ的醌結合Q模塊高度相似［49］。這些證據表明，線粒體和氫化酶存在同源關系，線粒體復合物Ⅰ很可能是從細菌的氫化酶進化而來的。

雖然線粒體與氫化酶的同源關系研究已有很多，但是關于高等植物線粒體是否存在氫化酶活性目前還了解較少。本團隊前期研究［50］發現，在擬南芥、綠豆以及大豆種子萌發過程中均有氫氣產生，并證實這種內源性氫氣的產生與微生物污染無關，這提示氫化酶可能在高等植物中廣泛存在。在對綠豆下胚軸進行細胞組分分離后發現，線粒體組分具有較強的產氫活性。進一步研究發現，純化后的線粒體可以產氫，同時發現在擬南芥和大豆線粒體中也有產氫活性，提示高等植物線粒體可能普遍存在氫化酶活性。為了進一步確定線粒體產氫的具體部位，實驗中加入了不同的線粒體抑制劑來觀察對產氫的影響，結果發現加入魚藤酮（復合物Ⅰ的抑制劑）后產氫量顯著下降，提示線粒體復合物Ⅰ可能存在氫化酶活性。同時研究還發現缺氧可顯著促進線粒體產氫，采用代謝組學方法監測線粒體TCA循環關鍵代謝產物水平變化發現，TCA代謝物水平的變化與線粒體產氫密切相關，其中缺氧時琥珀酸水平在產氫高峰前后相差近百倍，常氧和缺氧狀態下的電子傳遞鏈分別如圖1（A、B）所示。

據此我們提出了高等植物線粒體的產氫機理假說，如圖1所示，將線粒體產氫分為了三個階段。①在常氧狀態下或在缺氧的早期階段（Ⅰ期）：TCA循環正常運行，α-酮戊二酸被氧化為琥珀酸，來自NADH的電子沿復合物Ⅰ的FeS簇轉移到N2位點，再繼續傳遞給Q1st（產生UQ·-的第一個UQ結合位點）和Q2nd（產生UQH2的第二個UQ結合位點）形成UQH2，此時不產生氫氣（泛醌能夠以3種不同的氧化還原狀態存在，即氧化型（UQ）、半還原型［（UQ·-）和還原型（UQH2）］；②在缺氧狀態下（Ⅱ期）：電子通過復合物Ⅲ和復合物Ⅳ傳遞給氧氣的通路被抑制，導致復合物Ⅰ和復合物Ⅱ催化的電子傳遞至復合物Ⅲ的常規通路受到抑制，因此電子在復合物Ⅰ和復合物Ⅱ之間開啟了內循環模式。復合物Ⅰ的電子通過泛醌直接傳遞給復合物Ⅱ，復合物Ⅱ接受電子后催化從延胡索酸到琥珀酸的逆反應并將電子儲存在琥珀酸中。在此階段末期，累積的琥珀酸壓力增大，復合物Ⅱ的催化反應受到反饋抑制，還原型泛醌（UQH2）的電子傳遞被抑制程度增加，導致氧化型泛醌（UQ）缺乏，復合物Ⅰ傳遞到N2位點的電子無法繼續傳遞。進而，復合物Ⅰ→UQ→復合物Ⅱ的通路被抑制，電子在復合物Ⅰ的N2位點附近累積，因此在復合物Ⅰ的N2附近有電子也有質子，并且缺乏與質子競爭接受電子的UQ，于是電子與質子結合開始生成氫氣；③在長期缺氧情況下（Ⅲ期）產生大量氫氣：隨著琥珀酸的積累和UQ的缺乏，電子經復合物Ⅰ→UQ→復合物Ⅱ傳遞給琥珀酸的通路也被抑制，TCA逆行受阻，此時復合物Ⅱ催化的琥珀酸和延胡索酸的雙向反應均被抑制，從α-酮戊二酸到琥珀酸的正常TCA循環又占主導地位，琥珀酸水平進一步增加，從而產生大量氫氣。雖然以上實驗證據已經初步證實高等植物線粒體存在氫化酶活性，但還有許多未解之謎，例如，線粒體氫化酶蛋白的鑒定、產氫的質子來源、線粒體產氫的生理意義等。相信隨著研究的進一步深入，人們對氫氣的作用機理以及線粒體功能會有全新的認識。

圖1 線粒體產氫機制示意圖[50]Fig.1 The schematic diagram of H2evolution mechanism in mitochondria[50]

根據以上內容，高等植物細胞內的多個潛在氫化酶活性位點已被揭示，包括線粒體復合物Ⅰ、葉綠體光系統Ⅱ、分別定位于胞漿和核質的氫化酶樣蛋白NAR-1和GOLLUM，以及在質膜上發現的氫化酶樣蛋白，各位點在細胞中的定位與具體的氫代謝情況詳見圖2。

圖2 高等植物潛在氫化酶的亞細胞定位及其催化活性Fig.2 The subcellular localization and catalytic activity of the potential hydrogenase in higher pants

4 展望

高等植物的氫代謝現象以及氫干預對植物生理過程具有明顯影響，植物無葉綠體部分也具有產氫能力，研究發現高等植物中也存在氫化酶同源基因與氫化酶樣蛋白，氫化酶體與線粒體在進化等方面關系密切，線粒體復合物Ⅰ與氫化酶具有同源性，以上證據不僅表明了高等植物具有氫化酶活性，并且提示這種活性與植物線粒體尤其是線粒體中電子傳遞鏈的復合物Ⅰ密切相關。然而，目前關于高等植物的氫代謝以及氫化酶研究還處于初步階段，若想要完全證實高等植物線粒體具有氫化酶活性并進一步確定該氫化酶的定位與特性，仍需要后續相關實驗進行驗證。

若高等植物線粒體具有氫化酶活性的假說最終被證實，將有助于我們理解真核生物的進化過程，同時也會使我們對真核生物線粒體的功能有全新的認識。此外，從整個氫氣生物學的層面來看，雖然目前已經發現了氫氣的多種生物學效應，但是關于氫分子的作用機理研究尚不成熟，目前已經提出的選擇性抗氧化假說、生物酶假說與信號分子假說均存在一定的片面性或相關研究不充分的情況［51］，并不能很好地解釋氫氣的廣泛生物學效應，這在很大程度上制約了氫氣生物學的發展。高等植物線粒體具有氫化酶活性的假說將氫氣代謝與能量及細胞代謝緊密的聯系起來，試圖從源頭上找到氫氣發揮生物學效應的底層機制，有望徹底揭開氫分子的作用機理。