山竹殼多糖提取工藝優化及其生物活性研究

姚欣，孫寧云，陳鑫，范麗霞，楊安平，朱峰，劉輝，*

（1.佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東 佛山 528225；2.佛山科學技術學院醫學院，廣東 佛山 528000；3.佛山科學技術學院環境與化學工程學院，廣東 佛山 528000）

山竹（Garcinia mangostana L.）是藤黃科（Guttiferae）藤黃屬熱帶常綠喬木，又名山竹子、倒捻子等，原產于馬來西亞，現主要分布于泰國、越南等東南亞國家，我國廣西、海南等地也有引種[1]。山竹果實中含有豐富的蛋白質、維生素和礦物質，有“水果皇后”之稱[2]。

山竹的果皮作為藥材治療疾病已有幾百年歷史。山竹果皮曬干后被磨成粉末，能作為抗菌藥和抗寄生蟲藥來治療創傷、痢疾和慢性潰瘍[3-4]。山竹殼中主要含有氧雜蒽酮類、黃酮類、多酚類和多糖等成分[5]。其中氧雜蒽酮類是山竹殼的特征性成分，并且該類化合物具有顯著的抗氧化、抗菌、抗炎、細胞毒作用[6]。此外，山竹殼富含的黃酮類、多酚類化合物在抗氧化、抗菌等方面具有較好的作用[7]，而對其多糖的提取及生物活性研究涉及較少。

近年來，多糖在免疫調節、抗氧化、降血脂等方面顯示出較好的作用，多糖也成為研究的熱點。Li等[8]研究了海金沙草多糖的抗菌效果，結果表明其具有廣譜抗菌作用，尤其對酵母菌有著較高的抑制作用。宮海全[9]的研究結果表明蜜環菌多糖能提高糖尿病小鼠肝臟的自噬水平，減少脂肪堆積，提高胰島素敏感性且能保護糖尿病小鼠的胰島，改善受損的功能，達到降血糖的功效。在細胞實驗中，800 mg/L的枸杞多糖可通過誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期來發揮抗腫瘤活性，可以抑制人膀胱癌細胞系BIU87的生長，誘導BIU87細胞凋亡[10]。

山竹多糖的研究多集中在果肉中，李娥等[11]測定了山竹提取物有效成分，并分析了多糖組成，結果表明，山竹果肉中富含多糖，主要有葡萄糖、葡萄糖醛酸、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖。對果殼多糖的研究較少，Gan等[12]采用響應面試驗優化山竹殼果膠多糖的提取工藝條件，從而獲得具有高糖醛酸含量和抗氧化活性的高抗氧化果膠多糖。為了更好地利用山竹果殼，提高山竹殼的開發利用價值，本文采用正交試驗，對超聲輔助提取山竹殼多糖的工藝進行優化，并對其抗氧化活性、抗菌活性以及抗腫瘤活性進行研究，為山竹殼在食品等方面的進一步開發利用提供科學依據及數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

山竹殼：市售；菌種（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌）：廣東省微生物菌種保藏中心；人乳腺癌細胞（MCF-7）、人結腸癌細胞（DLD-1）、人黑色素瘤細胞（A375）、小鼠黑色素瘤細胞（B16）：中國科學院上海細胞中心。葡萄糖、苯酚、DPPH、ABTS、二甲基亞砜（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；過硫酸鉀（分析純）：福晨（天津）化學試劑有限公司；細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）：亞科因（武漢）生物技術有限公司；LB培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司；DMEM培養基、胎牛血清、胰酶、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）：美國 Gibco 公司；青霉素、鏈霉素：上海撫生有限公司。

1.1.2 試驗儀器

超聲波清洗器（060ST）：深圳市華策科技有限公司；臺式高速離心機（TG16-WS）：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；旋轉蒸發器（RE-2000A）：鄭州特爾儀器設備有限公司；紫外分光光度計（UV-2700）：島津企業管理（中國）有限公司；全波長酶標儀（EPOCH）：美國BioTek公司；智能生化培養箱（LRH-150）：鄭州生元儀器有限公司；二氧化碳培養箱（BB 5060）、立式自動壓力蒸汽滅菌器（GR60DA）：致微（廈門）儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡（IMC-900TFL）：廣州科適特科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理

取山竹殼于60℃烘箱中干燥至恒重，然后用粉碎機粉碎，過60目篩獲取山竹殼樣品備用[13]。

1.2.2 葡萄糖標準曲線的繪制

首先準確稱量10 mg已充分干燥至恒重的葡萄糖粉末，在燒杯中加入適量去離子水攪拌使葡萄糖完全溶解，然后將其定容到100 mL容量瓶中，即得到0.100 0 mg/mL葡萄糖標準溶液。

分別準確移取上述葡萄糖溶液 0、0.20、0.40、0.60、0.80 mL，然后用去離子水補至1 mL，配制濃度分別為0、20.00、40.00、60.00、80.00 μg/mL 葡萄糖待測液。分別移取1.00 mL上述各個濃度葡萄糖待測液到試管中，接著依次加入5.0%苯酚溶液1.0 mL，充分混勻，然后立即加入98%濃硫酸5 mL，混勻后靜置5 min，于37℃水浴加熱20 min，待其溫度降到室溫25℃后于488 nm波長下測定吸光度[14-15]。以吸光度Y對濃度X進行線性回歸，得回歸方程：Y=0.009 4X+0.092 8，R2=0.993，線性范圍為 0～80 μg/mL。

1.2.3 山竹殼多糖的提取及提取率測定

準確稱取1.000 g的山竹殼粉末，與一定體積的去離子水依次加入到錐形瓶中。然后將錐形瓶放置于超聲機內，設定超聲功率、超聲時間、提取溫度等參數，共提取3次，合并濾液，濃縮至25 mL，采用Sevag法[16]脫蛋白，即得多糖提取液[17-18]。按照1.2.2中的方法測定多糖提取液的吸光度，通過回歸方程計算多糖濃度，并按照公式計算多糖提取率。

式中：C為提取液多糖濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數；m為山竹殼粉末質量，g。

1.2.4 單因素試驗

以1.000g山竹殼粉末為基準，固定超聲功率216W、超聲時間30 min和提取溫度45℃，考察料液比[1∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]對山竹殼多糖提取率的影響；固定料液比1∶40（g/mL）、超聲時間30 min和超聲功率216 W，考察提取溫度（35、45、55、65、75℃）對山竹殼多糖提取率的影響；固定料液比1∶40（g/mL）、超聲功率216 W和提取溫度45℃，考察超聲時間（10、20、30、40、50 min）對山竹殼多糖提取率的影響；固定料液比1∶40（g/mL）、超聲時間30 min和提取溫度45℃，考察超聲功率（200、240、280、320、360 W）對山竹殼多糖提取率的影響[19]。

1.2.5 正交試驗

在單因素試驗結果基礎之上，以相關因素為自變量、多糖提取率為評價指標，設計L9（33）正交試驗優化山竹殼多糖的提取工藝，水平及因素見表1。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

1.2.6 多糖體外抗氧化活性測定

1.2.6.1 對DPPH自由基清除效果的測定

首先用蒸餾水將山竹殼多糖配制成1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL 7 個濃度，分別取50 μL不同濃度的山竹殼多糖溶液于96孔板中，分別加入0.1 mmoL/L的DPPH溶液150 μL，室溫25℃下避光靜置30 min后，在酶標儀517 nm處測定吸光度Ai，VC做陽性對照；對照組用無水乙醇代替DPPH，測定吸光度Aj；空白組以蒸餾水代替多糖溶液，測定吸光度A0。試驗重復3次取平均值[20-21]。DPPH自由基清除率計算公式如下。

1.2.6.2 對羥基自由基清除效果的測定

在 96 孔板中加入 50 μL 不同濃度（1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL）的山竹殼多糖溶液、50 μL 9 mmol/L 的 FeSO4和 50 μL 9 mmol/L 的水楊酸-乙醇，振蕩10 min后加入50 μL 8.8 mmol/L的H2O2，VC做陽性對照，以蒸餾水代替水楊酸作為陰性對照，以蒸餾水代替多糖溶液作為空白對照，室溫25℃下避光靜置反應30 min后，在酶標儀510 nm處測定吸光度，試驗重復3次[22]。羥基自由基清除率計算公式如下。

式中：Ai為樣品溶液吸光度；Aj為不含水楊酸-乙醇溶液吸光度；A0為不含樣品溶液吸光度。

1.2.6.3 對ABTS+自由基清除效果的測定

稱取0.038 14 g ABTS粉末，定容至10 mL，配制成7 mmol/L的溶液；稱取0.013 4 g過硫酸鉀K2S2O8，定容至10 mL，配制成4.95 mmol/L溶液。將兩溶液等體積混勻，接著將其放于陰暗處靜置12 h，形成ABTS+儲備液，然后按體積比 1 ∶20 用 PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）稀釋儲備液，使其在734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02。

取 50 μL 不同濃度（1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL）的山竹殼多糖溶液于96孔板中，分別加入150 μL ABTS+溶液，室溫25℃下避光靜置反應30 min后，在酶標儀734 nm處測定吸光度Ai，VC做陽性對照；陰性對照組用蒸餾水代替ABTS+溶液，測定吸光度Aj；空白組以蒸餾水代替多糖溶液，測定吸光度A0。試驗重復3次取平均值[23]。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

1.2.7 多糖抗菌活性的測定

采用微量肉湯稀釋法測定山竹殼多糖對供試菌的最小抑菌濃度（minimuminhibitory concentration，MIC）。首先配制50 mg/mL的山竹殼多糖溶液，用倍半法稀釋多糖溶液，形成 50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.193、0.096 6 mg/mL 10個濃度梯度。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌均接種于牛肉膏蛋白胨培養基中，在37℃條件下培養24 h，得到105cfu/mL的菌懸液。在96孔板中進行樣品接種，1～11每孔均加入100 μL的營養肉湯，第12孔加入200 μL的營養肉湯；取100 μL不同濃度（50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.193、0.096 6 mg/mL）的山竹殼多糖溶液依次加入1～10孔，1～11孔均加入菌液100 μL；37℃條件下孵育16 h～18 h。在酶標儀600 nm處測吸光度，并確定MIC[24]。

1.2.8 多糖抗腫瘤活性的測定

首先用DMEM培養基將山竹殼多糖配制成0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 7 個濃度。在 37 ℃飽和濕度、5% CO2條件下培養 MCF-7、DLD-1、A375和B16細胞。取對數生長期的細胞，分裝到96孔板中，調整細胞濃度使每孔約5 000個細胞，在CO2培養箱中培養 24 h。取不同濃度（0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）的多糖溶液，從低濃度到高濃度依次加入到96孔板中，每孔100 μL，在37℃培養箱中培養48 h。吸出孔內培養液，然后向每孔內加入100 μL含10%CCK-8試劑的基礎培養基，37℃培養箱內培養1 h～2 h，用酶標儀在450 nm處測吸光度[25]。

式中：A0為具有培養基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔吸光度；A1為具有細胞、CCK-8溶液和多糖樣品溶液的孔吸光度；A2為具有細胞、CCK-8溶液而不含多糖樣品溶液的孔吸光度。

1.3 數據處理

本試驗使用GraphPad Prism 8.0.2和SPSS 23.0等軟件對數據進行整理和統計分析，每個試驗平行測定3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 山竹殼多糖單因素試驗結果與分析

2.1.1 料液比對山竹殼多糖提取率的影響

料液比對山竹殼多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由圖1可以看出，當料液比從1∶20（g/mL）變化到1∶60（g/mL）時，山竹殼多糖提取率先升高后下降，當料液比為1∶40（g/mL）時，山竹殼多糖提取率最高，為8.75%，由此可推測在一定范圍內，水用量的增加促進了多糖從山竹殼中浸出擴散到溶液中，而溶劑添加量過高時，會影響浸提體系的傳熱和傳質，不利于多糖的提取[26]。因此，山竹殼多糖提取的最佳料液比為 1 ∶40（g/mL）。

2.1.2 提取溫度對山竹殼多糖提取率的影響

提取溫度對山竹殼多糖提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

由圖2可知，隨著溫度的升高，山竹殼多糖提取率逐漸增大。當溫度從35℃升至45℃時，多糖提取率上升較快。當溫度超過45℃，提取率增長緩慢。這可能是溫度適當升高，使分子運動速率加快，多糖溶出率上升[27]，但溫度過高，多糖的分子結構在高溫環境中易被破壞，因考慮到實際意義，節約能源，選擇山竹殼多糖提取的最佳提取溫度為45℃。

2.1.3 超聲時間對山竹殼多糖提取率的影響

超聲時間對山竹殼多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，當超聲時間從10 min延長到50 min時，山竹殼多糖提取率整體呈先升高后下降趨勢，當超聲時間為30min時，山竹殼多糖提取率最高，為9.61%，可推測隨著超聲時間的延長，細胞壁被充分破碎，多糖分子被充分溶出，提取率隨之上升，但隨著超聲時間的延長，多糖提取率下降，這可能是由于此時多糖已充分溶出，延長的超聲時間不會增加多糖的溶出而會導致多糖結構的破壞，從而降低了提取率。因此，山竹殼多糖提取的最佳超聲時間為30 min。

2.1.4 超聲功率對山竹殼多糖提取率的影響

超聲功率對山竹殼多糖提取率的影響如圖4。

圖4 超聲功率對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

由圖4可知，超聲功率為240 W時，山竹殼多糖提取率最高，為9.54%。超聲功率小于240 W時，多糖提取率隨著超聲功率增大而上升；當超聲功率大于240 W時，多糖提取率隨著功率增大而緩慢減小。其原因可能是由于功率適當增大，有助于破碎細胞結構，但功率過大時，多糖結構受到破壞，多糖提取率些許下降，但從整體可以看出，超聲功率對山竹殼多糖的提取率影響不顯著。綜上所述，山竹殼多糖提取的最佳超聲功率為240 W。

2.2 正交試驗結果與分析

分析山竹殼多糖提取的單因素試驗結果可知，超聲功率變動對多糖提取率的影響不顯著，為考察因素中的次要因素。因此，固定超聲功率為240 W，研究料液比、提取溫度和超聲時間3個因素對山竹殼多糖提取的影響，以山竹殼多糖提取率為評價指標，進行L9（33）正交試驗。正交試驗結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 提取工藝條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experimental results

通過表2中多糖提取率的極差分析結果可知，影響提取率的各因素主次順序為提取溫度（B）＞超聲時間（C）＞料液比（A）；通過 k 值比較可知，kA2＞kA3＞kA1，kB3＞kB2＞kB1，kC3＞kC2＞kC1，即山竹殼多糖提取的最優組合為A2B3C3。由表3方差分析結果可知，料液比、提取溫度和超聲時間對山竹殼多糖提取率有極顯著影響（P＜0.01），故山竹殼多糖提取的最優工藝條件為料液比1∶40（g/mL）、提取溫度 55℃、超聲時間 40 min。按照此工藝參數提取3次，多糖提取率分別為13.56%、12.69%、12.73%，平均值為12.99%，高于正交試驗每組的結果，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.70%，說明工藝穩定可靠。

2.3 山竹殼多糖體外抗氧化活性的測定

2.3.1 山竹殼多糖對DPPH自由基清除效果的測定

山竹殼多糖對DPPH自由基的清除效果見圖5。

圖5 多糖對DPPH自由基清除效果的測定Fig.5 The scavenging effect of polysaccharides on DPPH radical

由圖5可知，在15.625 μg/mL～250 μg/mL濃度范圍內，DPPH自由基清除率隨著多糖濃度的增加而升高。當多糖濃度大于250 μg/mL時，山竹殼多糖對DPPH自由基清除率基本保持不變，當多糖濃度為250 μg/mL時，其對DPPH自由基清除率可達95.3%，與同濃度VC清除DPPH自由基能力相當，山竹殼多糖清除DPPH自由基的IC50為69.25 μg/mL。因此，山竹殼多糖對DPPH自由基具有較強的清除能力。

2.3.2 山竹殼多糖對羥基自由基清除效果的測定

山竹殼多糖對羥基自由基的清除效果見圖6。

圖6 多糖對羥基自由基清除效果的測定Fig.6 The scavenging effect of polysaccharides on OH radical

由圖6可知，在所研究的多糖濃度范圍內，羥基自由基清除率隨多糖濃度的增加而增強。當多糖濃度為1 000 μg/mL時，山竹殼多糖的羥基自由基清除率達55.21%，高于同濃度VC對羥基自由基清除率的一半，山竹殼多糖清除羥基自由基的IC50為462.50 μg/mL。因此，山竹殼多糖對羥基自由基具有較好的清除效果。

2.3.3 山竹殼多糖對ABTS+自由基清除效果的測定

山竹殼多糖對ABTS+自由基的清除效果見圖7。

圖7 多糖對ABTS+自由基清除效果的測定Fig.7 The scavenging effect of polysaccharides on ABTS+radical

由圖7可知，在 15.625 μg/mL～125 μg/mL 范圍內，ABTS+自由基清除率隨著多糖濃度的增加而提高。當多糖濃度大于125 μg/mL時，山竹殼多糖對ABTS+自由基清除率基本保持不變，當多糖濃度為125 μg/mL時，其對ABTS+自由基清除率可達99.16%，與同濃度VC清除ABTS+自由基的能力相當，山竹殼多糖清除ABTS+自由基的IC50為18.39 μg/mL。因此，山竹殼多糖對ABTS+自由基具有很強的清除能力。

2.4 山竹殼多糖抗菌活性的測定

不同濃度山竹殼多糖對5種供試菌的抑菌效果結果如表4。

表4 多糖對供試菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of polysaccharides on test bacteria

由表4可知，山竹殼多糖對5種菌種的MIC順序為鮑曼不動桿菌＞銅綠假單胞菌＞大腸桿菌=肺炎克雷伯菌＞金黃色葡萄球菌，山竹殼多糖對鮑曼不動桿菌的MIC相對較高，為25 mg/mL，對銅綠假單胞菌的MIC為6.25 mg/mL，對大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的MIC相同，均為3.125 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC為0.391 mg/mL。由此可見，山竹殼多糖對金黃色葡萄球菌抑制作用最強，對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌的抑制效果次之，對鮑曼不動桿菌的抑制效果最差。

2.5 山竹殼多糖抗腫瘤活性的測定

山竹殼多糖抗腫瘤活性的測定結果見圖8。

圖8 多糖對4種不同腫瘤細胞細胞活力的影響Fig.8 Effects of polysaccharides on cell viability of tumor cells

由圖8可知，B16和MCF-7細胞對山竹殼多糖不敏感，隨著多糖濃度的增加，其細胞活力基本保持不變；在 3.125 μg/mL～100 μg/mL 的濃度范圍內，A375和DLD-1細胞對山竹殼多糖較為敏感，隨著多糖濃度的增加，A375和人DLD-1細胞的細胞活力呈下降趨勢。濃度為12.5 μg/mL時，A375細胞增殖抑制作用與對照組比較具有統計學意義上的差異（P＜0.05），而DLD-1細胞增殖抑制作用與對照組比較差異極顯著（P＜0.01），且多糖作用于DLD-1和A375細胞的IC50分別為76.66 μg/mL和127.70 μg/mL。綜上所述，山竹殼多糖對A375和DLD-1細胞具有一定的抑制效果，對B16和MCF-7細胞無抑制作用。

3 結論

將單因素試驗和正交試驗相結合得出山竹殼多糖最優提取工藝為料液比1∶40（g/mL），提取溫度55℃，超聲時間40 min，超聲功率固定為240 W，此時山竹殼多糖提取率為12.99%。山竹殼多糖對DPPH自由基、羥基自由基和ABTS+自由基均具有較好的清除效果，其清除DPPH自由基、羥基自由基以及ABTS+自由基的IC50值分別為69.25、462.50 μg/mL 和 18.39μg/mL，表明山竹殼多糖具有良好的抗氧化性。山竹殼多糖具有一定的抑菌效果。其中，山竹殼多糖對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強（MIC為0.391 mg/mL），對大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌抑制效果次之（MIC分別為 3.125、3.125、6.25 mg/mL），對鮑曼不動桿菌的抑制效果最差（MIC為25 mg/mL）。山竹殼多糖對人乳腺癌細胞（MCF-7）和小鼠黑色素瘤細胞（B16）的無增殖抑制作用，對人結腸癌細胞（DLD-1）和人黑色素瘤細胞（A375）的具有一定的增殖抑制效果，其作用于人結腸癌細胞（DLD-1）和人黑色素瘤細胞（A375）的IC50分別為 76.66 μg/mL 和 127.70 μg/mL。本研究為山竹殼多糖的工業化生產和天然抗氧化劑、抑菌劑、抗腫瘤活性成分的開發提供了試驗依據，然而抗氧化、抗菌和抗腫瘤機制有待進一步研究。