美拉德反應改性植物蛋白研究進展

鄭乾坤，陳復生*，張朵朵，殷麗君

（1.河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

近年來，大多消費者基于健康飲食而轉向純素食，因此研究用植物蛋白替代動物蛋白成為了熱點[1]。由于蛋白質對pH值、溫度和外部壓力的敏感性，其結構容易發生變性，從而導致蛋白質的功能特性和營養價值發生改變[2]，因此研究人員選擇不同方法改變蛋白質結構或將其與碳水化合物結合來改善蛋白質的功能特性，其中常用方法是熱處理、乳化、發酵、水解、酶促和非酶促反應等[3]。在上述方法中，使用美拉德反應對蛋白質進行非酶促糖基化被認為是最有前途的方法之一。因為參與美拉德反應所需的蛋白質和多糖都是綠色、無毒、無污染的，并且美拉德反應是自發進行而不需要添加劑來引發，所以在食品工業中安全性較高[4-7]。

美拉德反應是非酶促反應，在受控條件下，美拉德反應有利于糖基化蛋白質增強功能特性，如熱穩定性和溶解性[7]。然而反應程度控制不當時，美拉德反應后期會產生諸多有害物質。通過對溫度、時間、pH值及蛋白質和多糖的質量比等條件的控制來阻止美拉德反應進入更高級階段，防止形成有害成分[8]，將有助于多糖-蛋白復合物在食品工業中的應用以及生產新的增值食品。本文簡要概述美拉德反應機理，綜述美拉德改性植物蛋白技術以及近年來對傳統植物蛋白進行美拉德改性的研究。

1 美拉德改性蛋白質的機理

美拉德反應是一種非酶促反應，其中游離氨基（蛋白質、肽或氨基酸）與游離羰基（還原糖）反應，經歷復雜的反應網絡和平行的化學轉化，形成共軛物和其他美拉德反應產物（Maillard reaction products，MRPs）。美拉德反應可以分為3個階段：初級階段、高級階段和最終階段。這些階段是相互關聯的，可以同時發生，并受反應條件的影響。美拉德反應機理見圖1[9]。

圖1 美拉德反應機理圖Fig.1 Maillard reaction mechanism

美拉德反應的初級階段以初始糖基化反應為特征，主要是還原糖的羰基與氨基酸中的游離氨基之間的縮合反應，水分子釋放后形成N-糖基胺，再經過不可逆的重排生成Amadori重排產物。美拉德反應高級階段始于Amadori重排產物的降解，這取決于體系的條件，如pH值、時間和溫度。當pH值等于或低于7時，生成糠醛或羥甲基糠醛。當pH值高于7時，生成還原酮及各種裂解產物，包括縮醛、丙酮醛和雙乙酰。這些裂解產物具有很高的活性，并參與新的反應。最終階段仍有一系列的反應發生，包括環化、脫水、逆醛化、重排、異構化和縮合，還會形成棕色的含氮聚合物和共聚物，稱為類黑精[9-10]。與早期階段相比，美拉德反應的高級和最終階段包含高度的復雜性。

2 美拉德改性蛋白質的技術研究進展

傳統的美拉德反應改性蛋白質方法有干熱法和濕熱法。然而對植物來源的蛋白質來說，由于緊密的蛋白質結構阻礙了活性氨基與糖的羰基反應，導致美拉德反應速率較慢[11]。因此，許多學者將研究重點放在不同的輔助技術上，如超聲波處理、靜電紡絲和微波等輔助技術，這些輔助技術可以打開蛋白質的緊密結構、加快美拉德反應速率、提升美拉德反應的結合效果。這些輔助技術有其自身的優勢和局限性，它們可以顯著改善蛋白質的功能特性，也可以影響美拉德反應的初始階段，減少晚期美拉德反應終產物的形成。因此有必要進行研究，以了解它們對多糖-蛋白質共軛物的結構、功能和生物活性的影響。

2.1 超聲波輔助技術

超聲波由頻率超過20 kHz的聲波組成，在液體中可以產生空化氣泡，空化氣泡內爆產生高能量，介質中的粒子在超聲波的作用下產生劇烈振動，引起介質間相互作用，從而引起蛋白質結構發生改變。超聲波對美拉德反應的影響見圖2[9]。

圖2 超聲波對美拉德反應的影響Fig.2 Effect of ultrasound on Maillard reaction

如圖2所示，超聲波輔助技術能大幅度提高處理速度、效率和質量，主要應用于改變蛋白質的功能性質，例如乳化、結構和其他功能屬性[12]。

葛偉[13]的研究表明，酪蛋白-葡萄糖的糖基化反應程度隨著超聲時間的延長先增加后減小，在20 min時反應程度最大。隨著超聲功率的增加，反應程度隨之增大，并在450 W時達到最大。Zhao等[14]研究超聲波預處理對大豆蛋白-葡萄糖/麥芽糖共軛物的物理化學特性和流變學特性的影響，與未經處理的樣品相比，超聲波預處理會使共軛物糖基化程度增加、褐變強度降低、顆粒大小和三級結構的展開增加。Cui等[15]研究經超聲預處理制備的大豆分離蛋白-葡萄糖共軛物對分子柔韌性和乳化性能的影響。結果表明，隨著超聲強度的增加，反應速率明顯增加。預處理后，由于粒徑減小和結構疏松，形成的共軛物柔韌性顯著增加，這與共軛物的乳化能力增強有關。Mu等[16]使用超聲波輔助預處理將大豆分離蛋白與阿拉伯樹膠接枝，發現使用超聲波輔助預處理進行美拉德改性所需的時間為60 min，遠低于傳統方法所需的48 h。經過預處理后大豆分離蛋白的α-螺旋和β-折疊明顯減少，二級結構無序卷曲增加?？梢钥闯?，采用超聲波輔助美拉德反應，可以使蛋白質結構展開，縮短美拉德反應的時間，增加美拉德反應的程度，同時共軛物的功能特性得到改善。但過度超聲處理也會導致晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs） 等有害物質的形成，這可能會阻礙超聲波的潛在應用。因此，必須平衡預處理以避免形成晚期糖基化產物，同時提高結合率。

2.2 微波輔助技術

與其他的美拉德改性輔助技術相比，微波輔助美拉德改性反應條件更溫和，共軛效率也更穩定[17]。微波輔助改善蛋白質功能性質的原理主要體現在微波輔助處理時，極性基團吸收微波，產生自由基，改變蛋白質的二級和三級結構，從而影響蛋白質的乳化和溶解性[18]。

畢偉偉等[19]的研究發現微波對酪蛋白糖基化的反應程度和速率隨著微波功率和微波時間的增大逐漸增加，但是在微波功率達到500 W、微波時間20 min時，接枝度達到最大。Guan等[20]利用微波加熱研究大豆蛋白與低聚糖（乳糖、麥芽糖、葡聚糖和可溶性淀粉）的接枝反應，研究表明：微波加熱處理后，美拉德反應速率分別是傳統加熱的6、7、57、12倍。這意味著微波加熱與傳統加熱相比顯示出類似的共價鍵結合，但需要更低的活化能，因此可以有效地避免AGEs的形成。Cheng等[21]研究微波處理對大米蛋白和葡聚糖之間美拉德反應的影響，研究發現微波預處理提高了糖基化速率，溶解度明顯增加，微波加熱5 min內溶解度增加64%，而常規加熱5 min內溶解度增加24%。以上研究表明，與傳統加熱相比，微波輔助得到的共軛物功能和生物活性得到了改善，證明了微波輔助美拉德改性的優勢。

2.3 靜電紡絲輔助技術

靜電紡絲是一種靜電纖維制造技術，可將生物分子構造成纖維[22]。靜電紡絲原理圖及其對美拉德共軛物的影響見圖3[23]。

圖3 靜電紡絲原理圖及其對美拉德共軛物的影響Fig.3 Schematic diagram of electrospinning and its effect on Maillard conjugate

如圖3所示，靜電紡絲由于其拉伸和彎曲運動導致生物分子結構重新排列，而生物分子結構由于聚合物鏈纏結而變得完整，主要影響因素有溶液黏度、多糖濃度、纖維大小、蛋白質與多糖的混合比、溫度和濕度的影響。通過靜電紡絲輔助美拉德改性，反應時間縮短，糖化程度增強，蛋白質構象發生變化，復合物生成量增加[24]。

與傳統的干法或濕法加熱方法相比，利用靜電紡絲輔助制備的豌豆蛋白-麥芽糊精基共軛物[25-27]的不同功能性質有所改善。改變電紡多糖纖維中羰基含量可以調節糖基化程度。共軛物的溶解度從34%增加到44%，這與疏水性蛋白質與親水性碳水化合物的結合有關，也增加了形成共軛物氫鍵的能力。靜電紡絲輔助美拉德共軛技術已用于成膜，學者研究了靜電紡絲明膠-葡萄糖[28]和玉米醇溶蛋白/明膠纖維-葡萄糖[29]美拉德共軛對潤濕性、機械性能和生物相容性的影響。結果表明，彈性模量和生物相容性得到提高，所得膜具有可調的潤濕性和非細胞毒性。靜電紡絲技術作為預處理的方式促進美拉德結合物的生成，以及在植物蛋白質溶解度提升方面，在蛋白質修飾中的潛力較大。

2.4 高壓輔助技術

在高壓加工中，待加工的產品浸沒在充滿液體（水、硅油、苯甲酸鈉、乙醇、乙二醇、蓖麻油等）的壓力容器系統中，液體充當壓力傳遞介質，蛋白質基于壓力會導致構象轉變、體積變化和多糖無定形和結晶區域的重排以及水的侵入[30]。Moreno等[31]研究高壓處理對大豆分離蛋白7S和11S球蛋白乳化活性和穩定性的影響。由于高壓處理會使蛋白質單體的部分或全部變性，增強表面活性，這些蛋白質在不同壓力下表現出更好的表面疏水性、乳液穩定性和活性。Moreno等[31]進行了基于葡萄糖-賴氨酸-美拉德反應的模型系統研究，壓力為400 MPa，pH值范圍為5～10，發現壓力處理并不會影響Amadori重排產物的形成，但由于壓力誘導的酸解離（pH＜8）導致中晚期MRP的形成受到顯著抑制。而在pH值為10.2時，高壓加速了中期和晚期階段的AGEs形成。

戊糖苷是美拉德反應過程中形成的蛋白質結合熒光標記物之一，是確定美拉德反應階段和強度的指標。Schwarzenbolz等[32]研究美拉德反應期間高靜水壓對戊糖苷形成的影響，在高達600 MPa的壓力下測試了由N-乙酰精氨酸、N-乙酰賴氨酸和核糖組成的溶液，發現Amadori重排產物的降解因高壓處理而減少，結果表明高壓處理有助于控制MRP的形成并阻止晚期糖基化。

2.5 脈沖電場輔助技術

脈沖電場技術（pulsed electric field，PEF）是將短脈沖電施加于兩個電極之間的電場技術，應用于食品工業的脈沖電場強度一般為0.1 kV/cm～80.0 kV/cm。PEF處理導致美拉德結合物的功能特性發生實質性變化，游離氨基酸含量增加，并抑制蛋白質的熱誘導聚集[33]。PEF處理可對多糖和蛋白質結構產生顯著影響，從而對糖基化的速率、效率和熱性能產生積極影響[34]。

基于天冬酰胺-葡萄糖[35]、天冬酰胺-果糖[36]和甘氨酸-葡萄糖[37]美拉德模型系統，學者研究了PEF對美拉德反應的影響。在28 kV/cm的場強下，反應速率和MRP形成相比明顯增加。陳剛等[38]研究了脈沖電場對于不同還原糖-谷氨酸鈉溶液的pH值、中間產物、褐變、還原糖含量以及抗氧化活性的影響，當脈沖電場處理條件為場強4 kV/cm，時間1.88 ms，得到的果糖-甘氨酸鈉體系在294 nm和420 nm處的吸光度從0分別增加到1.71和0.07，同時，抗氧化活性增加10.96%，果糖含量減少55%，表明脈沖電場對于果糖-谷氨酸鈉體系的美拉德反應有明顯影響。

3 美拉德反應改性植物蛋白研究現狀

植物蛋白具有能提供高營養價值、低過敏性、易獲得性和較低成本等優勢，經修飾后可以賦予蛋白不同的功能，在食品加工業中備受關注[39]。大豆蛋白是最受歡迎的植物蛋白之一，在工業生產中所占比重大以及成本較低。大豆蛋白由大豆球蛋白（＞70%）和β-伴大

豆球蛋白組成，與單糖或雙糖（葡萄糖[15]、麥芽糖/葡萄糖[14，40]、核糖[41]、果糖[42]）和多糖（香豆膠[43]、葡聚糖[44-45]、阿拉伯樹膠[46]、麥芽糖糊精[47-48]）結合，使用傳統或改進的糖基化技術對其改性，并進行理化性質和功能性分析。美拉德共軛物對乳液穩定性、溶解性、熱穩定性和表面疏水性等功能性質有明顯影響。與其他植物蛋白質相比，豌豆蛋白的乳化能力、表面電荷和溶解度較低，但其過敏性和成本也低，所以用阿拉伯樹膠[24]、果膠[39]和麥芽糖糊精[49]通過美拉德反應對豌豆蛋白質進行結構修飾以提高其乳化活性?；ㄉ鞍着c其他豆科蛋白質（大豆除外）相比表現出更好的功能特性，但因溶解度太低而未能充分利用。使用葡聚糖通過美拉德改性可以改善花生蛋白的功能性質[7]，通過超聲輔助美拉德反應可以克服花生蛋白糖基化難的問題[50-52]。超聲波使蛋白質結構展開，增加親水性氨基酸殘基的暴露，溶解性提高從而使糖基化效率明顯提高。表1列出了多種植物蛋白通過美拉德反應與碳水化合物復合的研究現狀。

表1 近年來不同植物蛋白通過美拉德改性研究內容Table 1 Research contents of Maillard modification of different plant proteins in recent years

4 結語

美拉德反應顯示出修飾植物源性蛋白質的潛力，但其傳統的反應方法所需周期長，效果不顯著。為了改善傳統反應方法的缺點，各種新穎的預處理技術相繼出現。這些預處理技術在輔助美拉德改性植物蛋白方面效果明顯，但多數研究是使用單一糖或蛋白質模型系統進行，而食品是復雜體系，因此還需要進行更深層次的系統性研究。目前通過美拉德反應修飾植物蛋白主要集中在傳統植物蛋白，而對于一些非傳統的植物源蛋白還缺乏研究。植物蛋白的美拉德改性在食品工業中顯示出巨大的應用潛力，因此進一步對改性后的蛋白質-多糖復合物進行功能性和生理活性研究，將有助于提高植物蛋白的應用價值，也有助于開發植物源功能性食品。