玉米小斑病抗病QTL的鑒定與效應分析

李志敏，杜文杰，李政，李雪迎，趙蕭笛，賈琳

(河南農業大學 農學院，河南 鄭州 450046)

玉米小斑病是由長蠕孢菌(Cochliobolusheterostrophus)侵染、主要為害玉米葉片的一種真菌性病害，在玉米整個生育期均可發生，在抽雄和灌漿期發病比較嚴重，是中國玉米產區重要病害之一。受耕作傳統、品種和氣候的影響，在我國玉米主產區的黃淮海地區，玉米小斑病的發生逐年加重。據統計，在發病嚴重的區域，一般年份減產15%～20%，嚴重的達50%以上[1]。選育和推廣抗病品種是防治玉米小斑病最經濟有效的手段，而開展抗病遺傳規律研究，鑒定主效抗病QTL，可以為玉米小斑病的解析與育種提供理論依據。

已有研究表明，玉米小斑病的抗性是一個復雜的數量性狀，由多個微效基因或數量性狀位點共同控制，不同基因或位點之間多表現為加性效應、顯性效應和上位性效應[2-4]。其中，在玉米第6染色體短臂上存在一個隱性抗病位點rhm，與標記UMC85和p144相連鎖[5-7]。隨后，Zhao等利用近等基因系(H95rhm和H95)組配的分離群體，對rhm進行了精細定位，將抗病基因限定在8.56Kb的區間內，并鑒定到一個編碼賴氨酸組氨酸轉運子的基因LHT1(lysine histidine transporter 1)，可以作為rhm的候選基因。推測其抗病分子機制，可能與LHT1外顯子中354bp片段的插入而導致蛋白合成提前終止有關[8]。然而，由于rhm僅在玉米散粉前表現出抗病的特性，散粉后抗性迅速下降，極大地限制了其在玉米生產上的應用[9]。Balint-Kurti等發現玉米成株期和苗期小斑病抗性位點存在一定的差異，利用Mo17(抗)×B73(感)組配的RIL群體，鑒定到3個成株期主效抗病位點，分別位于玉米第1染色體(1.10區)、第3染色體(3.04區)和第8染色體(8.02/03區)上[10-11]；利用相同的作圖群體，又對苗期抗性進行了分析，共鑒定到6個抗病位點，分別位于第1、2、3、6、7和8染色體上，其中在第1和第3染色體上鑒定到的抗病位點，與成株期抗病位點的位置比較接近[12]。此外，Balint-Kurti等還利用熱帶抗病材料NC300與感病自交系B104組配的RIL群體，在玉米第3染色體(3.03/04區)和第9染色體(9.03/04區)檢測到主效的小斑病抗病位點[13-14]。通過不同親本組建的不同群體的抗病遺傳機制報道可以看出，玉米小斑病抗病位點幾乎遍布整個玉米基因組，同時存在抗病熱點區域[15-17]，這些抗病熱點區域分別位于玉米第3染色體(3.03/04區)、第6染色體(6.00/01區)和第9染色體(9.02/03區)上。

為進一步研究玉米小斑病的抗病遺傳機制，為抗小斑病育種提供更好的理論支撐，本研究選用1份來自CIMMYT的含有熱帶血緣的優良抗病自交系CIMBL29和感病自交系GEMS41組配了連鎖群體，并利用高密度SNP標記構建的連鎖圖譜，鑒定抗病基因位點，對其抗病的遺傳效應進行分析，為分子標記輔助選擇育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料包括來自含有熱帶血緣的抗病親本CIMBL29、感病親本GEMS41、以及以GEMS41為輪回親本，發展的包含179個家系的BC2F4群體。

1.2 田間試驗設計

2017年在河南長葛、2018年在河南西平分別種植試驗群體，包括親本和179個BC2F4群體家系。田間試驗采用隨機區組設計，單行區，行長4米，行距0.66米，株距0.25米，2次重復。田間管理與常規生產管理相同。

1.3 抗病性鑒定

在玉米13～14片葉時(播種后45天左右)，采用人工噴霧接種的方法，接種玉米小斑病病原菌，病原菌由河南農業科學院植保所郝俊杰研究員提供，接種濃度為5×105孢子/毫升。在人工接種后4周對家系的小斑病發病情況進行調查，并采用1～9級的抗、感分級標準進行抗性級別劃分，其中，1級只在少數葉片有分散的小斑病病斑，發病面積占總葉片面積比例小于5%；3級只有植株下部葉片輕度發病，面積不超10%；5級植株下部葉片發病嚴重，葉片上病斑較多，中部葉片發病中等，上部葉片基本不發病，發病葉片面積占比31%～50%；7級植株中、下部葉片嚴重發病，上部葉片也少量發病，發病葉面積占比在51%～70%；9級植株葉片都嚴重發病，植株葉片大于70%有病斑，枯死或整株枯死。

1.4 遺傳連鎖圖譜構建和QTL作圖

在玉米出苗后8～10片葉時期，采集親本和群體內新鮮的家系葉片提取總DNA[18]。采用中玉金(北京)公司開發的9.4K SNP芯片對親本和群體家系的基因型進行檢測。獲得SNP標記的基因型信息后，篩選在親本CIMBL29和GEMS41間有多態性的SNP 標記，刪除缺失率高(>10%)、雜合度高(>10%)的標記。采用中國農科院王建康研究員課題組開發的完備區間作圖IciMapping軟件[19]構建遺傳連鎖圖譜。具體的操作步驟如下：抗病親本CIMBL29的帶型用“0”表示；感病親本GEMS41的帶型用“2”表示；雜合帶型用“1”表示；缺失帶型用“-1”表示。采用“group”命令(LOD=2.5)對每一個標記進行分組，標記分組后，采用“ripple”命令確定標記在玉米10條染色體上排列順序。采用完備區間作圖軟件IciMapping中的ICIM-ADD模型(加性效應模型)，評估群體遺傳效應并判定其顯著性[20]。

1.5 數據統計分析

對調查群體家系和親本的表型數據，使用SPSS 2.0軟件計算病害表型數據的平均值和標準差；進行方差分析時，按變異來源，病害表型的總變異可分為家系變異和環境變異。廣義遺傳力計算公式：

H2=σ2g/(σ2g + σ2ge/n +σ2e/nr)

其中，σ2g為基因型方差，σ2ge為基因型與環境之間的互作方差，σ2e為誤差項方差，重復數為r，環境個數為n。

2 結果與分析

2.1 遺傳連鎖圖譜的構建

使用9.4K SNP芯片對群體家系和抗病親本CIMBL29及感病親本GEMS41的基因型進行檢測，共篩選出1044個在親本CIMBL29和GEMS41間表現出有多態性的SNP標記。采用完備區間作圖IciMapping軟件，利用這些親本間有多態性標記構建了包含179個家系的群體遺傳連鎖圖譜。采用LOD>2.5標準，將1044個標記分成10個連鎖群分別對應玉米基因組的10條染色體，遺傳連鎖圖譜總長2235.55 cm，SNP標記間平均距離為2.14 cm(表1)，其中，在玉米第1染色體上的標記數目最多，有168個；第10染色體包括的標記數目最少，只有61個。構建的高密度遺傳連鎖圖譜為繼續開展抗病基因鑒定和QTL作圖奠定了良好的基礎。

表1 SNP標記在玉米10條染色體上分布

2.2 玉米親本和作圖群體的小斑病抗性表型分析

在2017年和2018年，親本CIMBL29、GEMS41和作圖群體的179個家系在玉米小斑病抗性上呈現廣泛的變異(表2)。其中，親本CIMBL29表現為高抗玉米小斑病，2017和2018年兩個環境條件下的抗性級別分別為1.5和1.3級；而親本GEMS41則表現為高感玉米小斑病，2017和2018年兩個環境條件下的抗性級別分別是7.6和7.4級。對作圖群體在兩個環境的抗性表型的方差分析可知，基因型對BC2F4群體小斑病抗性的影響均達到極顯著水平，而環境間，以及基因型x環境互作不顯著，說明小斑病抗性變異主要受基因型控制；進一步分析表明，2017年和2018年小斑病抗性均表現出較高的遺傳力，遺傳力分別是0.85和0.84，兩個環境條件下的遺傳力為0.82，群體家系較高的遺傳力，說明遺傳變異主要由基因型決定。

表2 玉米小斑病作圖群體和親本的抗性級別和遺傳力

2.3 玉米小斑病抗性QTL定位及基因效應分析

對2017年和2018年的小斑病表型分別做QTL分析。由表3可知，兩個環境條件下共檢測到4個抗玉米小斑病QTL，分布在第1、5、6和8染色體上，單個QTL表型貢獻率為5.8%～10.9%，加性效應值為0.26～0.53。其中，在玉米第1和6染色體上檢測到兩個環境條件下一致的QTL(qSLB1和qSLB6)。qSLB1在2017年和2018年的加性效應值分別為0.53和0.50，分別可以解釋9.3%和10.9%的表型遺傳變異。qSLB6在2017年和2018年的加性效應值分別為0.32和0.26, 分別可以解釋6.6%和6.3%的表型遺傳變異。這2個共同檢測到的QTL可以認為是穩定的小斑病抗性QTL。此外，還在單個環境條件下檢測到2個QTL，分別位于第5和第8染色體上。

表3 作圖群體玉米小斑病抗性QTL

3 結論與討論

本研究在構建高密度SNP分子標記遺傳連鎖圖譜的基礎上，采用QTL作圖，對由抗病自交系CIMBL29和感病自交系GEMS41組建的BC2F4群體的小斑病抗性進行了QTL定位。在玉米基因組中共檢測到了4個抗病QTL，可以解釋5.8%～10.9%的表型遺傳變異；2個環境都在第1和第6染色體檢測到抗病QTL (qSLB1和qSLB6)，這2個共同檢測到的QTL可以認為是比較穩定的小斑病抗性QTL。

利用B73參考基因組數據庫( http://www.maizegdb.org) 對這兩個QTL 區間內的基因進行了初步分析，結果發現在qSLB6區域，已經分離了抗小斑病rhm的候選基因LHT1[8]。第1染色體的qSLB1區域存在一個抗玉米大斑病的熱點區域qNLB1.02，該區域有一個編碼植物抗病相關蛋白基因(ZmREM6.3)[21]。本研究在第8染色體bin8.06區檢測到qSLB8，在此區間存在一個抗大斑病基因Htn1[22]，此外，該區間還存在另兩個抗大斑病基因Ht2和Htn1。通過比較已經報道的抗病基因與本研究的抗小斑病位點，初步認為，抗小斑病位點位于抗病基因的熱點區域。此外，在單個環境下，第5染色體上檢測到qSLB5，這個抗病位點與前人報道的抗病熱點區域不同，可能是新的抗小斑病位點，有待進一步驗證和研究。

玉米病害抗性通常是復雜的數量性狀，選擇適合的作圖群體是進行QTL作圖的前提。本研究在作圖群體選擇上，與常用的遺傳作圖群體(如重組自交系群體)相比較，本研究利用的作圖群體是選用感病親本GEMS41作為輪回親本，抗病親本CIMBL29為供體親本，通過1 次雜交、2 次回交和3次自交發展的BC2F4群體。該群體的一個突出的優點是群體家系的開花期變異小，相對比較一致的開花期有利于病原菌接種和表型鑒定，保證了抗性表型數據采集的一致性和可靠性，奠定了QTL定位的良好基礎。