香蕉根際及非根際土壤細菌群落特征及共性規律研究

黃穗萍，金德才，李其利，韋紹龍，唐利華，黃素梅，郭堂勛*，羅述名，莫賤友

（1廣西農業科學院植物保護研究所/廣西作物病蟲害生物學重點實驗室，廣西南寧 530007；2中國科學院生態環境研究中心環境生物技術重點實驗室，北京 100085；3廣西農業科學院生物技術研究所，廣西南寧 530007；4廣西農業科學院花卉研究所，廣西南寧 530007）

0 引言

【研究意義】香蕉（spp.）隸屬于芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬植物，最早發現于東南亞，目前在世界130多個國家廣泛種植。香蕉是全球重要的經濟作物，也是僅次于水稻、小麥、玉米的第4大糧食作物（張靜等，2018）。我國是世界上最早種植香蕉的國家之一，也是世界香蕉主產國，香蕉已成為我國熱帶亞熱帶地區的重要經濟作物（李玉萍和方佳，2008）。植物根際土壤微生物是植株根際微生態的重要組成部分，在植物的生長發育、營養吸收、抗病特性以及耐受逆境脅迫等方面發揮著至關重要的作用。研究健康香蕉根際微生物群落的特征，以及土壤理化特性對土壤微生物豐度和多樣性的影響，可為香蕉根際土壤微生物的調控提供理論基礎，對促進香蕉植株持續健康生長具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】土壤微生物多樣性水平對土壤功能的開展和實施至關重要（Nannipieri et al.，2020）。研究發現，土壤微生物多樣性與土壤及植株健康、生態系統的可持續性有著不可分割的關系（Abawi and Widmer，2000；樊芳芳等，2020）。穩定的土壤微生物群落有利于植物的生長，較高的微生物多樣性可促進生態系統和微生物功能的穩定性（Deng et al.，2016；楊滿元等，2019），提高植株對營養物質的吸收，促進植株生長，增強防治土傳病害的能力（K?berl et al.，2015；Luan et al.，2015）。健康土壤中的微生物多樣性與群落結構對防治土傳病害非常關鍵，微生物多樣性高的土壤能擠占病原菌的生存空間使其難以入侵（Benizri et al.，2005；張明宇等，2020）。而土壤微生物多樣性水平和群落結構受多種因素影響，如土壤理化性質（Zhou et al.，2017）、農業栽培管理制度（Venter et al.，2016；徐勝濤等，2020）、根際分泌物（Kowalchuk et al.，2002）等。根際釋放的物質能作用于根際微生物區系，如通過分泌特定的分泌物來招募有益微生物種群，以應對外界病原體，抵御土傳病原微生物，從而有利于植物生長和繁衍后代（Yu‐an et al.，2018），常見的根系分泌物包括糖類、氨基酸、有機酸、維生素和脂肪酸等（Dakora and Phillips，2002）。香蕉通過根際分泌物影響根際微生物群落結構，同時香蕉的生長和抗病能力受土壤微生物多樣性及種群類型的影響。近幾年，研究發現可通過增施生物有機肥、覆蓋種植等方式調控香蕉根際微生物群落結構，從而提高香蕉產量和抗病力（Patti‐son et al.，2014；Huang et al.，2019；Shen et al.，2019）。此外，Zhou等（2019）通過對香蕉枯萎病患病和不患病土壤的細菌16S rRNA基因序列和真菌內轉錄間隔區（Internal transcribed spacer，ITS）序列分析發現，不患病土壤的芽胞桿菌屬（）、乳球菌屬（）和假單胞菌屬（）群落豐度比患病土壤的高。Kaushal等（2020）分析了患香蕉枯萎病和不發病的香蕉根際土壤中微生物群落結構的差異，發現是否患病是影響土壤真菌群落組成的最主要驅動因素?！颈狙芯壳腥朦c】微生物受生態環境的影響巨大，即使在同一片果園不同的農事操作亦可造成土壤微生物群落結構的差異。除研究發病與不發病香蕉根際土壤微生物群落的差異外，還需要探究健康香蕉根際土壤微生物群落的共性結構特征以及影響微生物群落主要驅動的土壤理化因子，為香蕉根際微生物調控提供理論參考。目前，關于香蕉塑造其根際微生物區系及與非根際土壤微生物差異性的共性特征研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】從廣西香蕉主產區東、中、西3個方位（浦北縣、隆安縣和龍州縣）各選取1個香蕉種植園為研究對象，以健康植株為目標，采用Illumina MiSeq高通量測序技術對土壤細菌群落進行分析，比較香蕉根際與非根際土壤細菌種類和多樣性的差異，分析土壤理化特性對土壤微生物豐度和多樣性的影響，以探究不同氣候和耕作條件下香蕉根際細菌的共性結構特征，探尋影響香蕉根際細菌群落結構的主要土壤理化因子，為深入理解香蕉根際微生物群落特征及制定調控策略提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年8 月，在廣西香蕉主產區東、中、西3個方位（浦北縣、隆安縣和龍州縣）各選取1個香蕉種植園，香蕉種植園信息見表1。選擇健康的香蕉植株（AAA Cavendish），在香蕉植株附近采用多點采樣混合法，用采樣器采集0~10 cm土壤樣品作為非根際土壤；采用抖動法采集供試香蕉根際土壤，用鐵鍬將離地面10 cm左右的香蕉根系挖出，抖落大土塊，收集附著在根系上的土壤作為根際土壤。采集的土壤樣品立即用無菌袋密封放進冰盒中帶回實驗室；每個地區的香蕉根際和非根際土壤均取8份作為8個重復，共采集48份樣品，所取土壤樣品置于-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。將采集的土壤樣品分成2份，1份于2 d內用于土壤微生物DNA的提取和測序分析，另1份冷凍干燥后研磨，用于土壤各理化指標的測定。樣品LZ1（LZ1_1、LZ1_2、LZ1_3、LZ1_4、LZ1_5、LZ1_6、LZ1_7、LZ1_8）和LZ2（LZ2_1、LZ2_2、LZ2_3、LZ2_4、LZ2_5、LZ2_6、LZ2_7、LZ2_8）分別代表采集自龍州縣的香蕉根際和非根際土壤樣品，每個樣品8個重復。樣品PB1（PB1_1、PB1_2、PB1_3、PB1_4、PB1_5、PB1_6、PB1_7、PB1_8）和PB2（PB2_1、PB2_2、PB2_3、PB2_4、PB2_5、PB2_6、PB2_7、PB2_8）分別代表采集自浦北縣的香蕉根際和非根際土壤樣品，每個樣品8個重復。樣品LN1（LN1_1、LN1_2、LN1_3、LN1_4、LN1_5、LN1_6、LN1_7、LN1_8）和LN2（LN2_1、LN2_2、LN2_3、LN2_4、LN2_5、LN2_6、LN2_7、LN2_8）分別代表采集自隆安縣的香蕉根際和非根際土壤樣品，每個樣品8個重復。

1.2 土壤理化性質測定

土壤經冷凍干燥后，研磨過100目篩，稱取10 g于100 mL離心管中，加入50 mL蒸餾水以攪拌器攪拌1 min，使土粒充分分散，放置30 min后進行測定。土壤pH通過多參數電導率儀進行測定。全氮（TN）和全磷（TP）含量采用過硫酸鉀氧化法測定，總有機質（SOM）含量采用重鉻酸鉀氧化—鐵鹽滴定法測定，速效磷（AP）含量采用鉬銻抗比色法測定；硝態氮（NN）和銨態氮（AN）含量用2 mol/L KCl溶液浸提法測定；速效鉀（AK）含量采用火焰光度計法（NH4OAc浸提）測定（劉欣等，2018）。

1.3 DNA提取、PCR擴增及擴增子測序

土壤樣品測序步驟：稱取0.5 g土壤，使用FastD‐NASpin Kit for Soil試劑盒提取土壤總DNA。利用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）/806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）進行16S rRNA擴增，每對正、反向引物均加不同的12 bp的barcode（Wang et al.，2020）。PCR 反應體系50.0 μL：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTPs 4.0 μL，5 U/μL的DNA聚合酶0.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL，DNA模板（20~30 ng/μL）1.0 μL，ddHO補足至50.0 μL。PCR擴增程序：94 °C預變性1 min；94 ℃20 s，57 ℃25 s，72 ℃45 s，進行30個循環；72 ℃延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物，并用E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit試劑盒進行純化。純化的PCR產物濃度利用Nanodrop Spectro‐photometer測定。每個PCR純化產物按150 ng的含量混合，樣本建庫后采用廣東美格基因科技有限公司的Illumina Miseq平臺測序完成。

1.4 測序數據分析

測序的原始數據在中國科學院生態環境研究中心的環境宏基因組分析平臺上完成（http：//mem.rcees.ac.cn：8080）（Feng et al.，2017；Kong et al.，2018）。分析步驟：通過barcodes對原始序列進行樣本分選，然后去除序列上的引物片段，再將上、下游序列進行拼接（Mago? and Salzberg，2011），將拼接后長度低于200 bp的序列去除。利用UPARSE算法檢查并去除嵌合體（Edgar，2013）。以97%為劃定閾值，將16S rRNA基因序列劃分為操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）。代表序列與RDP數據庫進行比對，進行物種注釋（Wang et al.，2007）。為避免由于不同測序深度帶來的影響，依據最低測序條帶數的樣本，對所有樣本進行重抽，使所有樣本具有相同序列數量。重抽后的OTU表用于進一步的分析。根據樣本OTU組成之間的unweighted unifrac距離矩陣，采用主坐標分析（Principal Coordi‐nates Analysis，PCoA）對細菌群落間的相似性進行分析。

1.5 統計分析

運用SPSS 26.0對環境因子與土壤細菌進行相關性分析。利用檢驗算法比較2組樣品土壤環境因子、多樣性指數及物種豐度之間的差異性。采用多因素方差分析（ADONIS）、相似性分析（ANOSIM）和多反應排列法（MRPP）分析組間細菌群落結構的差異水平。采用Mantel test分析確定影響細菌群落結構的重要環境因子。采用DPS 7.05分析土壤理化性質與細菌多樣性指數的差異顯著性。采用Excel 2011和Origin 8.0進行數據處理及繪圖。

2 結果與分析

2.1 香蕉根際和非根際土壤理化性質差異分析結果

從表2可知，3個地區香蕉種植園的土壤樣品除LZ2樣品顯中性外，其余5個樣品均顯酸性，其中，來源于浦北縣香蕉種植園的土壤pH最低，且3個地區的根際與非根際土壤pH均差異顯著（<0.05，下同）。除pH外，其他的土壤理化性質在3個地區表現不一，如TN、TP和SOM含量等在LN的香蕉根際與非根際土壤中差異顯著，但在PB的香蕉根際與非根際土壤中卻差異不顯著（>0.05，下同）?？傮w上，根際改變了土壤的部分理化性質，其中pH最明顯。

2.2 土壤細菌多樣性分析結果

高通量測序結果顯示，各樣品細菌測得的序列數為28361~138215個。按28361條序列重抽后，進行后續的OTU劃分和物種注釋等分析?；贠TUs水平，利用多樣性指數進一步分析比較3個地區香蕉種植園的根際與非根際土壤微生物群落多樣性差異。在土壤樣品Alpha多樣性分析中，Chao1指數和Rich‐ness指數值越高，反映群落的豐富度越高；Shannon指數和InvSimpson指數值越大，說明群落多樣性越高。由表3可看出，不同地區的香蕉根際與非根際土壤細菌群落中的菌群多樣性存在一定差異，在群落多樣性指數上，來源于LZ的根際與非根際土壤細菌差異顯著，但LN和PB的樣品細菌差異不顯著；在群落豐富度指數上，來源于PB的根際與非根際土壤細菌差異顯著，但LN和LZ的樣品細菌差異不顯著。換言之，根際環境在LZ地區影響了細菌的多樣性指數，在PB地區影響了細菌的豐富度指數。

利用Pearson相關性分析研究土壤理化性質與Alpha多樣性相互變化關系，得到兩兩之間的相關性和顯著性值，結果見表4。從表4可看出，在LN樣品中，TN含量與4個細菌Alpha多樣性指數均呈顯著正相關；TP含量僅與InvSimpson指數呈極顯著正相關（<0.01，下同）；SOM和AP含量僅與InvSimpson指數呈顯著正相關；NN含量與Shannon指數和Chao1指數呈顯著正相關、與InvSimpson指數和Richness指數呈極顯著正相關。在LZ樣品中，pH與InvSimpson指數呈顯著負相關；TN含量與Shannon指數呈顯著正相關、與InvSimpson指數呈極顯著正相關；TP含量與InvSimpson指數呈極顯著正相關；AP、NN和AK含量與Shannon指數呈顯著正相關、與InvSimpson指數呈極顯著正相關。在PB樣品中，僅pH與Richness指數呈顯著正相關、與Chao1指數呈極顯著正相關。以上結果說明，環境因子在不同地區的香蕉種植園對細菌的Alpha多樣性影響不一，表現出地區特異性。

2.3 香蕉根際和非根際土壤細菌物種豐度分析結果

由圖1可看出，在所有土壤樣品中，共有11個可注釋到的優勢門被檢出（豐度大于1%），包含變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、奇古菌門（Thaumarchaeota）、浮霉菌門（Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicro‐bia）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmati‐monadetes）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae），其中奇古菌門為古細菌。變形菌門和酸桿菌門為最占優勢的2個門，變形菌門在所有樣品中的豐度為17.25%~37.83%，酸桿菌門在所有樣品中的豐度為13.45%~23.03%，其中變形菌門在根際土壤中的豐度明顯高于非根際土壤，在LN、LZ和PB的根際土壤中的豐度分別為37.82%、29.19%和25.70%，在非根際土壤中的豐度分別為19.96%、17.25%和25.72%，同樣被富集的門包括放線菌門、芽單胞菌門和硝化螺旋菌門；酸桿菌門的豐度在根際土壤中被過濾，豐度明顯少于其在非根際土壤，在LN、LZ和PB的根際土壤中的豐度分別為14.02%、14.74%和13.45%，在非根際土壤中的豐度分別為22.03%、19.80%和23.03%，同樣被過濾的門還有浮霉菌門。

在屬分類水平上，相對豐度排名前10的菌屬分別為未分類菌屬（Unclassified）、酸桿菌屬（）Gp6、亞硝化球菌屬（）、、芽單胞菌屬（）、Subdivision3 genera incertaesedis、酸桿菌屬Gp2、酸桿菌屬Gp4、酸桿菌屬Gp1和酸桿菌屬Gp3。所有的樣品中，40.10%~46.84%的序列為Unclassified，豐度排名前25的菌屬中，在3個地區的香蕉根際均被富集的細菌屬為芽單胞菌屬、硝化螺旋菌屬（）、紅游動菌屬（）、鞘氨醇單胞菌屬（）、土微菌屬（）、、鏈霉菌屬（）和。被根際過濾的有酸桿菌屬Gp6、亞硝化球菌屬、酸桿菌屬Gp2和酸桿菌屬Gp3（圖2）。

2.4 香蕉根際和非根際土壤細菌群落及其與環境因子的相關分析結果

采用非參數檢驗方法ADONIS、ANOSIM 和MRPP分析3個地區香蕉種植園的根際與非根際土壤細菌群落結構的差異，結果（表5）顯示，3個地區香蕉種植園的根際與非根際土壤細菌群落結構均差異極顯著，說明香蕉根際均對土壤細菌有一定的塑造作用。

為探明不同地區香蕉種植園土壤細菌群落結構的影響因子，本研究利用Mantel test分析了pH、欲含水量（MC）、SOM、TN、TP、AP、NN、AN和AK與群落結構的相關性，結果（表6）顯示，在參與分析的9個環境因子中，LN地區的土壤細菌群落受影響的環境因子最多，pH、SOM、TN、TP、AP、NN和AN均與細菌群落顯著或極顯著相關；LZ地區的土壤細菌群落受影響的環境因子次之，受pH、TP、AP、NN和AK的顯著影響；PB地區的土壤細菌群落受影響的環境因子最少，僅與pH和AK極顯著相關。由此可見，不同地區的香蕉種植園土壤細菌受不同的理化性質調控，而3個地區的香蕉種植園土壤細菌均主要受pH的極顯著影響。

2.5 香蕉根際和非根際土壤細菌生態功能的共性規律分析結果

根據物種分類結果，通過FAPROTAX數據庫對香蕉種植園土壤細菌群落進行功能注釋，除未鑒定類群外，細菌獲得78種功能分組，豐度排名前20的功能分組見圖3。其中，豐度大于1%的只有7種，除Others外，剩下6種是可注釋的功能分組，分別為化能異養（Chemoheterotrophy）、好氧化能異養（Aero‐bic_chemoheterotrophy）、硝化（Nitrification）、好氧氨氧化（Aerobic_ammonia_oxidation）、動物寄生蟲或共生體（Animal parasites or symbionts）和硝酸鹽還原（Nitrate reduction）。其中化能異養和好氧化能異養是在根際土壤中最明顯的富集類群，化能異養菌群在LN、LZ 和PB 的根際土壤中的豐度分別為9.67%、7.04%和8.47%，在非根際土壤中的豐度分別為4.77%、4.73%和4.33%；好氧化能異養菌群在LN、LZ和PB的根際土壤中的豐度分別為9.20%、6.57%和7.96%，在非根際土壤中的豐度分別為4.39%、4.40%和4.08%；同樣被富集的功能包括掠食性或寄生性（Predatory or exoparasitic）和硝酸鹽還原；相反，硝化和好氧氨氧化菌群在根際土壤中的豐度明顯少于其在非根際土壤。

3 討論

香蕉種植園中的土壤生活著大量微生物，微生物群落結構的組成及其改變不但與根際養分時效性及植物生長發育等密切相關，而且能影響土傳病害的發生發展（漆艷香等，2019）。香蕉在與土壤微生物的長期互作過程中，香蕉能通過分泌根際分泌物等途徑演化形成其根際圈土壤菌群，這些根際微生物在平衡植物激素、調節根的生長、促進營養吸收、阻止病害侵襲等方面發揮著重要的防線作用（賈利華等，2019）。因此，研究香蕉種植園土壤微生物群落結構、驅動因素及規律，對香蕉在實際生產過程中的管理調控具有重要的參考價值。

本研究發現在3個不同地區香蕉種植園的根際及非根際土壤微生物群落差異顯著，在Chao1、Rich‐ness、Shannon和InvSimpson 4個多樣性指數上，3個地區香蕉根際土壤細菌群落的豐富度與多樣性均比非根際的更豐富，一般而言，較高的細菌多樣性表示土壤具有更高的抗性，意味著健康的香蕉根際能對附著的細菌產生一定的調控作用，使細菌朝著有利于植物的方向演變，與葛應蘭和孫廷（2020）的研究結果一致，他們發現馬鈴薯根際土壤細菌和真菌均勻度指數（Simpson）、多樣性指數（Shannon-Wie‐ner）、ACE和Chao 1指數均顯著高于非根際；然而，李怡等（2019）的研究結果表明，毛竹林地根際土壤細菌群落豐富度及多樣性均低于非根際土壤。這些結果說明，不同的植物根際對土壤微生物多樣性的影響表現出植物品種特異性。

在土壤細菌群落結構組成上，本研究發現，變形菌門（相對豐度為17.25%~37.83%）在3個香蕉種植地豐度最高，其次為酸桿菌門，與鄧大豪等（2019）的研究結果類似，其以廣西不同品種香蕉種植地土壤微生物為研究對象，發現豐度最高的變形菌門占比為17.947%~45.01%。Shen等（2015）對抑病型香蕉土壤微生物進行測序分析，同樣發現變形菌門和酸桿菌門是豐度最高的2個門；Wang等（2020）發現在甘蔗根際微生物中，變形菌門也是最豐富的優勢門。植物根際和非根際土壤中細菌群落結構的差異，歸因于植物對微生物群落具有強烈的選擇作用，而且微生物群落結構的變化與微生物功能類群息息相關，且能影響環境的生態功能（Fuhrman，2009）。前人多項研究表明，植物根際能招募有益于自身的微生物菌群來促進植物生長和抵抗病原菌的入侵，如被病原菌侵染的擬南芥可通過改變根系分泌物成分招募有益微生物群落，并促進后代植物對病原菌的抵抗力（Yuan et al.，2018）；Liu等（2021）發現小麥根際能招募嗜根寡養單胞菌（）（SR80），保護植物對抗病原體假禾谷鐮孢菌（）。本研究同樣發現，3個地區的健康香蕉植株的根際能富集一些有益的微生物類群，在門的水平，變形菌門在3個地區的根際土壤中豐度均明顯高于非根際土壤，而且差異顯著，沈宗專（2015）發現抑病型土壤中變形菌門的豐度顯著高于導病型土壤，同樣被根際富集的放線菌門是環境中一類重要的微生物，在促進植物生長和防治病害方面發揮重要作用。在屬的水平上芽單胞菌屬、鏈霉菌屬和鞘氨醇單胞菌的豐度在3個地區的香蕉根際土壤均高于非根際土壤，沈宗專（2015）發現施用生物有機肥能增加芽單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬在香蕉種植園土壤中的豐度，并且它們的豐度與香蕉枯萎病發病率間呈負相關關系，表明它們的存在能起到抑制香蕉病害發生的作用。Yin等（2021）研究也發現土壤中的鏈霉菌和鞘氨醇單胞菌能抑制真菌病害的發生。此外，被富集的芽單胞菌屬還具有降解根際土壤中的纖維素和木質素，增加土壤有機質含量和促進根際微生物固氮的作用（Xie et al.，2020；Hu et al.，2021）。Wang等（2020）的研究發現，施用除草劑氯吡嘧磺隆的土壤，其微生物群落結構和優勢種群發生了明顯改變，藍藻細菌門（Cyanobacteria）和unclassified Chloroflexi種群數量明顯增加并積極參與氯吡嘧磺隆生物降解過程。本研究通過FAPROTAX數據庫功能注釋發現，細菌功能較豐富，其中化能異養菌群和好氧化能異養菌群的占比較大，而且在根際土壤中的豐度明顯高于非根際土壤，高比例的化能異養菌有助于香蕉種植園中有機質的分解利用，同樣能促進植物的營養吸收和養分循環。未來的工作將結合根際代謝組學進一步揭示香蕉根際對微生物組構建的作用機制。

土壤理化性質與微生物群落組成和功能組成均具有緊密聯系，本研究分析結果表明，3個地區香蕉種植園的土壤微生物群落均受到土壤理化性質的影響，但不同地區的土壤微生物群落受不同的土壤理化性質影響，除地理因素影響外，同一地區的香蕉種植園的土壤微生物群落均受pH的極顯著影響。pH是對土壤微生物群落影響的最重要環境因子，如Shi等（2018）通過空間尺度分析243個土壤樣本的細菌群落結構特征，發現pH是影響華北平原土壤微生物群落結構的最重要影響因子；葛應蘭和孫廷（2020）發現土壤pH是馬鈴薯根際土壤微生物多樣性的重要影響因子。除pH外，TN、TP和AN等對土壤微生物群落結構也有影響。以上結果證明，由于不同地區土壤具備不同的理化性質特點，從而對微生物群落的影響因素并不相同，但pH在3個地區均能極顯著影響微生物的群落結構，是一個重要的調控因子。

4 結論

3個地區香蕉種植園根際土壤細菌群落多樣性均高于非根際土壤，而兩者間微生物群落結構也存在明顯差異，根際能富集一些有益菌群并招募有益的功能細菌。土壤微生物群落多樣性和組成在不同地區間的差異明顯，每個地區的土壤微生物群落結構和多樣性受不同的環境因子影響，與土壤理化性質密切相關，其中土壤pH對3個地區香蕉種植園的土壤細菌群落均起著重要的調節作用。