木奶果種質資源的遺傳多樣性分析及DNA指紋圖譜構建

周彩霞，羅培四，孔方南，蔣娟娟，卓福昌，李文硯，周 婧，韋 優

（廣西農業科學院廣西南亞熱帶農業科學研究所，廣西崇左 532415）

0 引言

【研究意義】木奶果（Lour.）為大戟科、木奶果屬常綠喬木，產于廣東、海南、廣西和云南，生于海拔100~1300 m的山地林中，在印度、緬甸、泰國、越南、老撾、柬埔寨和馬來西亞等地區也有分布（中國科學院中國植物志編輯委員會，1994），是一種集食用、藥用和觀賞為一體的熱帶特色優稀果樹（劉明生，2003；徐靜等，2007a，2007b；羅培四等，2014）。我國木奶果種質資源豐富，但尚無商業化優良品種，多以野生半野生狀態分布（林書生和羅志文，2013；羅浩城等，2017）。因此，明確木奶果種質資源遺傳多樣性，探討其親緣關系，初步構建DNA指紋圖譜，對木奶果種質資源的保存、鑒定及優異品種選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，關于木奶果的研究報道大多為藥用價值分析（Hos‐sain，2017；Nesa et al.，2018；Kumar et al.，2018；鄭曉燕等，2018）、成分測定和提取工藝（李文硯等，2015；鄧浩等，2016；郭馨欣等，2019）、生理抗性（Bai et al.，2012；Wen et al.，2016）、種質繁育（羅培四，2017；廖美蘭等，2020）以及優良單株篩選（羅培四等，2014；陳國德等，2019）等。國內外關于利用分子標記對木奶果進行遺傳學相關研究的報道均較少，羅培四（2017）運用SCoT分子標記對37份來自廣西、廣東、海南和云南的木奶果種質進行遺傳多樣性和親緣關系分析分析，結果顯示37份種質在9條SCoT引物中擴增獲得109個位點，多態位點率為86.24%，表明SCoT分子標記可應用于木奶果的遺傳多樣性分析，且在木奶果鑒定中具有一定的潛力；Chik‐mawati（2019）通過ISSR標記對木奶果同屬的另一個種（）進行了遺傳多樣性及種群結構分析。目標起始密碼子多態性（Start codon tar‐geted polymorphism，SCoT）分子標記是一種基于單引物擴增目的基因的共顯性中性分子標記方法，與傳統的分子標記相比，其能有效產生與性狀連鎖的標記，是一種能跟蹤性狀的新型分子標記，最早由Collard和Mackill（2009）提出并在水稻上應用，因其重復性好、靈敏度高、穩定性強、操作簡單、成本較低、引物通用、多態性高、遺傳信息豐富等優點（龍治堅，2015）被廣泛用于植物資源的研究，如割手密（羅霆等，2013）、芥菜（林清等，2013）、番木瓜（楊祥燕等，2013）、鴨茅（蔣林峰等，2014）、枸杞（查美琴等，2016）、皂莢（張安世等，2017a）、獼猴桃（張安世等，2017b）、柑橘（韓國輝等，2019）、楊桃（歐景莉等，2019）、地黃（楊珂等，2019）等種質資源的遺傳多樣性研究、親緣關系研究及指紋圖譜構建等?！颈狙芯壳腥朦c】雖然羅培四（2017）已采用過SCoT分子標記對部分木奶果種質資源進行遺傳多樣性分析，但涉及到的種質資源份數較少，且未構建DNA指紋圖譜的相關研究報道?！緮M解決的關鍵問題】利用SCoT分子標記對63份木奶果種質資源進行遺傳多樣性分析，篩選出多態性較高的引物并構建木奶果DNA指紋圖譜，以期為木奶果種質資源的分類鑒定、保存和利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的63份木奶果種質資源是由本研究課題組從廣西、云南、海南和廣東收集而來的野生或半野生種質（表1），地理位置為100°47′E~110°02′E，18°04′N~23°06′N，海拔18~1119 m，現嫁接保存于廣西南亞熱帶農業科學研究所的木奶果種質資源圃內。主要試劑：MiniBEST Plant Genomic DNA Extrac‐tion Kit試劑盒、TaKaRaDNA聚合酶以及dNTP Mixture均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；其他生化試劑及引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設備：梯度PCR儀（Easy Cycler，德國AnalytikJena）、全自動化學發光/熒光圖像分析系統（5200Multi，上海天能科技有限公司）、臺式冷凍離心機（5430R，德國Eppendorf）和電泳儀（DYCZ-20G，北京六一生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取及檢測 采用MiniBEST植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，并取1.0 μL DNA樣品用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（電壓為120V，30 min），將DNA濃度稀釋至10 ng/μL，于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 引物篩選及SCoT-PCR擴增 從供試材料中選取地理位置相差較遠的3個供試材料（種質編號為33、45和61號），分別以三者DNA樣品為模板對75條SCoT引物（Collard and Mackill，2009；羅聰，2012）進行篩選，選出條帶清晰、重復性好和多態性豐富的6條SCoT引物（表2）用于本研究。SCoT-PCR反應體系：10×PCR Buffer（Mgplus）2.50 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 0.50 μL，25 mmol/L MgCl2.0 μL，5 U/μLDNA聚合酶0.13 μL，10 μmol/L SCoT引物1.00 μL，10 ng/μL DNA模板5.00 μL，ddHO補足至25.00 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃50 s，50 ℃1 min，72 ℃2 min，共進行38個循環；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR產物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，隨后銀染顯影。

1.2.3 數據分析 利用WPS進行數據整理及統計，多肽性信息量（Polymorphic information content，PIC）計算公式為：

其中，為基因座位上第等位基因的頻率（段艷鳳等，2009）。利用Popgene 1.32計算等位基因數（Observed number of alleles，）、有效等位基因數（Effective number of alleles，）、Shannon’s信息指數（Shannon’s information index，）、Nei’s基因多樣性指數（Nei’s gene diversity，）。利用NTsys 2.10e的非加權配對平均法（UPGMA）進行聚類分析。參考聶新輝等（2014）的方法略作修改，將引物在樣品中擴增得到的（0，1）數據轉化為十六進制數據，該十六進制數據代表每個引物的擴增結果，利用篩選出的引物組合十六進制數字串作為供試種質資源的數字指紋。

2 結果與分析

2.1 SCoT標記多態性檢測結果

利用篩選出的6條SCoT引物從63份木奶果種質資源中共擴增出192條條帶（表3），其中多態性條帶188條，多態性比率為97.86%；每條引物擴增的條帶數為26~36條，平均為32條，多態性條帶數為26~36條，平均每條引物可擴增出31.33條多態性條帶，多態性比率為90.00%~100.00%；PIC為0.9052~0.9527，平均為0.9319，為0.2459~0.3878，平均為0.3238；'為0.1476~0.2412，平均為0.1984；為1.9000~2.0000，平均為1.9786；為1.2324~1.3700，平均為1.3052，說明所篩選的6條SCoT引物的多態性檢測效率較高，適用于木奶果種質資源的遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建，從而實現種質鑒定。

2.2 遺傳相似性及聚類分析結果

利用NTsys 2.10e計算63份木奶果種質資源間的遺傳相似系數，結果表明供試材料間的遺傳相似系數為0.5781~0.9115，平均為0.7496，變幅為0.3334。其中，親緣關系最近的是來自廣西的2號與3號種質，以及來自海南的59號與61號種質，遺傳相似系數最大，為0.9115；親緣關系最遠的是來自廣西的32號種質和來自海南的59號種質，遺傳相似系數最小，為0.5781。綜上所述，親緣關系的遠近或與種質的來源具有一定的相關性，即來自同一地區的種質遺傳相似度更高，親緣關系更近，而來自不同地區的種質親緣關系更遠。

UPGMA法聚類分析結果（圖2）顯示，63份木奶果種質資源在遺傳相似系數0.7100時可分成5組（A~E），其中A組包含1份來自廣西龍州縣的種質（編號39）和1份來自廣西大新縣的種質（編號32）；B組為1份來自廣西大新縣的種質（編號12）；C組為2份來自云南景洪市的資源（編號42和45）和2份來自云南江城縣的種質（編號46和49）；D組為6份來自海南和廣東的全部種質（編號58~63）；E組為剩余的50份種質。

2.3 DNA指紋圖譜初步構建結果

6條SCoT引物擴增出的多態性條帶存在明顯差異，說明其區分種質資源的種類和數量也各不相同。單條引物可區分的種質份數為49~63份，平均為58份。其中，引物SCoT32可擴增出30條多態性條帶，且能單獨將供試的63份種質資源全部區分開；其他引物均需兩兩組合才能將供試的種質資源全部區分開，如引物SCoT49與引物SCoT66組合、引物SCoT49與引物SCoT74組合、引物SCoT66與引物SCoT68組合、引物SCoT66與引物SCoT74組合、引物SCoT68與引物SCoT74組合、引物SCoT73與引物SCoT74組合。

6條SCoT引物對63份木奶果種質資源的擴增結果顯示，有13份種質資源具有特征引物，即僅用一條引物就能區分該種質與其他種質。其中，11、13、17、20、25、28、39、40、52和53號種質均各有1條特征引物，23、49和50號種質分別有2條特征引物。在供試的6條SCoT引物中，除了引物SCoT49無特征譜帶，其余5條引物均有特征譜帶，且一共產生了16條特征譜帶（表4加粗部分為含有特征譜帶的十六進制數），說明這5條引物可有效用于木奶果指紋圖譜的構建。

綜合考慮引物擴增的多態性條帶數、重復性以及鑒別種質資源的能力等因素，從篩選出的6條SCoT引物中進一步篩選出5條SCoT引物用于木奶果種質資源的DNA指紋圖譜構建，以十六進制數代表相應引物下擴增的（0，1）數據（表4）。

3 討論

多態性是評價分子標記的重要依據，而評價分子標記多態性的主要參數包括DNA擴增的總位點數、多態性位點數、多態性比率、、、PIC等（楊祥燕等，2013；張安世等，2017a，2017b；李瓊等，2021）。本研究篩選出的6條SCoT引物對63份木奶果種質資源共擴增出192個位點，多態性位點188個，多態性比率達97.86%，為0.1476~0.2412，平均為0.1984，為0.2459~0.3878，平均為0.3238，平均每條引物的PIC達0.9319，遠大于0.5000，說明篩選出的6條SCoT引物在木奶果種質資源中具有較高的多態性，可將其用于木奶果種質資源的遺傳多樣性分析、DNA圖譜構建、種質鑒定及基因定位等工作。

種質資源是遺傳育種的物質基礎，遺傳多樣性水平代表了該物種在特定環境中基因的豐富程度（查美琴等，2016），了解種質資源的遺傳多樣性和親緣關系，對親本選配具有重要意義。從分子水平上來說，遺傳相似系數越小，變幅越大，則表明該物種的遺傳分化越大，遺傳多樣性越高，遺傳背景也就越復雜（苗晗等，2014）。在本研究中，供試的63份木奶果種質資源的遺傳相似系數為0.5781~0.9115，變幅為0.3334，大部分種質資源間的遺傳相似系數為0.7100~0.7900，占比達63.08%，說明這63份種質的遺傳背景較寬且遺傳多樣性十分豐富；聚類分析結果顯示，供試的種質在遺傳系數為0.7100時可分為5組，呈現出一定的地域差異，少數相同地理來源的種質親緣關系較近，但還有大部分不同地區的種質相互混雜，可能是受人類的生產活動以及環境氣候因素影響所致（Chikmawati，2019）。同時，本研究供試種質材料地域來源不夠豐富，廣西的種質39份、云南的種質18份、海南的種質5份、廣東的種質僅有1份，且均為海拔1119 m以下的地區，未能完全覆蓋木奶果分布的地區，在今后的種質資源收集過程中可適當地拓寬收集范圍，以擴充木奶果的種質庫；從聚類分析結果可看出，來自廣西的2號種質（PDong2）和3號種質（PDong6）、來自海南的59號種質（MG2）和61號種質（NW2）的親緣關系十分相近，遺傳相似系數均為0.9115，說明供試材料中可能存在一部分冗余的種質資源，可能會影響到整個種質資源群體的遺傳多樣性，但由于現保存的種質僅為1~2年生的嫁接苗，尚未開花結果，未能對其進行系統地形態學觀察。在今后的研究中，可結合形態標記對種質資源進行適當地剔除，篩選出具有代表性的種質，構建核心種質群體，為木奶果種質資源的科學保存和開發利用提供理論參考。

DNA指紋圖譜出現在20世紀80年代，是指DNA樣品經特定的分子標記技術處理所顯示出具有特定DNA片段的總稱（Vos et al.，1995），是鑒定個體身份的精確方法，在法醫學、親子鑒定及移民身份確定等方面得到廣泛應用（郭曉強和馮志霞，2008）。國際植物新品種保護聯盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV）已將DNA標記的鑒定納入農作物品種DUS測試內容，我國也將DNA指紋圖譜鑒定作為品種質量監控的重要措施之一（苗晗等，2014）。與傳統的種質鑒定分類方法相比，DNA指紋圖譜能準確、快速地揭示植物種質間的遺傳差異，在品種鑒定、品種注冊、分辨真假雜種及知識產權保護等方面具有重要的作用（楊祥燕等，2013）。DNA指紋分析的方法主要有特征譜帶法、引物組合法和核心引物組合法（王鳳格等，2003；王輝麗等，2022）。本研究中，引物SCoT32、SCoT66、SCoT68、SCoT73和SCoT74均可擴增特征譜帶，能單獨將某份種質從供試的63份種質資源中區分出來，其中，引物SCoT32雖然只有一條特征譜帶，但僅通過引物SCoT32就能將所有供試材料區分開來，說明引物SCoT32可作為鑒別木奶果種質資源的核心引物。隨著收集種質數量的不斷增多，種質間的親緣關系可能會更近，差異更小，引物SCoT32的鑒別能力可能會漸漸減弱，這時就需要增加新的引物對種質進行區分，結果發現，引物SCoT66、SCoT68、SCoT73和SCoT74通過兩兩組合的方式也能將供試的63份種質資源全部區分開，表明利用篩選出的5條引物組合初步構建木奶果種質資源的DNA指紋圖譜具有一定的合理性，在今后的木奶果種質資源鑒定和DNA指紋圖譜構建工作中可優先考慮以上5條引物。本研究僅僅運用SCoT分子標記對63份木奶果種質資源進行初步分析，今后仍需結合多種分子標記以及形態學、細胞學、同工酶等方法進行深入探討，為木奶果種質資源的分類鑒定、保存利用以及篩選核心種質等工作提供更科學可靠的依據；同時，也需要制定更完善的木奶果種質資源評價體系，將種質資源收集范圍擴大到國內更多地區以及印度、緬甸等國外地區，做到應保盡保，建立木奶果核心種質資源圃。

4 結論

供試的63份木奶果種質資源具有豐富的遺傳多樣性，種質間的親緣關系與地域有一定的相關性。所篩選的6條SCoT引物具有較強的多態性，適用于木奶果種質資源的評價鑒定、遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建等研究。