Y染色體無精子癥因子c區缺失男性不育患者同步顯微取精術后行卵胞漿內單精子顯微注射的臨床結局

毛加明，趙連明，劉德風，林浩成，楊宇卓，張海濤，洪 鍇，李 蓉，姜 輝△

(北京大學第三醫院 1. 生殖醫學中心，2. 泌尿外科， 北京 100191)

臨床流行病學調查顯示10%～15%的育齡期夫婦遭受不孕不育的困擾，約50%存在男性不育因素[1]；其中10%～15%的男性不育患者為無精子癥，包括梗阻性無精子癥和非梗阻性無精子癥(non-obstructive azoospermia，NOA)。研究表明15%～20%的嚴重男性不育患者，包括嚴重少精子癥和NOA是由遺傳學因素所致，發病率最高的是克蘭費爾特綜合征(Klinefelter syndrome)，其次是Y染色體長臂上無精子癥因子(azoospermia factor，AZF)的缺失，包括AZFa、AZFb和AZFc三個區域[1-2]。在NOA患者中有10%～15%存在Y染色體AZF缺失，其中AZFc缺失為AZF缺失的主要類型[3-4]。

1999 年Schlegel[5]報道了顯微取精術對NOA的治療，顯微取精術明顯提高了NOA患者的精子獲得率(sperm retrieval rate, SRR)， 減少了睪丸取精手術對睪丸的損傷，國內外的多項研究結果均推薦顯微取精術作為NOA患者睪丸取精手術的金標準[6-7]。北京大學第三醫院生殖醫學中心男科專業組手術團隊自2010 年開始開展顯微取精術，趙連明等[8]在國內率先報道了從3 例非嵌合型克蘭費爾特綜合征患者中成功獲取精子并進行體外受精-胚胎移植助孕的案例，目前北京大學第三醫院團隊累計完成了逾2 000例次的顯微取精術。

國內外的研究顯示，AZFc缺失所致的男性不育患者大約50%～70%可以通過顯微取精術的方式成功獲取睪丸精子[4，7]，結合卵胞漿內單精子顯微注射(introcytoplasmic sperm injection, ICSI)輔助生殖技術有機會孕育具有自己生物學特征的子代。北京大學第三醫院對男性不育患者行顯微取精術的手術時機主要有兩種方式，第一種方式是非同步手術，即男方先行顯微取精術，如果術中發現精子，則予以冷凍保存，女方擇期行控制性促排取卵，男方解凍精子行ICSI助孕；第二種方式則是同步手術，即在女方取卵的當日或者前一日男方行顯微取精手術，如果術中發現精子，則使用新鮮的精子進行ICSI助孕。兩種手術方案各有優缺點，但根據我們的臨床經驗，在AZFc缺失導致的NOA患者中，雖然精子獲得率相對較高，但術中獲取的睪丸精子數量較少、質量欠佳，非同步顯微取精方案中精子凍存-解凍復蘇后可能會影響后期行ICSI助孕的臨床結局。

為了進一步評估同步顯微取精術結合ICSI助孕對AZFc微缺失男性不育患者的臨床治療效果，指導AZFc缺失患者的治療，我們追蹤隨訪了同步顯微取精術中成功獲取睪丸精子的AZFc缺失患者行ICSI助孕的臨床結局，包括受精率、臨床妊娠率、流產率和活產率等。

1 資料與方法

本研究獲得北京大學第三醫院生殖倫理委員會批準(批準號：2021SZ-011)， 納入研究的患者均簽署知情同意書。自2015年1月至2019年12月共有195例AZFc缺失所致的男性不育患者在北京大學第三醫院接受顯微取精術，隨訪了手術成功發現精子的患者，選擇夫妻雙方同步取精、取卵且不行胚胎植入前遺傳性檢測(preimplantation genetic testing，PGT)的不孕不育夫婦,并觀察其臨床治療結局。納入研究的患者在術前均進行了Y染色體AZF基因檢測，診斷標準參考《男性生殖相關基因檢測專家共識》，其中sY254及sY255兩個位點同時缺失診斷為AZFc缺失[9]；所有患者均行染色體核型分析檢測,并排除染色體異常的情況；在手術前男方再次手淫取精液送檢，精液中未發現精子再行顯微取精術，如精液中發現精子，則取消顯微取精術。顯微取精手術的手術方式參考Schlegel[5]以及我們之前的研究描述[8]。

使用SPSS 26.0進行相關的統計學工作，計數資料采用率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

共有195例AZFc缺失的NOA患者在北京大學第三醫院行顯微取精術，其中14例為隱匿性無精子癥，術中均成功發現精子，精子獲得率為100%(14/14)； 181例為NOA，122例成功發現精子，精子獲得率為67.4%(122/181)， 余59例NOA患者在顯微取精術中未發現精子，占32.6%(59/181)。

有99例患者選擇同步顯微取精手術且選擇不進行PGT，共進行了118人次顯微取精術以及120個ICSI周期助孕，最終有38人成功活產，累積活產率38.4%(38/99)， 總共分娩出22個健康男嬰和22個健康女嬰。

首次同步顯微取精并成功獲取精子的99例患者進行了99個新鮮精子-ICSI周期助孕，共進行了53個新鮮胚胎移植周期和36個解凍胚胎移植周期，有28例患者成功活產；受精率、新鮮周期臨床妊娠率、解凍周期臨床妊娠率、流產率、取卵周期累積活產率分別為31.6%、40.5%、33.3%、6.7%和28.3%， 其中2位患者有凍存精子，分別行解凍精子-ICSI助孕，新鮮移植2次，均成功活產。

有17例首次同步周期未成功活產的不育患者選擇了第二次行同步顯微取精手術，術中均成功發現精子并行ICSI助孕，最終7例成功活產，取卵周期累積活產率為41.2%(7/17)， 其中2例前兩次同步周期均未成功活產的患者進行了第三次同步顯微取精術，術中均成功發現精子行ICSI助孕，其中1人成功活產。

我們比較了首次以及第二次同步手術患者使用新鮮睪丸精子進行ICSI的臨床結局，兩組間的平均獲卵數以及平均成熟卵子數差異無統計學意義；首次同步手術組的受精率為31.6%，明顯低于第二次同步手術組45.8%，差異有統計學意義；兩組的優質胚胎率、新鮮移植周期臨床妊娠率和最終的周期活產率分別為47.7%vs. 50.4%、40.5%vs. 50.0%、28.3%vs. 41.2%，第二次手術組略高于首次同步手術組，但組間差異沒有統計學意義(表1)。

表1 Y染色體無精子癥因子c區缺失患者首次及第二、三次同步顯微取精術后行卵胞漿內單精子顯微注射治療結局比較Table 1 Comparison of intracytoplasmic sperm injection outcomes in azoospermia factor c region deletion patients after the first, second and third synchronous procedure

3 討論

AZF存在于Y染色體長臂上，分為AZFa、AZFb和AZFc 3個區域，其中AZFa缺失和AZFb缺失的患者主要表現為NOA。目前的研究結果提示對存在AZFa和/或AZFb缺失的NOA患者，行顯微取精術的精子獲得率極低，很難通過自然受孕或者ICSI的方式將缺陷基因傳遞給后代，建議直接行供精輔助生育或者領養，不推薦行有創的顯微取精術[3-4，6]。盡管有個案報道精液中存在極少量精子或行睪丸取精成功發現精子并行ICSI助孕，考慮可能是AZFa/b區部分缺失所致[3]。

Y染色體的AZFc區域富含擴增子和回文序列，特別容易通過非同源重組進行結構重排，如刪除和復制，所以在AZFc更容易出現缺失現象，研究顯示AZFc缺失占所有AZF缺失類型的57%,為AZF缺失的主要類型[3-4]，且臨床表現具有較大的異質性，有自然受孕生育的個案報道，但絕大部分AZFc缺失的患者存在一定程度的睪丸生精功能障礙，臨床表現為男性不育。目前研究結果顯示使用精液精子或睪丸精子行ICSI助孕，患者有生育具有自己生物學特征的后代的機會[10-12]。

3.1 AZFc缺失對睪丸取精成功率的影響

AZFc缺失是導致睪丸生精功能障礙的遺傳學因素，精液檢查結果顯示嚴重少精子癥或NOA，但大多數AZFc缺失患者在精液中即可發現足夠ICSI使用的精子，建議對AZFc缺失的患者進行多次詳細的精液檢查分析，尤其是在常規鏡檢未發現精子的情況下，將整個精液離心后再次進行仔細的檢查，一旦精液中發現活動的可用精子，即可直接行ICSI助孕。對NOA患者則需要我們使用外科手術的方法從睪丸中獲取精子進行ICSI助孕，而隱匿性精子癥患者，即常規精液顯微鏡檢查未見精子，離心鏡檢后偶見精子，或者多次精液分析有時候離心后顯微鏡下檢查可見精子，有時候精液離心后顯微鏡下檢查也找不到精子，北京大學第三醫院常規會選擇準備顯微取精術方案，即對男方提前做好手術準備，女方取卵日男方先進行常規手淫取精液送胚胎實驗室檢查，如果精液中找不到可用精子，我們同期進行顯微取精術。本研究中14例為隱匿性精子癥患者在女方取卵日精液中未發現可用精子，行顯微取精術術中均成功發現足夠的新鮮睪丸精子并行ICSI助孕，精子獲得率為100%(14/14)。

目前研究結果顯示，AZFc缺失的NOA患者行睪丸取精術的SRR在13%到100%之間，在32項研究中SRR平均值為47%[4]，不同研究的SRR差異較大，原因有三個：一是與納入研究患者的AZFc缺失的范圍和臨床表現有關，AZFc缺失患者的精液檢查結果從嚴重少精子癥到非梗阻性無精子癥，睪丸病理從生精功能低下到完全的唯支持細胞綜合征，不同患者睪丸的生精功能差別較大，我們會對患者進行多次仔細的精液檢查分析，術前也常規行一次手淫取精送胚胎實驗室檢查，如果精液中發現可用精子則取消顯微取精術；二是手術醫師的臨床經驗，顯微取精術需要在顯微鏡放大情況下探查整個睪丸組織，手術結束的標志為發現足夠的可用精子或者探查完整個睪丸組織，如果經驗不足或手術時間過短，可能遺漏有生精功能的區域；三是胚胎實驗室專家術中尋找精子的經驗，對術中獲取的較好的生精小管需要物理性粉碎并在倒置顯微鏡下仔細尋找成熟的精子，為了提升效率和保障質量，北京大學第三醫院常規安排兩名資深的實驗室專家術中負責生精小管的粉碎和精子的尋找工作。本研究中181例非梗阻性無精子癥，精子獲得率為67.4%(122/181)， 處于較好的水平。

AZFc缺失的患者術前是否需要行睪丸穿刺活檢，以及睪丸組織病理結果對顯微取精成功率的預測作用，這些存在一定的爭議性。一項納入了19項研究的系統性綜述選取了178例AZFc缺失患者的睪丸病理[4]，結果顯示唯支持細胞綜合征占46%，成熟阻滯占38%，生精功能低下占 16%。Kalsi等[13]的研究結果顯示，睪丸病理類型為唯支持細胞綜合征、成熟阻滯和生精功能低下的SRR分別為42.85%、26.6% 和75.86%，生精功能低下的SRR最高，其中35例經過傳統的睪丸切開/穿刺或者活檢未發現精子的NOA患者，進行顯微取精術的SRR為57.1%(20/35)， 提示血清卵泡刺激素水平或者睪丸組織病理結果均不能用作顯微取精術SRR的有效預測指標，不建議對NOA患者進行單純診斷性活檢，根據我們的臨床經驗，AZFc缺失患者的睪丸生精功能存在很大的異質性，睪丸組織內可能同時包含了三種病理組織類型，所以簡單的睪丸組織病理檢查結果很難代表整個睪丸實際的生精情況。趙連明等[10]研究提示，對AZFc缺失的患者，行傳統的睪丸穿刺取精的精子獲得率為34.7%(17/49)， 其中穿刺活檢未見精子的6例NOA患者，4例行顯微取精后成功獲取精子。在本研究中181例非梗阻性無精子癥精子獲得率為67.4%(122/181)， 幾乎兩倍于傳統的睪丸穿刺取精術。

考慮睪丸活檢病理結果對后續的顯微取精預測價值有限，而對于傳統的睪丸切開取精失敗的患者，仍然有機會行顯微取精術發現可用于ICSI的成熟精子，所以我們建議對AZFc導致的NOA患者可直接選擇顯微取精術，以提高術中找到精子的概率，以及獲得足夠數量和質量的精子用于ICSI助孕，同時也避免睪丸活檢術對睪丸組織造成額外的損傷。

3.2 AZFc缺失對ICSI臨床結局的影響

目前已經有很多的研究關注了Y染色體的AZFc缺失是否會對ICSI后胚胎發育情況以及后續的早期流產率和活產率造成影響，研究結果具有一定的爭議性。

北京大學第三醫院Liu等[11]曾對AZFc缺失所致的少精子癥患者與同期不存在基因缺失的患者行輔助生殖技術助孕的臨床結局進行比較研究，結果顯示盡管AZFc缺失組受精率較低(61.8%vs.67.8%，P<0.05)、卵裂胚胎率較高(94.0%vs.88.1%，P<0.05)，但兩組在優胚率、臨床妊娠率、異位妊娠率、流產率、早產率方面差異均無統計學意義，提示少精子癥患者中AZFc基因缺失不影響臨床治療結局。Zhang等[12]近期的研究結果顯示，在少精子癥或無精癥的男性不育患者中，AZFc缺失的實驗組與沒有AZFc缺失的對照組相比，累積臨床妊娠率為45.39%vs.67.49%(OR=2.843)、累積活產率為35.15%vs.53.44%(OR=2.234)、無胚胎移植周期率為15.07%vs.8.23%(OR=0.565)、受精率為46.80%vs.53.37%，兩組間差異有統計學意義，提示AZFc微缺失會對ICSI結果產生不利影響，這些研究結果的不一致性，考慮與納入研究的人群不一致有關，前一個研究只納入了少精子癥患者，精子來源為精液精子，后一個研究同時納入了少精子癥和無精子癥，精子來源于精液或者睪丸，我們推測盡管同樣都是AZFc缺失的不育人群，非梗阻性無精子癥與少精子癥對臨床治療結局的影響有所不同。

一項新的系統性分析研究顯示[14]，存在Y染色體微缺失與沒有微缺失的男性不育患者行ICSI助孕，其受精率、臨床妊娠率和活產率分別為61.8%(5 440/8 801)vs.69.8%(3 940/5 645)、30.4%(249/818)vs.43.2%(134/310)和25.4%(223/879)vs.42.2%(265/628)，其中對AZFc缺失男性進行輔助生殖技術，累積受精率、臨床妊娠率和活產率分別為59.8%、28.6%(167/584) 和23.4%(167/584)，顯示Y染色體微缺失會影響輔助生殖的成功率，該研究進一步探討了不同精子來源對ICSI助孕臨床結局的影響，睪丸精子組與精液精子組的受精率為38.6%(73/189)vs.60.5%(1 389/2 297)， 臨床妊娠率為38.5% (10/26)vs.31.4% (54/172)，活產率為42.9% (9/21)vs.25.3% (43/170)，該研究的局限性在于沒有區分Y染色體微缺失的類型，而且在臨床妊娠率和活產率方面納入的病例數據較少，也影響了研究的準確性。另一項系統回顧和薈萃分析研究同樣比較了AZFc缺失的男性不育患者中不同來源的精子對治療結局影響，結果顯示在AZFc微缺失的男性不育患者中，睪丸精子組和精液精子組在臨床妊娠率、流產率和周期活產率之間差異沒有統計學意義，建議對AZFc缺失所致的少精子癥患者優先使用精液精子進行ICSI[15]。

根據上面的研究，我們推測同樣為AZFc缺失的患者，少精子癥與NOA患者進行ICSI可能有不一樣的臨床結局，需要進一步的研究以明確。

3.3 AZFc缺失對子代健康的影響

通過ICSI輔助生殖的幫助，很多AZFc缺失的父親有機會獲得自己遺傳學特征的子代，而且會把AZFc缺失的Y染色體垂直傳播給男性子代。很多研究關注了垂直傳播過程中缺失的類型是否會擴大并加重男性子代的生育問題，以及男性子代是否有自然受孕的機會及其他健康問題，但研究結論具有一定的爭議性。

有個案研究報道了Y染色體微缺失在父子之間直接通過自然生育垂直傳播的情況[16-17]，其中Chang等[17]的研究中有生育能力的父親甚至生育了四個不育的兒子，他們都與父親有相同的缺失，顯示男性子代中Y染色體缺失范圍增加導致不育問題的加重，但也有研究顯示男性子代的缺失范圍和類型并沒有擴大和改變[18]。至于通過輔助生殖技術孕育的男性子代，其生育問題還需要進一步的研究。

通過輔助生殖方式獲得的男性子代會遺傳具有缺失類型的Y染色體，為了避免垂直傳播，我們也可以考慮行PGT助孕，選擇不攜帶缺陷Y染色體的女性胚胎進行移植[11]，但采取PGT的方式，會給患者夫婦造成額外的經濟負擔，遺棄了存在基因缺陷的男性胚胎也會一定程度影響不育夫婦最終的抱嬰率。本研究中99例使用睪丸精子行ICSI助孕的AZFc缺失不孕不育夫婦，我們也提前告知了AZFc缺失的垂直傳播風險以及應對策略，他們都主動放棄進行PGT。

Liu等[11]的研究進一步顯示，AZFc缺失所致的少精子癥患者與不存在基因缺失的患者相比，在活產嬰兒男/女性別比例、新生兒身高和體質量、低出生體質量兒比例和新生兒出生缺陷率方面差異均沒有統計學意義，提示AZFc缺失所致少精子癥患者中基因缺失并不影響臨床結局。

對AZFc缺失導致的男性不育患者，有較大的概率通過顯微取精在睪丸中成功獲取精子并結合ICSI生育自己的后代，推薦采取同步手術的方式，即在女方取卵的當日或者前一日行顯微取精術，使用新鮮精子行ICSI有較好的臨床結局。對首次同步ICSI周期未成功的患者，有機會通過再次手術取精和ICSI成功孕育后代。