循環腫瘤細胞與尿路上皮癌患者臨床特征之間的關系

劉杰， 馬彩玲， 李小航， 李安安， 劉昕， 王志勇

尿路上皮癌是泌尿系統常見惡性腫瘤，發病率呈上升趨勢，我國尿路上皮癌的發病率為5.5/10萬～5.8/10萬，其中，上尿路尿路上皮癌首次確診就發生肌層浸潤的患者占比66.7%[1-2]。早期尿路上皮癌患者臨床癥狀無特異性，影像學診斷率不高，缺乏有效的評價指標[3]。腫瘤遠處轉移最主要的方式之一是血行播散，循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是實體惡性腫瘤原發灶或轉移灶由于自發或者外科操作從而進入血液循環系統中所有腫瘤細胞的統稱[4]。目前大量文獻已證實CTC與多種癌癥的診斷密切相關，包括胃癌[5]、前列腺癌[6]以及乳腺癌[7]。本研究采用陰性富集聯合免疫熒光原位雜交技術(subtraction enrichment and immunostaining-fluorescence in situ hybridization，SE-iFISH)檢測尿路上皮癌患者外周靜脈血的CTC，并分析其與尿路上皮癌臨床特征的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2018年8月至2019年10月就診于承德醫學院附屬醫院泌尿外科經組織病理證實為尿路上皮癌者為研究對象，納入標準: ①年齡>18歲;②組織病理學診斷尿路上皮癌；③腫瘤無遠處轉移。排除標準：①患者依從性差；②影像學檢查合并其他原發腫瘤。共105例患者入組尿路上皮癌組，其中首次在本中心就診且病理證實為尿路上皮癌者為首次確診組，共80例，其余的25例是治療后復查時發現尿路上皮癌復發，為復發組。另選擇同期30例良性尿路疾病患者為良性病變組，納入標準：①病理診斷為良性病變(尿路上皮纖維息肉、膀胱炎、結石)；②既往無腫瘤病史。本研究獲得了承德醫學院附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 靜脈血采集 根據參考文獻[8]，以7.5 ml外周靜脈血CTC 數目≥1定義為 CTC 陽性。由經受過專業培訓的護士于手術前1周采集尿路上皮癌患者和疑似尿路上皮癌病變者的肘正中靜脈血7.5 ml，均存放于BD抗凝管中，20～30 ℃室溫下避光保存，48 h內完成檢測。

1.2.2 主要儀器和試劑 主要儀器：離心機、磁力架、雜交儀(Thermo S500-24)微型振蕩混懸器(東林昌盛DL-SC05)、微型掌上離心機(東林昌盛DL-300)、微型臺式真空泵(Qilinbeier GL-802B)。主要試劑盒:釆用iFISH CTC Identification Kit(賽特生物醫藥科技公司)試劑盒對已富集人外周血CTC并液染的載玻片進行原位雜交及DAPI熒光染色。

1.2.3 SE-iFISH檢測流程 CTC富集流程：取BD抗凝管(7.5 ml外周靜脈血)至離心機中。補充Cytelligen細胞分離液于樣本中。加緩沖液Magnetic Beads Buffer，放置于磁力架下，磁場作用下吸取結合了磁珠的白細胞沉淀，而后轉移到清洗液1×CRC離心管中離心并洗滌CTC細胞，可得到富含CTC的細胞懸液，汲取細胞懸液進行固定、干燥、封片。

1.3 瘤標iFISH CTC原位雜交及熒光染色

將載玻片置于32 ℃干燥箱內，4 h后加入清洗液1×CRC配平，顛倒混勻。650 g，1763 rmp離心5 min后，棄上清至100 μl。使用無水乙醇洗滌標本脫水。于標本框中央滴加10 μl CEP8，蓋上蓋玻片。立刻放入雜交儀，76 ℃變性10 min，37 ℃雜交4 h。取出標本片，移除蓋玻片。每張玻片依次加入抗1 μl CD45抗體、1 μl CD31抗體室溫下孵育，最后滴加5 μl DAPI細胞核染色液、標記染色。熒光鏡下判讀CTC，CTC陽性判定標準：DAPI+、CD45-、CD31-、CEP8+≥3倍體，見圖1，定義CTC數目≥1為陽性。

圖1 熒光鏡下CTC陽性示意圖(圖中為DAPI+、CD45-、CD31-、CEP8+的5倍體,免疫熒光染色 ×40)

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。分析CTC與尿路上皮癌組和尿路上皮癌首次確診組患者臨床特征之間的關系；腫瘤T分期與CTC數目之間的關聯采用Kruskal-WallisH檢驗和Spearman相關性分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 患者外周血中CTC的檢測結果

105例尿路上皮癌患者血液標本無明顯溶血、凝血，滿足SE-iFISH Circulating Tumor Cell Kit檢測的質量要求，標本合格率為100%。SE-iFISH系統檢測結果顯示,105例尿路上皮癌組中CTC陽性率為76.19%(80/105)；CTC檢出的中位數5(1～34)個；首次確診組中CTC陽性率為75.00%(60/80)，CTC檢出的中位數為3(1～19)個；25例尿路上皮癌復發組患者中CTC陽性率為80.00%(20/25)，CTC檢出的中位數為3(0～20)個；良性病變組中CTC陽性率為10.00%(3/30)，CTC檢出的中位數為0(0～6)個。尿路上皮癌組與良性病變組之間的差異有統計學意義(χ2=43.167，P<0.001)。而首次確診組與復發組之間的差異無統計學意義(χ2=0.262，P=0.608)。

2.2 尿路上皮癌患者CTC與臨床特征之間的關系

由表1可見，尿路上皮癌CTC陽性率在腫瘤分化程度、浸潤程度、病灶數、腫瘤最大徑、腫瘤T分期組間，差異有統計學意義(P<0.05), 而在年齡、性別、血尿、復發、病理類型組間，差異無統計學意義(P>0.05) 。

表1 尿路上皮癌患者CTC陽性率與臨床特征的關系[例(%)]

2.3 尿路上皮癌首次確診組患者CTC與臨床特征之間的關系

由表2可見，尿路上皮癌首次確診患者CTC陽性率在腫瘤分化程度、浸潤程度、病灶數、腫瘤最大徑、腫瘤T分期組間，差異有統計學意義 (P<0.05), 而在年齡、性別、血尿、病理類型組間，差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 尿路上皮癌首次確診組CTC陽性率與臨床特征的關系[例(%)]

2.4 CTC數目與尿路上皮癌T分期的關系

尿路上皮癌患者中CTC的檢出率：T1期17/32(53.12%)，T2期29/37(78.38%)，T3期 18/20(90.00%)，T4期16/16(100.00%)。CTC的檢出數目：T1期2.38(0～12)個，T2期4.65(0～17)個, T3期9.60(0～26)個，T4期12.00(4～34)個。Kruskal-Wallis檢驗結果顯示，外周血中CTC水平與腫瘤T分期有關，差異有統計學意義(H=29.083，P<0.001)。進一步用Spearman分析CTC數目和腫瘤T分期之間的相關性，結果顯示， CTC計數和腫瘤T分期呈正相關(r=0.526，P<0.001)。見圖2。

注：○為樣本數據中的極端值，已剔除圖2 CTC計數與腫瘤T分期之間的關系

3 討論

尿路上皮癌的常規檢測手段有尿液細胞學、影像學、病理活檢以及膀胱鏡檢查，然而它們或靈敏度低，或操作后易出現尿路感染、尿路種植性轉移等并發癥[3，11]。澳大利亞Ashworth等[12]首次在1例死亡患者外周血中發現類似于腫瘤的細胞，提出了CTC的概念。隨著學者對腫瘤轉移機制認識的不斷提升以及檢測技術的進步，CTC已成為腫瘤研究的熱點。

目前，大多數富集技術主要是基于CTC的物理特性(癌細胞的直徑、密度和表面粗糙黏附力)或生物特性(癌細胞表面特異性標志物或基因表達)[13]。本研究采用SE-iFISH檢測尿路上皮癌患者的CTC，結果顯示陽性率高達76.19%，高于良性病變組患者(為10%)，說明SE-iFISH檢測技術有助于尿路上皮癌的診斷?？赡茉蛴校孩僭摷夹g采用的陰性富集法能有效去除非腫瘤細胞成分。②對于經歷上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的CTC或者間質來源的CTC可以高效地富集，而這一特點是陽性富集系統所不具備的[8，14]。

Tanaka等[15]運用CellSearch System檢測技術，回顧性分析125例肺癌患者CTC的檢出率及數目情況，得出CTC陽性率及數目可以精準地區分腫瘤分期的結論。李慧等[8]發現各期非小細胞肺癌患者血液中均有CTC，其中T4期患者的CTC陽性率最高。此外，早期的非小細胞肺癌患者雖未能在影像學中發現轉移灶，但CTC呈陽性，提示腫瘤可能已發生微轉移。Yu等[16]首次報道了CTC與晚期結直腸癌患者的檢出率相關。本研究發現，在早期(T1期)尿路上皮癌患者中CTC的陽性率為53.13%，推測在尿路上皮癌的早期已發生了遠處微轉移。此外，本研究還發現腫瘤CTC數目和T分期呈現正相關，腫瘤T分期越高的患者，其外周血中CTC數目越多。這提示我們腫瘤的惡性程度可能與CTC數目緊密相關，未來如果將臨床腫瘤T分期和CTC檢測的結果進行綜合分析，可能有效地發現高風險患者，通過縮短對這部分患者的隨訪和檢查的時間，能及時發現早期腫瘤微轉移灶以及病情的進展，并為患者的治療方案提供新的重要依據。

有關CTC與尿路上皮癌患者臨床特征之間的關系，目前的研究仍存在一定爭議。有研究報道CTC陽性率與肌層浸潤程度密切相關，而與腫瘤直徑、切緣陽性以及淋巴結轉移均無相關性[17]。白云金等[18]采用流式細胞術檢測78例膀胱癌患者，研究證實CTC陽性率與腫瘤直徑、數目以及病理分級有關，而與腎積水、吸煙史不相關， Logistic多因素分析顯示CTC與T分期、病理分級和腫瘤直徑具有相關性。Koch等[19]研究顯示CTC檢出與微血管侵犯、切緣陽性、術后輔助化療密切相關，而與腫瘤病理分期、病理分化程度、淋巴結轉移無明顯相關性。本研究發現CTC陽性在腫瘤分化程度、腫瘤浸潤程度、腫瘤最大徑、腫瘤T分期組間，差異均有統計學意義，研究結果的差異可能與納入研究對象不足以及CTC檢測手段不同有關。由于尿路上皮癌患者術后大多數會進行膀胱灌注化療，不能排除膀胱灌注化療對CTC的影響，為了進一步探究膀胱灌注化療對血液中CTC的影響，本研究分別設置尿路上皮癌首次確診組和尿路上皮癌組，分別分析了兩組患者與臨床特征的統計學關系，結果顯示兩組的結果一致。此外，本文還分析了首次確診組與復發組之間CTC檢出率的差異，結果顯示差異無統計學意義?？紤]可能原因有：膀胱灌注化療藥物僅直接作用于種植尿路上皮表面腫瘤細胞或切緣的腫瘤,并不入血影響血液中CTC數目;本研究納入的復發尿路上皮癌患者較少。

本研究樣本量較少，僅對患者的臨床特征進行統計學分析，而CTC與尿路上皮癌患者的無進展生存期及總生存期之間的聯系有待我們進一步研究證實。本研究課題組將擴大樣本、多次監測CTC的動態變化、長時間隨訪，讓CTC檢測技術在尿路上皮癌患者的綜合治療中更好發揮作用。