鈣磷蛋白表達在預測乳腺癌預后中的價值

陳秀， 李蕾， 張鶴達， 張建

乳腺癌是女性健康的首位殺手，每年發病率和死亡率遙遙領先[1]。目前乳腺癌的治療方法主要為手術治療、化學治療、靶向治療、免疫治療等綜合治療，隨著新技術、新藥物的研發，乳腺癌患者的生存率有所提高，但仍有20%～30%的患者會出現遠處轉移相關性死亡[2]。乳腺癌發生發展的復雜機制和腫瘤特異性或分期特異性標志物的缺失進一步加大了治療的難度。

骨轉移是乳腺癌最常見的遠處轉移，已知乳腺癌骨轉移的主要病理生理基礎是腫瘤細胞促進骨組織中鈣離子的釋放，破壞了成骨細胞和破骨細胞之間的生理平衡[3]。鈣磷蛋白(calcyphosine，CAPS)是一種鈣結合蛋白家族成員，參與了鈣離子的轉運過程，在腫瘤骨轉移的過程中發揮重要的作用。近來大量研究發現骨微環境中的免疫細胞和免疫相關因子主要與成骨細胞相互作用維持“骨平衡”，當各種因素導致骨微環境中免疫細胞功能缺陷時，會促使腫瘤骨轉移的發生[4]。同時有學者證實了腫瘤微環境中免疫細胞的高密度浸潤對乳腺癌患者的骨轉移及預后具有明確的相關性[5]，由此探究腫瘤微環境相關免疫細胞與骨微環境之間的聯系為乳腺癌的治療開辟了新方向。然而，CAPS與乳腺癌微環境相關免疫細胞之間是否具有關聯尚無研究。

本研究通過分析CAPS在乳腺癌患者中的表達情況及與腫瘤相關免疫細胞的關系，探討CAPS在乳腺癌預后評估中的臨床價值及作為治療靶標的可能性。

1 資料與方法

1.1 UALCAN數據庫分析 UALCAN數據庫(http：//ualcan. path. uab. edu)中涵蓋了TCGA數據庫中31種惡性腫瘤的RNA-seq結果和臨床資料[6]，我們通過該數據庫分析乳腺癌組織和癌旁組織中基因的表達水平，以及在不同腫瘤分級、分期等臨床病理特征條件下基因的表達情況。

1.2 LinkedOmics LinkedOmics(http：//www.linkedomics.org/login.php)是分析TCGA數據庫中32個腫瘤相關多維數據集的一個平臺[7]。使用Pearson相關分析統計出CAPS的相關基因，并以火山圖、熱圖或散點圖展示。LinkedOmics平臺使用基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)計算出基因生理過程(GO_BP)、KEGG信號通路、激酶-靶點、miRNA-靶點、轉錄因子-靶點富集分析，FDR<0.05的相關基因會展示在圖表中。

1.3 Kaplan-Meier Plotter生存分析 Kaplan-Meier Plotter網站羅列了18 674個惡性腫瘤樣本(7 830例乳腺癌)患者，我們通過該網站分析CAPS與乳腺癌預后的關系。CAPS檢測探針ID為226424_at。樣本根據CAPS的表達量分為低表達組和高表達組，通過K-M生存曲線和Log-rank方法分析基因和總生存期(overall survival，OS)、無復發生存期(relapse free survival，RFS)、無遠處轉移生存期(distant metastasis free survival，DMFS)的關系，并計算對應的風險病例數、風險比(hazard ratios，HRs)、95%可信區間(confident intervals，CIs)、P值。P<0.05為差異具有統計學意義。

1.4 TIMER2.0 TIMER(https：//cistrome. shinyapps. io/timer/)能夠對TCGA數據庫中不同惡性腫瘤的免疫微環境進行系統性分析，其囊括了32種惡性腫瘤的10 897樣本[8-9]。TIMER應用反卷積法[10]反映腫瘤相關浸潤免疫細胞的數量(tumor-infiltrating immune cells，TIICs)。我們分析了乳腺癌患者CAPS和B細胞、CD4+ T淋巴細胞、CD8+ T淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突細胞等免疫細胞及與腫瘤純度的關系。

2 結果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中CAPS的表達量比較TCGA數據庫中統計了1 076個乳腺癌組織樣本和114個癌旁組織樣本中標準化后CAPS基因的表達量，發現CAPS基因在乳腺癌組織的中位表達量為4.865/107，較癌旁組織中位表達量的3.146/107，呈現出明顯的高表達(圖1A)。CPTAC數據庫中統計了125個癌組織樣本CAPS蛋白表達量比18個癌旁組織樣本表達量高(圖1B)。因此，CPAS基因和蛋白均可以作為乳腺癌的潛在診斷因子。

*：P<0.05圖1 CAPS在乳腺癌組織與正常組織中的表達水平

2.2 不同亞組乳腺癌中CAPS的表達量比較 基于臨床病理學特征的多樣性，我們使用UALCAN數據庫分析了TCGA-BRCA和CPTAC-BRCA中不同亞組患者體內CAPS的基因和蛋白水平表達量，發現腫瘤分級、人種、性別、年齡、月經狀態、分子分型、病理類型等亞組中，CAPS的表達量與對照組存在顯著性差異(圖2～3)。因此CAPS有希望作為判斷乳腺癌患者亞組甚至預后的潛在預測因子。

*：P<0.05圖2 不同亞組中CAPS基因的表達水平

*：P<0.05圖3 不同亞組中CAPS蛋白的表達水平

2.3 生存分析 使用Kaplan-Meier生存曲線分析TCGA數據庫中乳腺癌患者預后情況和CAPS的關系，根據CAPS的中位數將患者分為高表達組和低表達組，分析發現CAPS高表達組乳腺癌患者的OS、RFS、DMFS均較短(圖4，log-rank testP<0.05)。通過GO、KEGG分析發現CAPS可能參與人體的免疫調節。

注：OS為完全生存期；RFS為無復發生存期；DMFS為無遠處轉移生存期；HR為風險比圖4 CAPS與乳腺癌OS、RFS、DMFS的生存曲線

2.4 免疫相關性 我們使用TIMER數據庫分析了CAPS與乳腺癌免疫微環境的關系，結果發現CAPS不僅與乳腺癌腫瘤純度相關(r=0.086，P<0.05)，而且與腫瘤微環境中的主要免疫細胞相關(圖5)。

圖5 CAPS與乳腺癌浸潤相關免疫細胞的關系

3 討論

乳腺癌骨轉移是乳腺癌診療過程中我們面臨的巨大挑戰，而骨轉移的病理生理機制主要是腫瘤細胞及腫瘤微環境阻礙了骨的生成和骨的破壞之間的動態平衡，在這個過程當中鈣的代謝發揮著舉足輕重的作用。鈣結合蛋白是細胞第二信使系統的重要組成部分，密切參與了鈣離子的轉運過程，而CAPS作為鈣結合蛋白家族的成員，參與了鈣離子代謝的調節作用，從而進一步加速骨轉移的過程。

有研究收集了36例結直腸癌患者的癌組織和癌旁組織，發現癌組織中CAPS的含量顯著高于癌旁正常組織，然后結合臨床病理學特征分析發現CAPS的表達水平與結直腸癌患者的組織分級、侵襲深度、淋巴結轉移、遠處轉移息息相關，因此推斷CAPS高表達可能預測結直腸癌患者的不良預后[11]。同時，CAPS的表達與非小細胞肺癌患者發生骨轉移密切相關，高水平的CAPS可能促進非小細胞肺癌的轉移能力[12]。然而在肺腺癌中，研究發現CAPS的表達量明顯低于正常肺組織，并且在發生骨轉移的肺腺癌患者中，CAPS低水平者的生存期更長[13]。由此我們推斷CAPS在不同實體腫瘤中可能發揮不同的調節作用，本研究旨在探索CAPS是否參與了乳腺癌的發生發展過程。

本研究中，我們發現乳腺癌組織中CAPS的基因和蛋白表達量遠高于癌旁正常組織，且高表達CAPS的乳腺癌患者生存期較短，我們推斷CAPS參與了乳腺癌的發生和發展。而不同腫瘤分期患者之間CAPS的基因和蛋白表達水平差異沒有統計學意義，分析其中原因可能是由于各個腫瘤分期的患者人數較少且不均質，缺乏可比性，因此CAPS是否具有預測不良腫瘤分期的作用還需要更多的大樣本臨床研究來佐證。在不同人種之間CAPS的比較可以得出結論：黑人乳腺癌患者的CAPS基因表達水平高于白種人和黃種人患者。這與黑人乳腺癌患者的預后相對較差相一致[14]，側面證實了CAPS有評估乳腺癌患者預后的功能。在不同年齡段患者之間的比較發現：41～60歲患者中CAPS的基因表達明顯高于21～40歲患者，而與>60歲患者之間差異無統計學意義，并且不同年齡段之間CAPS基因的表達未發現顯著差異性，由此我們推測在不同年齡段患者中CAPS蛋白的診斷價值可能高于預后評估價值。同時我們發現圍絕經期患者的CAPS基因表達低于絕經前和絕經后患者，可能與納入研究的圍絕經期患者數量較少有關，而不同月經狀態下的CAPS蛋白水平的研究數據尚欠缺，同時考慮到基因只有在轉錄翻譯成蛋白分子后才發揮生理作用，因此該結論有待進一步研究證實。不同分子分型亞組分析中，luminal型患者CAPS基因表達較三陰型患者低，尤其低于BL1型和M型三陰型乳腺癌患者?？紤]到納入蛋白層面研究的病例數較少，不同分子類型間CAPS蛋白水平的差異性無統計學意義。病理類型亞組分析中，由于組間數量的偏差性導致結論的可靠性有所欠缺，但CAPS蛋白在正常組織和IDC之間的差異性仍具有極高的可信度。

目前腫瘤微環境的調控已成為打破乳腺癌治療瓶頸的關鍵，腫瘤相關免疫細胞的功能與乳腺癌患者的預后息息相關[15]，這與本研究中高水平CD4+ T細胞乳腺癌患者生存期較長的結果相一致。針對接受內分泌治療的激素受體陽性乳腺癌患者，約三分之一會因為耐藥性而使療效大打折扣[16]。有研究者將內分泌治療耐藥患者和內分泌治療敏感患者的乳腺癌組織中蛋白分子表達進行了比較，發現CAPS高表達的乳腺癌患者更容易發生內分泌治療的耐藥性，具有一定程度的預測功能[17]。結合本研究中，在激素受體陽性患者中CAPS與免疫細胞的關系，尤其是與T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞的負相關關系，由此推斷CAPS可能通過抑制Luminal型乳腺癌患者體內的免疫細胞功能從而誘導內分泌藥物耐藥性的產生，最終影響患者的預后。

綜上，我們認為CAPS可以作為乳腺癌診斷的潛在分子標志物，并且CAPS可能通過調節腫瘤相關免疫細胞的功能導致乳腺癌的不良預后，尤其與激素受體陽性乳腺癌患者的預后緊密相關。