草莓枯萎病拮抗菌JM-3的鑒定及生防效果評價

姜莉莉，孫守民，楊 帥，武 沖，孫瑞紅

（1山東省果樹研究所，山東泰安 271000；2山東農業大學植物保護學院，山東泰安 271018）

0 引言

草莓(Fragaria ananassaDuchesne)為薔薇科草莓屬宿根性草本植物，其果實汁多味美、營養價值高，深受消費者喜愛，是中國重要的園藝作物[1]。近年來，隨著草莓產業的發展，種植面積不斷擴大，連作問題日益凸顯[2]，土壤微生物區系惡化，草莓枯萎病菌等土傳病害發生普遍，危害程度也逐年加重[3]。草莓枯萎病病原菌為半知菌亞門瘤座菌科尖孢鐮刀菌草莓?；?Fusarium oxysporumf.sp.Fragariae)，其可通過菌絲體或厚垣孢子隨病殘體在土壤中越冬。該病原菌從根部侵染草莓，在植株體內增殖、蔓延，堵塞維管束組織，破壞植株正常輸導機能，引起植株萎蔫[4]。

對于草莓連作所致枯萎病的防治，主要包括化學防治、抗病育種和生態防控等手段[5]，其中化學防治具有較高的環境生態代價和抗藥性風險[6]，而抗病育種則存在育種周期長、成本較高等問題[7]。隨著2020 年農藥“零增長”戰略的全面實施，生態防控已成為作物病蟲害防治領域的研究熱點。生防菌因具有成本低、環境友好等特點而受到國內外植保工作者的廣泛關注[8]。卜春亞等[9]通過自然選育、紫外-微波誘變獲得草莓根腐病拮抗細菌GF-16，并進行了發酵條件優化。Sun 等[10]報道生防菌解淀粉芽孢桿菌L-1 對梨輪紋病的防效達76.55%，且可提高梨果實的POD 酶和CAT酶活性。劉程程等[11]從森林土壤中篩選出1株對草莓炭疽病菌具有較強拮抗活性的薩拉曼卡假單胞菌Pseudomonas helmanticensis，但尚未用于生產實踐。目前，對于草莓枯萎病的拮抗菌報道較少，且多處于實驗室研究階段。為豐富草莓枯萎病生物防治資源，助力草莓病害節藥防控，作者前期從山東省泰安市岱岳區大棚草莓根際分離得到1株對草莓枯萎病菌具有較高拮抗效果的生防菌株JM-3，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進行菌種保藏(No.15444)。本研究擬通過形態學、生理生化和分子生物學手段對生防菌JM-3進行鑒定，并對菌液進行初步加工，評價其對草莓枯萎病的防治效果，為新型生防制劑的開發及草莓可持續綠色生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 草莓枯萎病菌采自山東省煙臺市招遠市枯萎病發生嚴重的草莓大棚，經分離、純化、柯赫氏法則鑒定后供試。生防菌株JM-3 采自山東省泰安市岱岳區房村鎮種植年份長、長勢較好的草莓大棚，經分離、純化后供試。

1.1.2 供試培養基PDA 培養基用于草莓枯萎病菌的平板培養，PD 培養基用于草莓枯萎病菌的液體培養，LB培養基用于生防菌的培養和保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌株JM-3 的形態學鑒定 在超凈工作臺上將活化好的JM-3 菌株接種于LB 固體培養基，28℃黑暗培養24 h，目測菌落的顏色、大小、形狀、透明度、邊緣整齊性等，并進行掃描電鏡觀察[12]。

1.2.2 生防菌株JM-3 的生理生化鑒定 采用青島海博生物技術有限公司的HBIG14 微生物生化鑒定條，進行V-P、明膠液化、檸檬酸、D-甘露醇、革蘭氏染色、硝酸鹽還原、吲哚、淀粉水解等鑒定。

1.2.3 生防菌株JM-3 的分子鑒定 在超凈工作臺上挑取生防菌JM-3 單菌落，接種到LB 液體培養基中，28℃、150 r/min 搖床培養24 h。采用北京天根生化科技有限公司的細菌基因組DNA 提取試劑盒抽提生防菌JM-3 的基因組DNA。采用細菌通用引物27F/1492R 進 行16S rDNA 序 列擴增，采用L100/R836 和UP1/UP2r特異性引物分別進行gyrA和gyrB基因序列擴增[7]，引物序列見表1。PCR產物委托上海生工生物股份有限公司進行測序，序列上傳NCBI 并進行BLAST 同源性比對，以MEGA6.0 構建菌株的系統發育樹(Bootstrap=1000)[13]。

表1 擴增基因及引物序列

1.2.4 菌劑加工 以接種環挑取JM-3菌株單菌落，接種于100 mL LB液體培養基中，28℃、150 r/min搖床培養24 h 制備種子液。將1 L 種子液接種至裝有50 L LB液體培養基、總容積為100 L的發酵罐（上海百侖生物科技有限公司，BLBIO-100SJ）中，30℃、溶氧量100%、轉速300 r/min發酵24 h制備二級發酵液。菌液離心，取沉淀物與載體（黃腐酸鉀:硅藻土:腐殖酸=1:1:3）混合、攪拌、過篩，以平板菌落計數法[14]測定菌量，制備菌體濃度為2×108CFU/g的粉末狀固體制劑。

1.2.5 生防菌JM-3 的室內抑制率測定 采用平皿對峙法[15]，將保存的草莓枯萎病菌活化，在菌落邊緣打取直徑7 mm的菌餅，接種于PDA培養基平板中央，以滅菌牙簽挑取拮抗菌JM-3 菌落接種于距離菌餅圓心2 cm的4 個方位上。同時設空白對照，每個處理設4 個重復，每個重復1 皿。28℃培養5 天后，采用十字交叉法測量草莓枯萎病菌菌落直徑(mm)，計算抑制率。

1.2.6 生防菌JM-3 對草莓枯萎病的盆栽防效測定 在直徑9 cm 的PDA 培養基平板中央接種直徑7 mm 的菌餅，28℃黑暗培養5天后，移取每皿全部菌絲及孢子于20 mL 滅菌去離子水中，制得病原菌液。將土壤120℃滅菌30 min后冷卻，裝于直徑15 cm的塑料花盆中，每盆約1 kg，接種20 mL病原菌液，移栽5葉1心草莓幼苗，品種為‘豐香’。處理1：每盆草莓根際澆灌20 mL菌體濃度為2×108CFU/mL的生防菌JM-3菌液；處理2：每盆草莓根際拌土處理20 g 菌體濃度為2×108CFU/g的生防菌JM-3固體制劑；處理3：每盆草莓根際施用20 mL 50%多菌靈可濕性粉劑1000倍液；處理4：對照組不進行處理。每個處理重復3次，每個重復10盆。采用常規栽培管理，分別于移栽后30、60、90天調查各處理的草莓枯萎病病情指數，并計算相對防效。

草莓枯萎病的田間發病程度可分為5 級[16]：0 級——無任何癥狀；1級——莖基部稍顯病斑或稍變色；2 級——莖基部有病斑，但未連成片；3 級——莖基部病斑連片發生，但面積小于1/2；4 級——病斑環繞莖基部；5級——植株死亡。

以上試驗在山東農業大學農藥毒理與應用技術省級重點實驗室，于2018年9月—2019年8月進行。

1.2.7 生防菌JM-3 對草莓的田間應用效果 田間試驗選址于山東省泰安市岱岳區房村鎮的連作草莓大棚，枯萎病發生較重。試驗共設4個處理，每個處理重復3次。每個小區長10 m，寬2 m，面積20 m2，約種植草莓240株。處理1：按照240 mL/m2劑量灌施1.2.4所述的生防菌JM-3液體制劑；處理2：按照240 g/m2劑量撒施1.2.4所述的生防菌JM-3固體制劑；處理3：按照240 mL/m2劑量灌施50%多菌靈可濕性粉劑1000倍液；處理4：對照組未處理。隨機區組排列，處理間設保護行。

2019 年8 月27 日移栽5 葉1 心期草莓幼苗，采用常規栽培管理，每隔30天調查1次各小區的草莓枯萎病發病株數，統計發病率，并計算相對防效，連續3次。11月27日采集草莓果實測定單果重、糖酸比和可溶性固形物含量。各小區草莓果實隨成熟隨采收，并統計累積產量。

2 結果與分析

2.1 生防菌JM-3的形態學鑒定

在LB 培養基上28℃培養24 h，JM-3 菌株單菌落呈乳白色，半球狀隆起，不透明，表面濕潤，邊緣光滑，單菌落直徑為1.31～3.42 mm（圖1）。掃描電鏡發現，菌體為桿狀，表面有褶皺（圖2）。

圖1 JM-3菌落形態

圖2 JM-3電鏡圖片

2.2 生防菌JM-3的生理生化鑒定

由表2 可以看出，生防菌JM-3 為革蘭氏陽性細菌，V-P 反應、明膠液化、檸檬酸、淀粉水解、硝酸鹽還原、接觸酶、氧化酶、D-甘露醇試驗均為陽性，吲哚試驗為陰性。

表2 生防菌JM-3的生理生化鑒定結果

2.3 生防菌JM-3的分子鑒定

通過16s rDNA 序列測定，得到長度為1413 bp 的基因序列片段，NCBI 登錄號為MG841149，經過序列比對，與模式菌株Bacillus velezensisB-41580（NCBI登錄號EU138484）相似度最高（圖3）。通過gyrA和gyrB序列測定，分別得到長度為717 bp和1258 bp的基因片段，NCBI 登錄號分別為MT634152 和MT634153。經過序列比對，分別與貝萊斯芽孢桿菌B.velezensisQ3B3（NCBI 登錄號MK775701）和K2（NCBI 登錄號MN365038）相似度最高（圖4 和圖5）。因此，將菌株JM-3鑒定為貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis。

圖3 JM-3菌株16S系統發育樹

圖4 JM-3菌株gyrA系統發育樹

圖5 JM-3菌株gyrB系統發育樹

2.4 生防菌JM-3對草莓枯萎病菌的抑制率

生防菌JM-3 與草莓枯萎病菌的對峙效果如圖6所示，拮抗作用顯著。由表2 可知，生防菌JM-3 對草莓枯萎病菌的抑制率為57.42%。

圖6 生防菌JM-3對草莓枯萎病菌的抑制效果

2.5 生防菌JM-3對草莓枯萎病的盆栽防效

由表4可知，在室內接種草莓枯萎病菌的情況下，對照組的病情指數隨時間推移逐漸升高。處理后30天，多菌靈拌土的防效為80.00%，高于生防菌JM-3菌液和固體制劑的66.67%和73.33%；處理后60天，固體制劑的防效為75.86%，高于菌液和多菌靈的68.97%和72.41%；處理后90天的結果與60天相似，固體制劑的防效最高，為83.02%，菌液和多菌靈的防效分別為75.47%和77.36%。由此可見，生防菌固體制劑的持效性最高。

表4 生防菌JM-3對草莓枯萎病的盆栽防效

2.6 生防菌JM-3對草莓枯萎病的田間防效

生防菌JM-3 微生物制劑對草莓枯萎病發病率的田間防效如表5所示。移栽后30天，多菌靈土壤處理對草莓枯萎病的防效最高，為70.98%；移栽后60 天和90 天，生防菌固體制劑的防效最高，分別為79.83%和80.00%，多菌靈次之，分別為77.22%和76.86%?？梢娚谰鶭M-3 固體制劑土壤處理對草莓枯萎病的防效具有較長持效期。

表5 生防菌JM-3對草莓枯萎病的田間防效 %

2.7 生防菌JM-3對草莓果實品質及產量的影響

由表6可以看出，生防菌JM-3液體和固體制劑處理的草莓果實糖酸比分別為8.88 和8.90，顯著高于多菌靈處理的8.49 和對照的8.20；生防菌JM-3 液體、固體制劑和多菌靈處理的小區產量分別為49.47、51.37和51.93 kg，顯著高于對照的36.90 kg。同時，生防菌JM-3 對草莓果實單果重和可溶性固形物含量無顯著影響。

表6 生防菌JM-3對草莓果實品質和產量的影響

3 討論與結論

對于同源性較高的細菌，不能僅通過16S 測序進行種屬鑒定。研究表明，編碼蛋白質基因具有較高的遺傳變異，可用于密切相關種群的分類與鑒定[17]。gyrA和gyrB作為系統發育鑒定標記，可有效彌補16S序列的不足[18-19]。本研究通過形態學、生理生化特征分析和16S、gyrA及gyrB基因序列比對，將篩選得到的拮抗菌JM-3 鑒定為貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis，鑒定結果較為可靠。

貝萊斯芽孢桿菌是芽孢桿菌中的一個新種，近年來作為益生菌在農業、食品、環保、醫學等領域被廣泛研究，其中在農業領域可被用于拮抗病原微生物和促

進作物生長[20]。張瓊等[21]報道，貝萊斯芽孢桿菌SZAD1 種子浸泡和灌根處理對棉花黃萎病的防效分別為60.10%和56.00%。劉雪嬌等[22]報道，貝萊斯芽孢桿菌3A3-15對尖孢鐮刀菌孢子萌發抑制作用較強，且可導致菌絲扭曲、膨大和畸形。張小利等[23]報道，貝萊斯芽孢桿菌NSZ-YBGJ001 對草莓白粉病的葉部防效達86.64%，果實防效達71.08%。目前，貝萊斯芽孢桿菌用于草莓枯萎病的防治尚未見報道。本研究采用平板對峙試驗發現，分離鑒定得到的貝萊斯芽孢桿菌JM-3 對草莓枯萎病菌的拮抗作用顯著，抑制率為57.42%，可有力地豐富草莓枯萎病的生物防治資源。

生防菌制劑化對菌體的定殖能力及生防效果的發揮影響較大[24]。黃潔雪等[25]報道，添加有機物料可以提高生防微生物制劑的穩定性及其對草莓灰霉病的防治效果。本研究前期篩選確定了生防菌JM-3 菌體濃度為2×108CFU/g 的粉末狀固體制劑，盆栽病情指數試驗發現，處理后90天，拮抗菌JM-3固體制劑對草莓枯萎病病情指數的防效為83.02%，高于菌液和多菌靈處理的75.47%和77.36%。田間試驗發現，移栽后60天和90 天，生防菌JM-3 固體制劑對草莓枯萎病發病率的防效最高，分別為79.83%和80.00%，可見該拮抗菌的固體制劑化可提高菌株的持效性和防治效果。

表3 生防菌JM-3對草莓枯萎病菌的室內抑制作用

大量研究表明，生防菌株在拮抗有害生物的同時，還具有促生和增產的作用[26]。王星等[27]報道，生防菌株L1對水稻細菌性條斑病的防效較高，且可使水稻增產10%以上。王夏雯等[28]報道，解淀粉芽孢桿菌B1619 對西瓜枯萎病具有較高的防效，還可提升西瓜果實品質。本研究發現，生防菌JM-3液體和固體制劑處理的草莓果實糖酸比分別為8.88 和8.90，較多菌靈處理和對照顯著提高，但不同制劑間差異不大，可見該菌株對草莓果實品質有一定的提升作用。產量測定發現，生防菌JM-3液體和固體制劑處理與多菌靈處理間差異不大。在后續研究中，將通過進一步改良載體配方、優化菌劑加工工藝、制定配套措施等手段，提升菌株JM-3 制劑在草莓枯萎病防治及促生方面的應用效果，助力草莓綠色生產。

綜上，草莓枯萎病拮抗菌JM-3經生理生化和分子生物學鑒定為貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis，其對草莓枯萎病菌的平板對峙抑制率為57.42%。盆栽病情指數試驗和田間發病率試驗結果一致表明，該拮抗菌對草莓枯萎病具有較高的防效，且固體制劑化可提高菌株的持效性和防治效果。同時，該菌株液體和固體制劑均可顯著提高草莓果實的糖酸比，提升草莓品質，具有較好的應用前景。