基于網絡藥理學探討補中益氣湯治療糖尿病胃輕癱的作用機制

于文彥 吳攀峰 芮 君 張 弘

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿病常見慢性并發癥之一，以排除消化道機械性梗阻情況下出現的胃排空延遲為主要特點，主要臨床癥狀包括早期飽腹、腹脹腹痛、惡心嘔吐、體質量減輕等，嚴重影響食物、藥物的消化吸收，加重血糖調節受損和營養不良，進而嚴重影響患者生活質量[1]。目前DGP 尚缺乏安全有效的治療手段。促胃腸動力藥物、胃電刺激、經口內鏡下幽門肌切開術（GPOEM）等治療手段，存在部分患者無法耐受的不良反應和一定的治療失效率[2-3]。研究顯示，中醫藥可顯著減輕DGP 患者胃腸道癥狀，且不良反應少，復發率低[4]。補中益氣湯是DGP 常用中藥方劑之一，由黃芪、白術、陳皮、升麻、柴胡、人參、甘草、當歸等藥物組成。研究顯示，補中益氣湯治療DGP 臨床療效良好[5-6]。但目前相關研究仍相對較少，其作用機制尚未明確。本研究擬通過網絡藥理學方法，探討補中益氣湯治療DGP 的作用機制，為后續進一步實驗提供研究方向和理論依據。

1 資料與方法

1.1 補中益氣湯活性成分及靶點篩選 BATMANTCM（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）平臺是一個基于“多成分-多靶點-多通路”的網絡藥理學思路，以“藥物-靶點相似性”模型篩選靶點，系統揭示中藥復方化學成分作用靶點及機制的在線分析工具[7]。本研究將補中益氣湯組方中的“黃芪、白術、陳皮、升麻、柴胡、人參、甘草、當歸”完整拼音輸入BATMANTCM 平臺作為整體對象，以P＜0.05 和Score cutoff＞20 為切點，對補中益氣湯的活性成分和相關靶點進行篩選。

1.2 DGP 相關基因的獲取 本研究應用GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、DisGeNET 數據庫（https://www.disgenet.org/）、GenCLiP 3 數據庫（http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）、GeneCards 數 據庫（https://www.genecards.org/）及TTD 數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/），以“diabetic gastroparesis（糖尿病胃輕癱）”為關鍵詞，獲取DGP 相關基因。

1.3 補中益氣湯治療DGP 的潛在靶點獲取 將1.1中篩選得到的補中益氣湯作用靶點與1.2 中獲取的DGP 相關基因取交集，得到補中益氣湯治療DGP 的潛在作用靶點，并利用Cytoscape3.7.1 軟件構建補中益氣湯活性成分-DGP 靶點網絡圖。

1.4 交集靶點蛋白相互作用網絡構建 將1.3 中得到的交集靶點導入STRING 數據庫（https://string-db.org/），設定物種為“homo sapiens（人類）”，設定最低相互作用評分置信度為0.70，獲得交集靶點所編碼蛋白的相互作用結果。將該結果導入Cytoscape3.7.1軟件進行可視化，構建補中益氣湯和DGP 的交集蛋白互作網絡圖。通過CytoNCA 插件計算網絡圖中各節點的度中心度、中介中心度和接近中心度，以進一步衡量網絡中各蛋白的關聯性和重要性。

1.5 交集靶點基因功能分類及通路富集分析 利用Cytoscape3.7.1 軟件中的ClueGO 插件對交集靶點基因的細胞功能、分子功能和生物功能進行基因分類（gene ontology，GO）富集分析及可視化。使用Cytoscape3.7.1 軟件中的CluePedia 插件對靶點基因進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析及可視化。設定P 值＜0.05 為統計閾值，得到補中益氣湯治療GDP 的潛在作用通路。

2 結果

2.1 補中益氣湯主要活性成分及靶點 在BATMANTCM 平臺收集補中益氣湯的活性成分，以P＜0.05 和Score cutoff＞20 作為篩選切點，去除重復后，得到236 種補中益氣湯活性化學成分，及各活性成分對應的靶點，共計1674 個。

2.2 DGP 相關基因及藥物-疾病靶點網絡 為全面充分地收集DGP 相關基因，本研究通過多個數據庫（GEO、DisGeNET、GenCLiP 3、GeneCards、TTD）進行收集，獲取DGP 相關基因582 個。將其與補中益氣湯活性成分對應的靶點取交集后，得到130 個補中益氣湯治療DGP 的潛在靶點，對應185 個活性成分。利用Cytoscape3.7.1 軟件構建補中益氣湯活性成分-DGP 靶點網絡（見圖1）。該網絡中共有315 個節點，其中藥物活性成分節點185 個，疾病靶點節點130 個，成分與靶點間存在1256 條相互作用連線。根據圖1，活性成分三磷酸腺苷（adenosine triphosphate）對應的靶點最多，為26 個，其次為呋喃色酮（Visnagin），對應25 個靶點，十七醇（1-heptadecanol），對應21 個靶點，香芹酚（carvacrol），對應19個靶點。進一步分析發現，79.23%的靶點與2 個以上活性成分相互作用，69.19%的活性成分調控2 個以上靶點，充分體現了中藥“多成分-多靶點”的整體調節作用。

2.3 補中益氣湯和DGP 交集靶點蛋白互作網絡將130 個藥物-疾病交集基因導入STRING 數據庫進行蛋白互作網絡分析，結果導入Cytoscape3.7.1 軟件進行可視化，構建補中益氣湯和DGP 的交集靶點蛋白互作網絡圖（見圖2）。圖中節點表示蛋白，連線表示蛋白之間的關聯。節點的大小和顏色表示度中心度值的大小。節點越大，顏色越深，度中心度值越大，表示該節點在網絡中越重要。連線的粗細表示合并分值的高低，連線越粗，分值越高，表示節點間的關聯度越強。網絡中發生相互作用的節點有128 個，共有1198 條連線，各節點的平均度中心度值為18.71，平均中介中心度值為0.010，平均接近中心度值為0.45。各連線的平均合并分值為0.67。度中心度值、中介中心度值、度接近中心度值均超過平均值的關鍵靶點共有10 個（見表1）。

表1 補中益氣湯治療糖尿病胃輕癱的關鍵靶點信息

圖2 補中益氣湯和糖尿病胃輕癱交集靶點蛋白互作網絡

2.4 藥物-疾病交集靶點基因GO 功能和KEGG 通路富集分析 利用Cytoscape 軟件中的ClueGO 插件對藥物-疾病交集靶點基因進行GO 功能富集分析及可視化。設定P＜0.05 為差異有統計學意義，共獲得32 個GO 功能富集。用餅狀圖描述參與不同生物學功能的靶點基因占總交集靶點基因的數量百分比（見圖3）。結果顯示，補中益氣湯可能通過調節神經遞質受體活性（24.44%）、G 蛋白偶聯受體活性（7.41%）、脂肪酶活性（6.67%）、細胞凋亡過程中半胱氨酸型內肽酶活性（6.30%）、氧化還原酶活性（5.93%）、電壓門控鉀通道活性（5.56%）、AMP 活化蛋白激酶活性（3.70%）、腎上腺素能受體活性（3.33%）、細胞因子活性（2.96%）等多途徑治療DGP。

圖3 藥物-疾病交集靶點基因功能富集分析

使用Cytoscape3.7.1 軟件中的CluePedia 插件對靶點基因進行KEGG 通路富集分析及可視化。設定P 值＜0.05 為統計閾值，共得到24 條KEGG 通路。用餅狀圖描述參與不同信號通路的靶點基因占總交集靶點基因的數量百分比（見圖4）。結果顯示，補中益氣湯可能通過調節催產素信號通路（42.80%）、AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）信號通路（13.98%）、胰島素抵抗（5.08%）、磷脂酰肌醇激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號通路（5.08%）、缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路（4.66%）、腎素-血管緊張素系統（Ras）信號通路（2.97%）、環磷酸鳥苷酸-蛋白激酶G（cGMP-PKG）信號通路（1.69%）、血管平滑肌收縮（1.69%）等多條信號通路治療DGP。

圖4 藥物-疾病交集靶點基因通路富集分析

3 討論

隨著社會的發展，糖尿病已成為全球最大的公共衛生問題之一[8]。據國際糖尿病聯合會2021 年全球糖尿病地圖顯示，全世界約有10.5%的成人患有糖尿病[9]。DGP 是糖尿病常見的慢性并發癥之一，研究顯示，50%以上血糖控制欠佳的糖尿病患者會出現DGP[2]。中醫認為，DGP 可歸于中醫“消渴”“痞滿”“嘔吐”等范疇。其基本病機為消渴日久，脾胃受損，運化無力，胃失和降，氣機不暢[10-11]。因此，DGP 多以脾胃虛弱兼氣滯、痰濁、血瘀等辨證論治，基本治則以健脾和胃、益氣消痞為主。補中益氣湯中黃芪升陽固表，人參、甘草、白術補氣健脾，當歸養血和營，陳皮理氣和胃，升麻、柴胡升陽舉陷。全方具有升清降濁、補氣健脾之功效。既往研究顯示，補中益氣湯可通過提高糖尿病模型大鼠血漿P 物質及胃竇干細胞因子（SCF）蛋白水平，增強SCF/kit 信號傳導，改善大鼠胃腸蠕動功能，促進胃腸排空，從而起到治療DGP的作用[12]。但目前補中益氣湯治療DGP 的相關機制研究相對較少，其機制尚不明確。由于補中益氣湯中含多味中藥，化學成分眾多，且存在多種相互作用，傳統實驗研究方法難以全面深入地研究其有效成分、作用靶點及作用機制。網絡藥理學是基于系統生物學和生物信息學理論，以生物和醫學大數據研究為核心，對藥物進行多成分、多靶點、多通路的網絡作用關系分析，因而可以更加系統、深入地分析中藥方劑治療疾病的作用機制[13]。

本研究利用網絡藥理學方法探索補中益氣湯治療DGP 的機制，獲得補中益氣湯中與DGP 相關的活性成分共185 個，其中三磷酸腺苷、呋喃色酮、十七醇、香芹酚、異黃酮等可作用于較多DGP 靶點。研究顯示，高糖條件下，大鼠胃平滑肌細胞三磷酸腺苷含量下降，細胞能量代謝途徑改變，線粒體能量代謝受抑制，糖酵解增加，進而可導致DGP 的發生[14]。呋喃色酮具有良好的抗氧化損傷、抗炎、抑制凋亡作用[15]。波譜分析顯示，新鮮食用仙人掌塊莖中的十七醇可有效降低小鼠血糖水平[16]。研究顯示，香芹酚可減輕化療藥物鹽酸伊立替康導致的腸黏膜炎，降低腸黏膜促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β），炎癥相關指標核因子κB（NF-κB）、環氧合酶-2（COX-2）和氧化應激相關指標谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）和氮氧化物（NOx）的表達水平[17]。香芹酚還可明顯降低糖尿病小鼠的隨機血糖以及凋亡相關因子丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1（PDK1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）水平，從而改善血管平滑肌細胞增殖與凋亡失衡[18]。此外，研究顯示，富含異黃酮的大豆胚芽面食飲食可改善DGP 患者胃排空延遲，這可能與異黃酮的抗氧化應激作用有關[19]。DGP的發病與高血糖、氧化應激、凋亡、炎癥反應等多種因素有關[20-22]。高血糖可導致胃腸肌間神經叢的神經元凋亡，影響胃收縮功能和胃電節律，從而導致胃排空速率減慢。氧化應激可導致胃腸道神經細胞退化、凋亡，胃腸道Cajal 間質細胞（ICC）氧化損傷、數量減少、超微結構改變，進而加重胃排空延遲。胃固有肌層巨噬細胞極化，炎性因子增加、抗炎因子減少也與DGP 的發生發展密切相關。綜合上述關于補中益氣湯核心活性成分及DGP 發病機制的相關研究結果，我們推測，補中益氣湯治療DGP 胃排空延遲的主要機制可能與控制血糖、改善氧化應激、凋亡及炎癥反應等有關。

進一步分析發現，補中益氣湯作用的關鍵靶點胰島素（INS）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白介素-6（IL6）、內皮型一氧化氮合成酶（NOS3）、腎上腺素能受體（AR）、胰島素樣生長因子（IGF1）等與DGP 的發生發展密切相關。研究顯示，對于1 型糖尿病小鼠，INS 治療可通過保護肌間膽堿能神經元和ICC，有效延緩糖尿病胃輕癱的發展[23]。AMP 依賴的蛋白激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AMPK/Akt）、PI3K/Akt 等通路可參與調節糖尿病大鼠胃平滑肌細胞凋亡、細胞增殖及ICC 損傷[24-26]。IL-6 作為一種促炎因子，在炎癥加重DGP 患者胃排空延遲的過程中起著至關重要的作用[27]。NOS3 屬于一氧化氮合酶，研究表明，胃腸一氧化氮合酶神經元損傷是導致DGP 的重要原因之一[28]。此外，研究發現，激活AR 可促進胃平滑肌細胞增殖，抑制胃平滑肌細胞凋亡，從而改善DGP 大鼠的胃排空延遲[29]。IGF-1 治療能夠下調高糖條件下體外培養的大鼠胃平滑肌細胞內質網應激和自噬相關蛋白的表達，通過抑制內質網應激和自噬改善DGP 胃排空延遲[30]。綜上，我們推測補中益氣湯可能通過作用于上述多靶點，抑制細胞凋亡、炎癥反應、自噬，改善氧化應激和神經損傷，從而影響DGP 的發生發展。

GO 富集分析顯示，補中益氣湯可能通過調節神經遞質受體活性、細胞凋亡相關酶活性、氧化還原酶活性、AMP 活化蛋白激酶活性、AR 活性、細胞因子活性、IGF-1 結合等多途徑治療DGP，與關鍵靶點的相關功能研究結果具有一定一致性。KEGG 通路富集分析進一步發現，24 條通路與DGP 密切相關。其中，AMPK 通路、PI3K/Akt 通路與凋亡有關，HIF-1 通路與缺氧損傷有關，cGMP/PKG 通路與胃腸道平滑肌細胞有關。研究顯示，高糖條件下，活化的AMPK可通過調節p53、Akt、蛋白激酶A（PKA）、磷脂酶C（PLC）等的表達和活性，直接或間接促進大鼠胃平滑肌細胞凋亡，進而導致DGP 的發生[24]。去甲烏藥堿可通過激活β2-AR/PI3K/Akt 通路抑制DGP 大鼠胃平滑肌細胞凋亡[25]。PI3K/Akt 通路激活還可促進糖尿病大鼠胃平滑肌細胞增殖，補充胃竇ICC 缺失[26]。HIF-1 的表達與缺氧程度和組織缺血狀態密切相關。研究顯示，DGP 大鼠胃黏膜HIF-1 表達上調，提示胃黏膜細胞缺氧可能是胃排空延遲的始動因素或關鍵步驟，在DGP 的發生發展中起重要作用[31]。磷脂酶C-肌醇三磷酸-鈣離子/一氧化氮-環磷酸鳥苷酸-蛋白激酶G（PLC-IP3-Ca2+/NO-cGMP-PKG）通路可通過調節DGP 大鼠胃平滑肌細胞長度及細胞內Ca2+濃度，影響DGP 發生發展[32]。此外，KEGG 通路富集分析還發現，補中益氣湯可能通過調節胰島素抵抗通路、腎上腺素能信號傳導通路、cAMP 信號通路等治療DGP。上述分析結果與交集靶點的相關功能研究及GO 富集分析結果具有高度一致性。

綜合上述網絡藥理學分析及相關實驗研究結果，推測補中益氣湯可能通過作用于多靶點、多通路抑制凋亡、自噬、氧化應激、炎癥反應，調節胰島素、血糖水平，從而改善胃腸道平滑肌細胞和ICC 損傷，以影響DGP 的發生發展。本研究為補中益氣湯治療DGP 提供一定理論依據，為后續進一步實驗研究提供參考方向。但目前DGP 的相關研究仍相對較少，公共數據庫中納入的疾病相關基因相對有限。此外，由于中藥復方的化學成分和作用方式較復雜，網絡藥理學研究仍存在一定局限性，尚不能完全反映藥物活性成分與疾病靶點之間的相互作用，如實際發揮生物學效應的具體方式，上調還是下調等。因此，本研究結果仍有待后續實驗研究進一步驗證。