柴貝止癇顆粒對顳葉癲癇大鼠海馬BDNF-TrkB信號系統的影響*

劉亞粉 張 青 楊洞洞

浙江中醫藥大學附屬第一醫院 浙江 杭州 310006

癲癇是一種以反復自發性癲癇發作（spontaneous recurrent seizures，SRS）為特征的慢性進行性神經系統疾病。目前,癲癇的治療以抗發作藥物（anti-seizure medications，ASMs）控制SRS為主，并不能從根本上治療癲癇，且近30%的患者對ASMs治療無效[1]，容易出現抑郁、焦慮、認知障礙、睡眠障礙和偏頭痛等共患病[2]。因此，迫切需要根據癲癇的發生發展機制尋找新的治療藥物或策略。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）可以通過受體-配體通路抑制癲癇的發生，這可能成為癲癇潛在的治療靶點。柴貝止癇顆粒是臨床經驗用方，其對癲癇的治療安全有效[3]，然而其抗癲癇發生發展的作用機制尚未明確。本研究模擬常見癲癇綜合征顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）的發生發展過程，通過觀察大鼠行為學、海馬BDNF及其受體酪氨酸激酶受體B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）、下游信號分子磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的表達，探討柴貝止癇顆粒對TLE的療效及可能的作用機制，為尋找中藥復方干預癲癇的新靶點提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SD雄性大鼠50只，體質量220～250g（許可證號：SCXK（湘）2019-0004，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）。飼養條件：室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，光照周期12小時。

1.2 實驗藥物：海人酸（kainic acid，KA）（Med Chem Express，cas：487-79-6）；地西泮注射液（2ml：10mg/支，上海旭東海普藥業有限公司，國藥準字號：H31021864）；柴貝止癇顆粒（浙江景岳堂藥業有限公司制備，方中柴胡、天麻、浙貝母、法半夏、石菖蒲、牡蠣、地龍的比例為4∶5∶3∶3∶3∶10∶2，1g顆粒劑相當于原生藥9.73g）。

1.3 主要實驗試劑及儀器：腦立體定位儀（上海玉研科學儀器有限公司，SA-102）；微量注射泵（KD Scientific，LEGATO 130）。Mouse Monoclonal Anti-GAPDH（中杉金橋，TA-08，1/2000）；Rabbit Anti BDNF（Abcam，ab108319，1/1000）；Rabbit Anti TrkB (Abcam，ab187041，1/5000）；Rabbit Anti PI3K (Abcam，ab191606，1/1000）。

1.4 造模及干預方法：分述如下。

1.4.1 動物分組：50只SD大鼠，假手術組10只，其余進行TLE造模，TLE模型大鼠隨機分為模型組和治療組。

1.4.2 建立模型：大鼠麻醉后備皮，固定于腦立體定位儀，以Bragma點作為三維坐標系的參考零點，確定SD大鼠右側側腦室坐標（側腦室：x=-1.6mm，y=-0.8mm，z=-3.8mm）。標記側腦室后，牙科鉆鉆孔，模型組和給藥組微量注射器注射海人酸（濃度0.5μg/μl），注射3μl，注射速度為1μl/min，留針5min，緩慢退針。大鼠蘇醒后觀察1小時，按Racine[4]分級判定發作的級別，4～5級發作反復出現持續1小時視為造模成功，否則棄用。1小時后給予大鼠地西泮注射液（0.1mg/kg）腹腔注射終止發作。假手術組予同等方法注射同等劑量的生理鹽水。

1.4.3 藥物干預：造模第一天起治療組給予柴貝止癇顆粒0.96g/kg/d灌胃（給藥劑量按動物體表面積以成人用量換算，給藥體積為10ml/kg·d），模型組和假手術組給予蒸餾水灌胃（10ml/kg·d）。

1.5 檢測指標及方法：分述如下。

1.5.1 動物行為學觀察：每組隨機選取3只大鼠，于造模后11w進行視頻監測1w，記錄各組大鼠發作次數、每次發作持續時間，計算平均發作持續時間=每次發作持續時間之和/總發作次數。

1.5.2 標本采集：每組隨機選取3只大鼠分別于造模后2d、10d取材，進行視頻監測的大鼠于造模后12w取材，10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，鍘刀斷頭取出腦組織，置冰上，分離海馬組織-80℃保存備用。

1.5.3 蛋白質免疫印跡（Western Blot，WB）：取海馬組織放入研磨器中，加入液氮研磨成粉末后，加入裂解液，4℃裂解30min，在10000rpm/min離心10min，吸取上清液即得總蛋白；利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定；蛋白變性、上樣、電泳1～2h，濕法轉膜30～50min；相應一抗、二抗孵育后，ECL曝光；用“Quantityone”軟件分析BDNF、TrkB、PI3K、GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.6 統計學方法：使用SPSS 23.0進行統計學分析，計量資料符合正態分布用（±s）表示，方差齊采用單因素方差分析，兩兩比較選用LSD法。設置雙側檢驗水準α=0.05，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 動物行為學評價：各組大鼠總發作次數、平均發作持續時間比較：見表1。

表1 各組大鼠總發作次數、平均發作持續時間比較（±s）

表1 各組大鼠總發作次數、平均發作持續時間比較（±s）

注：與模型組比較，#P＜0.05。

組別模型組治療組平均發作持續時間（秒）43.00±4.58 33.33±3.79#總發作次數（次）46.00±7.00 32.00±4.36#

2.2 不同時間點各組大鼠海馬BDNF、TrkB和PI3K表達比較：見表2、圖1。

表2 各組大鼠海馬BDNF、TrkB和PI3K表達比較（±s，目標蛋白/GAPDH OD值）

表2 各組大鼠海馬BDNF、TrkB和PI3K表達比較（±s，目標蛋白/GAPDH OD值）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2d 10d 12w組別假手術組模型組治療組PI3K 0.62±0.06 0.68±0.06 0.71±0.07 BDNF 1.36±0.14 1.02±0.10*1.02±0.10*TrkB 1.54±0.15 1.32±0.13 0.89±0.09#PI3K 0.96±0.10 1.08±0.11 0.94±0.09 BDNF 1.00±0.10 0.99±0.10 1.16±0.12 TrkB 1.58±0.16 1.63±0.16 1.68±0.17 PI3K 1.14±0.11 1.36±0.14 1.43±0.14 BDNF 0.96±0.09 0.75±0.07*1.28±0.12*#TrkB 0.94±0.09 0.92±0.09 1.03±0.10

圖1 WB檢測各組大鼠海馬BDNF、TrkB和PI3K的表達

3 討論

TLE屬于中醫學癇病范疇，病位主要涉及肝、腦，病理因素以郁、風、痰為主。其反復發作、經久難愈可能與氣郁久滯、頑痰難化有關[5]。因此，柴胡劑廣泛用于癇病的治療[6,7]。柴貝止癇顆粒是在《傷寒論》柴胡加龍骨牡蠣湯和《醫學心悟》定癇丸的基礎上加減化裁而成，制成顆粒劑更方便臨床應用。方中柴胡為君，苦辛而微寒，疏肝解郁、條達肝氣，使肝風易止、痰郁得散；天麻性味甘平，熄風止痙、平肝潛陽，浙貝母苦寒，化痰清熱散結，半夏辛溫，燥濕化痰，共為臣藥；牡蠣、地龍咸寒，熄風定驚、軟堅散結，共為佐藥；石菖蒲引藥入腦絡，并制他藥之寒涼，兼為佐使。諸藥合用，共奏疏肝理氣、化痰熄風、醒神開竅之功。本研究發現，柴貝止癇顆?？蓽p少TLE大鼠發作次數、降低平均發作持續時間，提示該顆粒劑對TLE具有一定的治療效果。

BDNF是神經營養因子家族的重要成員之一，TrkB是BDNF的高親和力受體，PI3K是BDNF-TrkB下游的信號通路之一。許多細胞和動物研究表明，BDNF水平降低與癲癇發病率增加有關[8]，BDNF-TrkB信號的缺失可導致SRS[9]，BDNF可通過降低GABA能神經元興奮性[10]、減輕癲癇發生相關的炎癥反應[11]抑制癲癇。臨床研究也證實BDNF水平的降低與癲癇的發生之間存在直接關系[12]。本研究中模型組大鼠海馬BDNF在TLE急性期（造模后2d）、慢性期（造模后12w）均降低，驗證了BDNF在TLE發生發展中的作用。然而TrkB、PI3K未表現出與TLE的相關性，提示BDNF可能通過其他靶點參與TLE的發生發展。經柴貝止癇顆粒治療12w后，可提高BDNF的表達，這可能是該顆粒劑干預癲癇的機制之一。柴貝止癇顆?？梢宰鳛橐环N新型的癲癇治療措施應用于臨床，但該顆粒劑通過提高BDNF抑制癲癇發生的確切分子機制有待進一步研究。