多功能復方溶致液晶治療5 Gy γ 射線照射小鼠皮膚損傷

夏明宇 胡靜璐,2 曹祥龍 王辰允 杜麗娜,2 金義光,2

1（軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所 北京 100850）

2（河南大學藥學院 開封 475004）

3（解放軍總醫院第四醫學中心衛勤部 北京 100048）

核輻射包括核爆、核泄漏、放射源、醫療照射、職業照射、太空輻射等，均可造成組織損傷。核輻射組織損傷程度決定于射線類型和受照劑量，同時不同組織的射線敏感性也不同，如骨髓、腸、腦、皮膚、生殖腺、晶狀體、甲狀腺等敏感性較高［1］。人體長期受射線輻照，可出現頭昏乏力、記憶力減退、心悸、失眠多夢、毛發脫落、皮膚干燥、關節酸痛、晶狀體混濁、肝臟腫大、齒齦出血、咳嗽等癥狀［2］。輻射組織損傷的基本原因是細胞DNA 損傷，包括DNA 堿基損傷、DNA 分子單鏈或雙鏈斷裂、DNA 分子間交聯、DNA氫鏈變化、糖基破壞等［3］。研究高效、低毒、使用方便的抗輻射藥物具有重要的臨床價值和戰略意義。

照射皮膚損傷是皮膚經受輻射損傷合并機械創傷，主要特點是傷口反復潰瘍壞死，遷延難愈［4］。全身受照后也會延緩創面愈合，可能是造血系統受損，使皮膚愈合早期修復細胞減少所致［5］。輻射使皮膚表面產生大量自由基［6］，導致受照早期皮膚內細胞因子與生長因子表達降低［7?8］，而相關凋亡基因高表達［9］。受照皮膚局部成纖維細胞數量減少、形態受損、功能下降［10?11］、肉芽組織生長緩慢等復雜因素也導致皮膚修復功能受損［12］，影響創面愈合。目前尚無針對照射皮膚損傷的特效治療藥物。因此，研究一種針對受照皮膚損傷的鎮痛、促愈合、抑菌多功能制劑意義重大。

液晶是一種兼有晶體和液體部分性質的中間態。單一組分或少數化合物的均勻混合物因溫度變化而形成的液晶稱為熱致液晶（Thermotropic liquid crystals），而由兩親性分子溶解于溶劑后，包含溶劑化合物在內的兩種或多種化合物（處于一定濃度）形成的液晶稱為溶致液晶（Lyotropic liquid crystals）［13］。溶致液晶作為藥物載體具有許多優點：可包裹不同極性的藥物并保護其免受物理或酶降解；提高藥物生物利用度；具有生物黏附性；可延長藥物釋放時間；提高藥物穩定性及降低藥物毒副作用等。目前，構建溶致液晶的常用兩親性物質包括單油酸甘油酯（Glyceryl monooleate，GMO）和植烷三醇（Phytantriol）［14］，也可由泊洛沙姆（Poloxamer）和GMO共同構成。泊洛沙姆作為一種無毒、無刺激性的藥用輔料已被廣泛應用于口服、注射和局部用藥物制劑中，其中泊洛沙姆407（Poloxamer 407，Pluronic F127）應用廣泛。溶質液晶用于創面修復的優勢在于包容性強，局部停留時間長有利于發揮藥效。

本研究以蘆薈提取物作為促愈合成分、茶樹油作為抗菌成分、鹽酸利多卡因作為鎮痛抗炎成分，以GMO和泊洛沙姆407為主要基質，制備了復方溶致液晶。建立了受照昆明小鼠皮膚損傷模型，以創面愈合率、蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色病理結果為指標，評價復方溶致液晶對受照小鼠皮膚損傷的促愈合效果。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

茶樹油，廣東富陽生物科技有限公司（批號：SO1026）；GMO，上海甄準生物科技有限公司（批號：ZZS16030906）；泊洛沙姆407，德國BASF（批號：WRFT5338）；鹽酸利多卡因，山西新寶源制藥有限公司（批號：20130904）；庫拉索蘆薈提取物，成都克洛瑪生物科技有限公司；聚乳酸-羥基乙酸，濟南岱罡生物工程有限公司；無水乙醇、N-甲基吡咯烷酮（N-methyl pyrrolidone，NMP），國藥集團化學試劑有限公司；超純水，自制。

健康昆明小鼠，雌性，20～24 g，購自軍事醫學研究院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK-（京）2016-0011。所有動物實驗經軍事科學院軍事醫學研究院倫理委員會批準且實驗均按照相關指導原則和規定進行。動物飼養于SPF 級屏障動物房，室溫20～25 ℃，相對濕度55%～70%，通風良好、環境安靜，自由攝食、飲水，室內保持自然節律光照，并定期消毒。

1.2 儀器

萬分之一天平BS110S，北京賽多利斯天平有限公司；純水儀HF Swper NW，上?？道子邢薰?；超聲波清洗儀KM-822D，廣州市科盟科技有限公司；十萬分之一天平New classic MS，瑞士METTLER TOLEDO 集團；小型動物麻醉機IC-R，上海玉研科學儀器有限公司；60Co γ射線放射源，軍事醫學研究院輻射醫學研究所；X射線小角衍射儀SAXSess，安東帕有限公司；偏光顯微鏡DM2500P，德國萊卡。

1.3 空白溶致液晶處方優化

參考本實驗室溶致液晶制備工藝制備空白溶致液晶［15］。分別稱取0.50 g、0.75 g 和1.00 g 泊洛沙姆407，加適量水，于4 ℃過夜充分溶脹，繼續加水至5 mL，攪拌均勻作為水相，其中泊洛沙姆407 濃度分別為10%、15%和20%。稱取2 g GMO 加入1 mL 無水乙醇溶解作為油相，用注射器吸取3 mL水相緩慢注入到渦旋振蕩的油相中，油相逐漸變黏稠后，用玻璃棒攪拌均勻，繼續滴加剩余水相并不斷攪拌，室溫放置。

1.4 復方溶致液晶的制備

取0.08 g蘆薈提取物和45 mg鹽酸利多卡因與適量水混合溶解，加入1 g 泊洛沙姆407 攪拌均勻，在4 ℃過夜充分溶脹，加水至5 mL 作為水相。稱取2 g GMO 置于10 mL離心管中，加入1 mL無水乙醇超聲溶解，再加入1.5 g 茶樹油混勻后作為油相。取3 mL上述水相在渦旋條件下緩慢地連續注入油相，待油相逐漸黏稠后，用玻璃棒攪拌均勻，繼續滴加剩余水相，室溫放置。

1.5 溶致液晶表征

1.5.1 小角X射線衍射

取適量樣品利用小角X 射線衍射儀在真空、室溫條件下觀察溶致液晶結構。

1.5.2 偏光顯微鏡

取適量溶致液晶樣品于載玻片上，室溫下采用偏光顯微鏡觀察。

1.6 復方溶致液晶對受照皮膚損傷的藥效學評價

取30只昆明小鼠隨機分為3組：單純皮膚創傷組、受照皮膚損傷模型組和受照皮膚損傷治療組，每組10只。創傷模型制備前使用小動物麻醉機將小鼠麻醉，背部剃毛，用組織鉗和止血夾提起背部皮膚，用眼科剪切除背部記號筆標記的直徑1.5 cm圓形皮膚，不傷及皮下筋膜與組織。創傷模型制備過程中小鼠不會產生疼痛感，且致傷手術過程迅速、準確且無污染。將模型組與治療組小鼠置于有機玻璃盒中，采用5 Gy γ 射線單次全身照射，劑量率95.96 cGy/min，0.5 h 后在背部致傷，致傷步驟與單純創傷組相同。所有小鼠傷口均不包扎，給藥組小鼠用復方溶致液晶涂抹傷口，每日一次，覆蓋傷口全層，單純創傷組與模型組均不處理。所有小鼠均正常飲水、進食。

致傷后3 h 后拍攝傷口照片，使用Image Pro Plus 軟件處理照片，計算傷口面積，記為A0。之后分別于造模后第1 天、2 天、4 天、6 天、8 天、10 天和12天每天同一時間拍攝，傷口面積記為An，按式（1）計算傷口愈合率（記為R）。

于第7 天和第14 天每組隨機抽取2 只小鼠處死，取傷口周圍皮膚于福爾馬林中固定，石蠟包埋，4 μm 連續切片，HE 染色后觀察對比各組傷口愈合及炎性細胞浸潤情況，Masson染色后對比皮膚膠原生長情況。

1.7 統計學分析

采用SPSS 17.0 軟件對每組數據進行ANOVA單因素方差分析，p<0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 溶致液晶適合局部滯留給藥

濃度為10%、15%的泊洛沙姆407與GMO制成的溶致液晶流動性較好，黏度小。20%泊洛沙姆407制成與GMO 制成的溶致液晶呈透明凝膠狀，黏度較大，適合經皮給藥。因此，確定泊洛沙姆407 和GMO最終濃度分別為20%、40%。

復方溶致液晶外觀為黃綠色至綠色、黏稠凝膠狀。該制劑能在局部停留較長時間，有利于發揮藥效。

2.2 成功制備復方溶致液晶

2.2.1 小角X射線衍射

復方立方液晶的小角X 射線圖譜中有一明顯峰值（圖1），證明其為單晶結構。

圖1 復方溶致液晶的小角X射線衍射圖譜Fig.1 Small-angle X-ray diffraction graph of compound lyotropic liquid crystals

2.2.2 偏光顯微鏡表征

偏光顯微鏡下復方溶致液晶呈各向異性，且觀察到有膠團結構（圖2），可能是泊洛沙姆407由于分子間相互聚集形成的膠束。

圖2 復方溶致液晶的偏光顯微鏡照片Fig.2 Polarizing microscopic image of compound lyotropic liquid crystals

2.3 復方溶致液晶明顯促進放射性皮膚創傷愈合

受照皮膚損傷傷口恢復過程（圖3（a））及隨時間治療過程中不同組小鼠傷口剩余面積（圖3（b））可宏觀觀察每組小鼠傷口愈合情況，單傷組愈合最快，給藥組次之，模型組最慢。受照皮膚損傷模型組的傷口愈合率較創傷組顯著減緩，6 d時模型組創面愈合率與單純皮膚創傷組相比明顯降低（p<0.01）；而治療組與單純創傷組無顯著性差異（p>0.05）。單純創傷組12 d傷口愈合率達90%以上，治療組傷口愈合率于14 d達90%以上，而模型組18 d才達到此水平（圖3（c））。

圖3 各組創面愈合趨勢：（a）創面面積變化；（b）創面愈合率；（c）創面照片Fig.3 Profiles of wound healing in different groups:(a)wound area,(b)healing ratios of the wounds,(c)wound images

由HE 和Masson 病理切片可看出，7 d 時，單純創傷組表皮結構清晰，但可見部分膠原水腫，真皮基底層細胞排列不均；14 d后膠原致密，真皮層細胞排列有序并可見毛囊，有毛發生成。7 d時，模型組表皮角質層脫落，表皮不完整，膠原松散；14 d 后表皮層可見明顯增生，厚度不均，皮下血管出血，并有炎性細胞浸潤。治療組整體恢復情況較好，7 d 可見真皮層膠原結構較清晰，14 d有毛發生長，炎性細胞浸潤少（圖4）。

圖4 不同組小鼠不同時間HE和Masson病理結果Fig.4 The pathological pictures of HE staining and Masson trichrome staining in different groups of mice at different times

3 討論

受照皮膚創傷戰時多見于核爆炸，平時見于核事故、核恐怖活動，也可見于臨床放療等。由機械傷、武器傷等各種外因導致的皮膚創傷加上受照射因素，很容易引起死亡。當射線作用于皮膚時，會使皮膚血管內皮細胞受到損害，導致毛細血管損傷，血管通透性增加，炎性滲出，微血栓形成及微血管阻塞，進而導致皮膚微循環障礙，加重皮膚損傷［2］。在該動物模型建立方面，多采用致傷結合較低劑量輻射。如新型血小板源生長因子對放創復合傷大鼠創面的促愈作用研究中，采用γ射線全身照射，劑量為4 Gy，建立放創復合傷模型［16］。在另一項關于“大鼠放創復合傷時皮膚創傷愈合的形態學觀察”的研究中，分別采用了不同劑量γ 射線照射建立不同程度放創復合傷模型：輕度放創復合傷組（2 Gy 組）、中度放創復合傷組（4 Gy 組）、重度放創復合傷組（6 Gy 組）［17］。我們參考相關文獻，并在本實驗室前期預實驗基礎上，確立了5 Gy照射劑量結合創傷建立小鼠模型，為評價安全、有效的治療藥物奠定基礎。

蘆薈是百合科肉質草本植物，含有多種化學成分（如蒽醌類、有機酸、糖類、蛋白質、草酸鈣、纖維素等），具有瀉下、消炎、抑菌［18］、促創傷愈合［19］、美容［20］等多種功能。蘆薈提取物中的蘆薈素酊對細菌、真菌、病毒等各種微生物均有殺滅作用，涂于局部可防治感染。蘆薈提取物能促進膠原合成與細胞再生，有利于傷愈前期肉芽組織生長。

茶樹油，又名互葉白千層油，是通過蒸餾從港木桃金娘科互葉白千層葉中提取的純天然植物精油，為無色至淡黃色液體，具有抑菌、抗炎、驅蟲、殺螨等作用，無污染、無腐蝕性、滲透性強［21］。1，8-桉葉素為其主要抗菌成分［22］。茶樹油性質溫和，可直接用于皮膚表面，在傷口愈合期間可保持皮膚濕潤，減輕炎性反應。目前，臨床使用的茶樹油劑型一般包括乳劑、霜劑、凝膠、乳膏等。

利多卡因屬于酰胺類局部麻醉藥物，在發揮鎮痛作用的同時，能與神經細胞膜內側鈉通道受體結合，產生神經阻滯作用，封閉組織局部創傷炎癥反應，減少應激激素的釋放。有研究將利多卡因與慶大霉素合用治療海水浸泡的肢體關節爆炸傷炎癥反應及創面感染［23］。

全層皮膚切除加輻射的方法可模擬受照皮膚損傷，如果創傷面較小，傷口會修復很快，不能充分比較不同治療措施對傷口愈合的影響。因此，本研究篩選了輻照后損傷小鼠模型的建立條件，故最終確定創面直徑為1.5 cm。由于皮膚具有彈性，所以致傷后待皮膚收縮后，在自然狀態下進行拍照，采用專業分析軟件測量創面面積，以減小人為誤差。由于正常小鼠皮膚具有一定的彈性，創傷愈合與皮膚生理、病理條件相關［24］，導致在致傷3 h后拍攝傷口照片時三組傷口面積大小不同，但無統計學差異。通過在本研究實驗條件下觀察小鼠傷口愈合情況發現，單純皮膚創傷組愈合最快，治療組次之，模型組最慢。模型組較單純創傷組傷口愈合延緩6 d，給藥組較單純創傷組延緩2 d，這同時也說明了輻照加重了皮膚損傷，不利于創面愈合。HE、Masson 染色病理切片也證實了復方溶致液晶能有效促進傷口愈合。

4 結論

照射皮膚損傷由于電離輻射破壞了皮膚修復機制，造成創面反復潰瘍壞死、遷延難愈，目前尚無有針對性的特效治療藥物。本研究針對照射皮膚損傷的臨床表現，制備了一種集鎮痛、促愈合、抑菌功能于一體的溶致液晶新制劑，具有黏附性強、創面滯留時間長的優勢，有望為放創復合傷提供一種有效治療藥物。

作者貢獻說明 夏明宇完成了實驗設計與操作；胡靜璐完成了數據處理及文章撰寫；曹祥龍完成了部分試驗操作；王辰允和杜麗娜負責文獻調研、實驗設計和文章撰寫；金義光負責指導整個實驗。全體作者均已閱讀并認可該論文的最終版本。