輻照協同甲酸法分離南荻纖維素及其酶解性狀分析

王丹陽 武小芬 齊 慧 陳 亮 劉 安 鄧 明 王克勤,

1（湖南大學研究生院隆平分院 長沙 410125）

2（湖南省農業科學院 湖南省核農學與航天育種研究所農業生物輻照工程技術研究中心 長沙 410125）

南荻（Triarrhena lutarioripariaL.Liu）為禾本科多年生C4草本植物，其纖維素含量達32.5%～53.9%，是我國特有物種［1］。截至2017 年底，洞庭湖區南荻年產量達91.03×107kg，占全國總產量的30%以上，該資源多用于制漿造紙行業［2］。伴隨著洞庭湖水污染問題，制漿和造紙產能于2019 年全面退出。為充分利用湖區南荻資源，近年來科研人員重點探索研究南荻規?；迫剂弦掖?、生物質發電、新興綠色環保建材等產業鏈［3-5］。

木質纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，其中纖維素組成的微細纖維構成了纖維細胞壁的骨架，木質素和半纖維素等則作為微細纖維間的“膠黏劑”和“填充劑”，通過分子鏈的相互纏繞及部分氫鍵和化學鍵的相互結合，組成了結構復雜且緊密的纖維細胞壁結構［6］。酶解是纖維乙醇轉化過程的關鍵環節［7］。由于木質纖維素結構的復雜性，導致各組分之間難以分離，為更好地利用木質纖維素，對原材料進行預處理是必要的［8-9］。

常用的木質纖維素預處理方法有堿法、酸法、蒸汽爆破法、生物酶解法等［10］。而強酸強堿存在腐蝕設備、溶劑回收等問題，高溫高壓存在能耗大、成本高等問題［11］。生物酶解法其周期長、效率低［12］。作為價格低廉、回收率高、綠色環保的有機溶劑，甲酸被廣泛用于木質纖維素的預處理［13］。輻照技術作為綠色無污染的預處理手段頗受歡迎，輻照降解后樣品的分子量、機械強度和熱穩定性降低了，且在溶劑中的溶解度增加［14］。本試驗采用輻照協同甲酸法分離南荻木質纖維素，旨在獲得高純度的南荻纖維素，并對其進行酶解。此外，對南荻纖維素進行結構分析，為南荻木質纖維素規?；迫剂弦掖继峁┭芯炕A。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料南荻收割于洞庭湖，自然曬干后，置于陰涼干燥處備用。甲酸，質量分數88%，分析純，衡陽市凱信化工試劑股份有限公司；硫酸，質量分數98%，分析純，成都市科隆化學有限公司；乙酸、三水合乙酸鈉，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；D-無水葡萄糖、D-木糖、D-纖維二塘、L-阿拉伯糖，均為分析純，Sigma-aldrich 公司；溴化鉀，分析純，天津天光光學儀器有限公司；纖維素酶，Cellic Ctec3，Novozymes公司。

1.2 儀器與設備

5 MeV 電子束輻照裝置，河北速能輻照加工有限公司；BSA224S-CW 型電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；FW100 型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；YRGS 型智能磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；3GE-76 型電熱恒溫干燥箱、SHZ-C 型水浴恒溫振蕩器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DZKW-S-6 型電熱恒溫水浴鍋，北京市光明醫療儀器有限公司；JJ-6型數顯直流恒速攪拌器、功率100 W直流機，江蘇金怡科技有限公司；TG16-WS 型臺式高速離心機，湖南邁克爾實驗儀器有限公司；RE-2000B 型旋轉式蒸器，上海亞榮生化儀器廠；SHB-DIII 型循環水真空泵；鄭州長城科工貿有限公司；LDZX-50KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；BlueStar A型紫外分光光度計，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；UltiMate 3000型高效液相色譜儀、Nicolet iS5型傅里葉紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；6000 型X 射線衍射儀，日本島津公司；HZQF100型恒溫搖床，常州諾基儀器有限公司。

1.3 試驗設計與方法

1.3.1南荻樣品預處理

將南荻秸稈裝入金屬輻照箱中，于室溫下采用5 MeV 電子束進行輻照處理，吸收劑量分別為200 kGy、400 kGy，以未處理的南荻秸稈（0 kGy）為對照組。輻照處理后用鍘刀將其切割成0.5 cm×1.0 cm 左右的塊狀，如圖1 所示。相較于粉末狀，原料采用塊狀南荻秸稈，減少了物理粉碎的能耗，縮短了反應后的過濾時長，且更貼合工業化處理情況。

圖1 不同吸收劑量的塊狀南荻秸稈外觀Fig.1 Different absorbed doses of dioscorea Triarrhena lutarioriparia

1.3.2 南荻秸稈化學成分分析

南荻可溶性葡聚糖含量、可溶性木聚糖含量、酸不溶性木質素含量、酸溶性木質素含量、纖維素含量、半纖維素含量的測定，參照NREL法［15］。

具體操作：原料粉碎后過孔徑為0.45 mm 的篩網，稱取3.0 g 過篩樣品于三角瓶中，按固液比1∶30加入蒸餾水，于50 ℃、130 r/min震蕩反應2 h進行水洗處理，反應后過濾，收集濾液，測定葡萄糖、木糖含量；取濾液20 mL 加入質量分數72%硫酸溶液0.715 mL，121 ℃反應1 h 后，測定葡萄糖、木糖含量；水洗濾渣于105 ℃烘至恒重后，收集于自封袋中備用。

兩步酸水解：稱取0.3 g 水洗濾渣至三角瓶中，加入質量分數72%硫酸溶液3 mL，于30 ℃水浴反應1 h，反應結束后加入84 mL 蒸餾水，置于高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃反應1 h。反應結束后過濾，收集濾液稀釋適當倍數后于320 nm處測吸光度，并測定濾液中葡萄糖、木糖含量。濾渣于105 ℃烘至恒重，測得酸不溶性木質素重量。

葡萄糖、木糖含量測定：取濾液過0.45 μm 濾膜，采用高效液相色譜法（HPLC）測定葡萄糖、木糖含量，流動相為0.005 mol/L 的硫酸，流速0.6 mL/min；色譜柱Bio Rad Aminex HPX-87H（7.8×300 mm），柱溫55 ℃，柱后冷卻溫度30 ℃，示差折光檢測器（RI），檢測器溫度45 ℃，進樣體積10 μL。

1.3.3 輻照協同甲酸法分離南荻木質纖維素及各組分分析

稱取25.0 g 塊狀南荻秸稈于三頸燒瓶中，固液比1∶10加入甲酸溶液，在一定溫度下反應2 h，反應結束后抽濾，濾渣水洗至中性，且烘干后粉碎過孔徑為0.45 mm 的篩網，即南荻纖維素；濾液在60 ℃下旋蒸至近干，加入蒸餾水析出木質素，將其抽濾，濾渣烘干后經研缽研磨，為南荻木質素，濾液為木糖溶液［16］。參照§1.3.2 中兩步酸水解對各組分含量進行測定。綜合文獻信息，反應溫度、甲酸濃度、吸收劑量對木質纖維素的分離有較大的影響，故以此為研究因素，進行三因素三水平的正交實驗優化南荻纖維素的分離條件。正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

通過式（1）計算各組分中纖維素提取率，式（2）計算木質素提取率。

式中：Ecel代表纖維素提取率；pcel?tl代表南荻纖維素純度；mcel?tl代表南荻纖維素干重，g；mtl代表原料南荻干重，g；ctl-cel代表原料南荻的纖維素含量；Elig代表木質素提取率；plig-tl代表南荻木質素純度；mlig-tl代表南荻木質素干重，g；ctl-lig代表原料南荻的木質素含量。

1.3.4 南荻纖維素酶解反應

酶活測定：稱取50 mg 濾紙碎片加入稀釋后的酶液0.5 mL、pH 為4.8 的乙酸-乙酸鈉緩沖液1 mL，50 ℃酶解反應1 h，取出，沸水浴5 min，終止反應；取酶解上清液，稀釋至合適倍數后，采用HPLC測定酶解液中葡萄糖的含量。根據在酶的催化作用下，每分鐘形成1 μmol 葡萄糖時所用該酶的量作為一個酶活國際單位，測得纖維素酶活為115 FPU/mL［17］。

纖維素酶解轉化率測定：稱取樣品2.0 g，按固液比1∶10 加入pH 為4.8 的乙酸-乙酸鈉緩沖液，纖維素酶添加量為15 FPU/g，置于轉速130 r/min，50 ℃恒溫搖床進行酶解，每隔24 h 取其上清液0.3 mL，離心后稀釋10 倍，HPLC 測定葡萄糖含量，按式（3）計算纖維素酶解轉化率。

式中：Tcel為纖維素酶解轉化率；mglu為葡萄糖質量，g；m為樣品干重，g；ccel為樣品纖維素含量。

1.3.5 南荻纖維素結構分析

傅里葉紅外光譜（FTIR）分析：取適量經60 ℃干燥至恒重的樣品與干燥后溴化鉀（KBr）均勻混合后，研磨、壓片，掃描次數為32 次，測量范圍為400～4 000 cm?1。

X射線衍射（XDR）分析：取適量經60 ℃干燥至恒重的樣品用于X 衍射測定結晶度，條件為Cu 靶，管壓40 kV，電流40 mA，掃描范圍5°～50°，掃描速度6(°)/min，根據式（4）計算樣品的結晶度。

式中：Xc為纖維素結晶度；I1為主結晶峰的最大衍射強度；I2為無定形區衍射峰的衍射強度。

1.4 數據處理

采用SPSS 19和Microsoft Excel 2010分析整理數據；Origin 2021制圖。

2 結果與討論

2.1 輻照前后南荻秸稈的主要化學成分分析

由表2可知，未輻照南荻秸稈纖維素、半纖維素和酸不溶性木質素含量分別為41.73%、18.79%和25.55%。隨著吸收劑量的增加，南荻秸稈纖維素和半纖維素含量顯著下降；可溶性葡聚糖、木聚糖含量隨吸收劑量的升高而顯著增加，酸溶性木質素含量也呈增加趨勢，說明了輻照處理后纖維素、半纖維素等成分降解為小分子糖。張勇等［18］研究輻照對玉米秸稈成分的影響時也得到類似的結論，且木質纖維素的降解是典型的固體界面催化，輻照處理能破壞木質纖維素相互交聯的緊密結構，使其變得疏松，從而更利于后續甲酸與纖維素底物的接觸，促進纖維素、木質素和半纖維素的分離。

表2 輻照處理對南荻組分含量的影響Table 2 Effect of irradiation on the content of Triarrhena lutarioriparia components (%)

2.2 輻照協同甲酸法分離南荻纖維素的工藝優化

2.2.1 正交試驗結果

以溫度、甲酸濃度和吸收劑量為研究因素，以南荻纖維素純度為指標，進行三因素三水平的正交試驗，結果如表3 和表4 所示。由表4 分析可知，溫度、甲酸濃度和吸收劑量對南荻纖維素純度均有顯著性影響，其中甲酸濃度對纖維素純度影響最大，甲酸濃度的提高有助于木質素與半纖維素的溶解，從而使纖維素純度增加［19］；吸收劑量次之，輻照處理后半纖維素含量明顯降低，由表3 L9（33）正交試驗表可知，C 因素1 水平0 kGy 僅為甲酸處理組，C因素2、3（經200 kGy、400 kGy 輻照處理）水平下的纖維素純度均值分別為64.927%、64.653%，明顯高于1 水平的纖維素純度均值59.567%。溫度對纖維素純度的影響稍弱于吸收劑量，高溫下可使半纖維素與木質素的溶解速率加快。由表3可知，其最佳的分離條件為A3B3C2，即南荻秸稈在吸收劑量為200 kGy、在110 ℃下經88%甲酸處理2 h。

表3 L9(33)正交試驗表Table 3 Test designs of L9(33)orthogonal experiments

表4 正交實驗因素水平表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiments

2.2.2 工藝驗證

對§2.2.1中正交試驗篩選的最優工藝條件進行驗證。從表5可知，輻照協同甲酸處理所得南荻纖維素的提取率達92.99%、純度達73.26%，除纖維素外還含有少量的半纖維素和木質素成分。分離所得南荻木質素的提取率達61.46%、純度達81.29%，另外，還含有少量纖維素和半纖維素成分。綜合分析認為該工藝條件有利于南荻木質纖維素組分的分離，以下所述的輻照協同甲酸處理所得纖維素均按此工藝從200 kGy輻照南荻秸稈中分離獲得。

表5 輻照協同甲酸處理所得纖維素和木質素成分分析Table 5 Component analysis of cellulose and lignin fractionate by irradiation-assisted formic method (%)

2.3 南荻纖維素結構分析

2.3.1 FTIR光譜分析

圖2 為不同處理南荻纖維素紅外光譜圖，3 390 cm?1特征峰是羥基O?H 伸縮振動；2 920 cm?1特征峰是亞甲基、次甲基C?H伸縮振動；1 725 cm?1特征峰是醛官能團C=O伸縮振動，其主要由半纖維素中的特征基團引起的；1 640 cm?1特征峰是吸附水H?O?H 彎曲振動；1 513 cm?1特征峰是苯環伸縮振動，為木質素的特征峰；1 427 cm?1、1 377 cm?1、1 248 cm?1分別是纖維素?CH2對稱彎曲振動、?CH2彎曲振動、C?C?H 變形振動；1 161 cm?1特征峰是C?O?C不對稱伸縮振動，為纖維素超分子鏈上的主要結合鍵；1 050 cm?1特征峰是纖維素C=O 伸縮振動；898 cm?1是β-1，4糖苷鍵的特征峰［20?22］。

圖2 不同處理所得南荻纖維素FTIR圖Fig.2 FTIR spectra of Triarrhena lutarioriparia cellulose obtained by different treatments

200 kGy 輻照處理所得的南荻纖維素，在波數3 390 cm?1、2 920 cm?1、1 427 cm?1、1 377 cm?1處的峰吸收強度降低，說明200 kGy南荻秸稈中羥基、甲基和次亞甲基含量降低，即輻照對纖維素有一定的降解作用；在波數1 725 cm?1處的振動減少，其主要由半纖維素降解引起；此結果與胡蝶等［23］對輻照后芒草的結構變化相一致。此外通過1 427 cm?1處和898 cm?1處的吸光度之比（A1430/A898）可知，經輻照處理后纖維素的結晶度降低了。

輻照協同甲酸處理所得的南荻纖維素，在波數3 390 cm?1、2 920 cm?1處的峰吸收強度較大，說明甲酸對纖維素的降解程度較低；在波數1 725 cm?1、1 513 cm?1處的振動減少，說明經甲酸處理后有效地去除了半纖維素和木質素組分，即輻照協同甲酸適用于南荻木質纖維素的分離；武小芬等［24］的研究也表明甲酸有利于稻草木質纖維素的分離。

2.3.2 XRD分析

由圖3可知，輻照及輻照協同甲酸處理后，2θ衍射角為16.5o、22.0o、34.5o處的衍射峰位置未發生變化，說明輻照及輻照協同甲酸處理未改變纖維素晶型，均為Ⅰ型結構［25］。經計算未輻照南荻秸稈、200 kGy 南荻秸稈、輻照協同甲酸處理所得的南荻纖維素的結晶度分別為55.43%、52.46%、59.92%。相對于0 kGy南荻秸稈，200 kGy南荻秸稈的結晶度有所下降，南荻秸稈經輻照后產生自由基，自由基位阻大，導致具有半剛性的纖維素分子鏈發生斷裂解聚，使纖維素結晶度下降，這與Fei等［26］的研究結果一致；相對于未經輻照處理的南荻秸稈，輻照協同甲酸處理所得纖維素結晶度升高。

從圖3可知，南荻秸稈經甲酸處理后其2θ衍射角為16.5o、22.0o、34.5o三處衍射峰變得尖銳。張莉等［27］研究甲酸-鹽酸體系下木質纖維素的組分分離，經甲酸體系處理過的XRD峰變得特別尖銳，說明經過甲酸處理有部分結晶生成或結晶重排定向。許家云等［28］在研究甲酸法提取麥草化學組分及表征時，提出原料結晶度是整個木質纖維素的結晶度（包括纖維素、木質素、半纖維素），經甲酸處理后去除了大量的木質素和半纖維素，使纖維素的相對含量增加，故處理后結晶度增加。

圖3 不同處理所得南荻纖維素XRD圖Fig.3 XRD of Triarrhena lutarioriparia cellulose obtained by different treatments

2.4 南荻纖維素酶解效果

影響纖維素酶解的因素主要有纖維素酶的可及度、纖維素結晶度和聚合度、木質素含量和結構等，增加纖維素酶的可及度，降低纖維素結晶度，降低樣品中木質素含量等都可以提高纖維素酶解轉化率［29?30］。

從圖4 可知，相比未經輻照處理的南荻秸稈，200 kGy輻照處理所得的南荻秸稈在0～24 h內纖維素酶解轉化率顯著提高，在48 h 后其變化較小，酶解96 h 時200 kGy 南荻秸稈的酶解轉化率達到19.21%，相比于未經輻照處理的南荻秸稈提高了1.32 倍，說明輻照處理可以有效提高南荻秸稈的酶解轉化率，這與陳亮等［31］的研究結果一致。從圖5可知，酶解過程葡萄糖濃度也呈相同的趨勢。結合FTIR 光譜及XRD 衍射分析可知，輻照處理使南荻秸稈發生了一定的降解，增加了纖維素酶的可及度。此外，輻照后纖維素結晶度降低，也可使酶解轉化率進一步提高。

由圖4 可知，與200 kGy 南荻秸稈相比，在0～48 h，僅輻照處理的酶解轉化率高于輻照協同甲酸處理，在72～96 h，輻照協同甲酸處理的酶解轉化率仍在增加，而200 kGy輻照處理的變化較小，結合圖5可知，經200 kGy輻照處理的南荻秸稈在48 h時其纖維素較大程度上被酶解了，而輻照協同甲酸處理所得的纖維素組分僅酶解了一部分，故其在72～96 h的酶解轉化率仍在增加，在酶解96 h時其轉化率達到28.43%，較未處理南荻秸稈的轉化率提高了2.43倍。通過§2.3.2 中XRD 分析可知，輻照協同甲酸處理所得的南荻纖維素結晶度高于僅輻照處理的，雖然南荻纖維素結晶度增加，影響了后續酶解效率，但結合§2.2.2中輻照協同甲酸所獲纖維素組分的成分分析可知，經輻照協同甲酸處理后南獲纖維素相對含量達73.26%，較未經處理的南荻原料的纖維素含量（41.73%）提高了0.76倍，且經過甲酸處理后大部分木質素被去除、半纖維素被溶解，增大了纖維素的孔隙率，進而使纖維素酶的可及度增加，故輻照協同甲酸處理后酶解轉化率顯著提高。

圖4 不同處理所的南荻纖維素經酶解后纖維素轉化率Fig.4 Cellulose conversion rate of Triarrhena lutarioriparia cellulose obtained by different treatments after enzymatic hydrolysis

圖5 不同處理所得南荻纖維素經酶解后葡萄糖濃度Fig.5 Glucose concentration of Triarrhena lutarioriparia cellulose obtained by different treatments after enzymatic hydrolysis

3 結論

經正交試驗分析，得到最佳分離工藝條件為：吸收劑量200 kGy、甲酸質量分數88%、油浴溫度110 ℃、反應時間2 h，該條件下南荻纖維素純度最高，達73.26%，提取率達92.99%。并對南荻纖維素進行酶解試驗，在固液比1∶10、纖維素酶添加量15 FPU/g、酶解溫度50 ℃、轉速130 r/min 的條件下酶解96 h 后，其纖維素轉化率達28.43%，較未處理原料提高了2.43倍。FITR、X射線衍射表明，輻照協同甲酸處理所得纖維素結構保存完整，處理后其結晶度明顯增加。

作者貢獻說明 王丹陽完成了論文中南荻木質纖維素的分離及其各組分成分的測定，實驗數據處理和分析，論文的撰寫和修改；武小芬完成論文的試驗設計，對文章進行了修改；齊慧完成了南荻纖維素酶解反應；陳亮完成了南荻纖維素的FTIR光譜分析；劉安完成了南荻纖維素的X-射線衍射分析；鄧明完成了論文中輻照前后南荻秸稈化學成分的測定；王克勤提供了本文的研究思路和試驗方案，以及論文研究的經費。全體作者均已閱讀并同意最終的文本。