植物甘油脂合成途徑第一步?；磻难芯窟M展

韓妮莎，丁碩§，鄭月萍，魏琳燕，柯星星，劉宏波，劉娟，鄭志富*

（1.浙江農林大學林業與生物技術學院，浙江 杭州，311300；2.浙江農林大學現代農學院，浙江 杭州，311300；3.河南省農業科學院經濟作物研究所，河南 鄭州，450002）

植物細胞中合成的絕大多數脂肪酸被摻入到 甘油骨架中，生成的極性甘油脂（glycerolipids）是生物膜的主要成分，而中性甘油脂三酰甘油（triacylglycerol,TAG）則是油料植物種子或果實中的主要儲存物質[1,2]。很多甘油脂及其代謝產物具有信號傳遞因子的作用，參與眾多與植物生長發育、生物脅迫或非生物脅迫相關聯的信號傳遞過程[3]。同時，TAG 代謝在維持植物細胞的能量和脂質平衡過程中發揮著重要作用。已知油料植物種子在發育過程中形成的TAG 可為光合自養前的幼苗生長提供所需的能量和碳源；TAG 的合成和轉化亦與花粉的形成和萌發密切相關[4,5]。因此，深入了解甘油脂代謝對油料作物產量與品質性狀的改良至關重要。

1 甘油脂合成

甘油脂的從頭生物合成途徑（de novoglycerolipid biosynthesis）是最基本的代謝過程，在低等與高等真核生物間存在較高的保守性。已知植物細胞中存在三個甘油脂合成部位，分別分布于質體、細胞質和線粒體中。植物已進化出多種機制，使得甘油脂分子在不同亞細胞區間廣泛地發生交換[6,7]。在傳統的Kennedy途徑中（圖1），甘油脂從頭生物合成的第一、二步?；磻謩e由3-磷酸甘油?；D移酶（Glycerol-3-phoshate acyltransferase, GPAT）和溶血磷脂酸?；D移酶（Lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAT）催化，形成的磷脂酸（Phosphatidic acid, PA）是極性甘油脂和中性儲存類甘油脂TAG生物合成途徑中的一個關鍵前體物質[8]，它在磷脂酸磷酸酶（Phosphatidate phosphatase）的作用下，水解脫去磷酸生成1，2-二酰甘油（Diacylglycerol,DAG）。DAG 是TAG 的直接合成前體，它的脂?；荰AG 生物合成的最后一步反應，該反應至少受兩類酶的控制，它們分別是以脂酰輔酶A 和磷脂作為脂?；w的二酰甘油?；D移酶[9～12]，即DGAT（Acyl-CoA: diacylglycerol acyltransferase）和PDAT（Phospholipid:diacylglycerol acyltransferase）。

隨著現代分子生物學的發展，人們不斷地發現更多的參與植物甘油脂代謝的遺傳因子和新的合成途徑。例如，有證據顯示，植物中存在一酰甘油（Monoacylglycerol，MAG）途徑[13]，這一途徑由依賴于脂酰輔酶A 作為?；w的一酰甘油?；D移酶（Monoacylglycerol acyltransferase，MGAT）所介導，將MAG 轉化為DAG，這說明植物細胞中DAG 的合成并不像傳統上描述的那樣單一。另外還發現，參與Lands 循環（Lands cycle）的溶血磷脂酸膽堿?；D移 酶（Lysophosphatidylcholine acyltransferase，LPCAT）能影響種子中甘油脂的脂肪酸組分，這表明Lands 循環和Kennedy 途徑在甘油脂的合成中存在著復雜的互作關系[14,15]（圖1）。這些新發現的遺傳因子對植物甘油脂生物合成的貢獻，在過去并沒有被清晰地認知。在目前已知的參與植物脂肪酸組裝（Fatty acid assembly）的一系列酶類當中，只有極少數的酶被公認為具有直接參與TAG 合成的功能，其中之一為催化TAG 合成途徑中最后一步?；磻腄GAT。

圖1 真核生物中甘油脂的生物合成Fig.1 Glycerolipid biosynthesis in eukaryotes

2 GPAT基因的克隆與功能研究

GPAT 催化甘油脂生物合成途徑中的第一步?；磻?，該反應被認為是關鍵的限速步驟，它居于脂肪酸和甘油脂合成代謝的中心位置，起到銜接二者的作用。位于質體中的GPAT 是可溶性的，由ATS1基因編碼，在甘油脂原核合成途徑中發揮重要作用。質體外的GPAT 則是膜結合蛋白，負責甘油脂真核合成途徑中的第一步?；磻?。有關質體中GPAT基因的克隆與功能已有較多研究[16～19]，但植物中膜結合GPATs 的研究相對滯后，一個重要原因是膜結合蛋白不易分離純化，且在體外難以重構獲得具有活性的酶分子。長期以來，這類GPAT，特別是位于內質網的GPAT 酶，是很多研究組關注的焦點，因為目前研究認為，內質網被認為是TAG 生物合成的主要位點[20]，內質網GPATs 的分離與鑒定對油脂合成的基因工程改良非常重要。但是，直到2001 年，真核生物中第一個編碼內質網GPAT 的基因才被克隆。Zheng 和Zou 基于低等和高等真核生物中甘油脂代謝具有相對保守性的設想，從研究面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）入手，分離鑒定了兩個編碼內質網GPAT 酶的基因，分別命名為GAT1和GAT2，這是首例報道真核生物細胞中內質網GPAT基因的克隆工作[21]。在此基礎上，其它真核生物中的GPAT基因的克隆研究逐漸取得了實質性進展[20,22～26]

2.1 擬南芥GPATs的生化特性與生理功能

根據酵母Gat1p 和Gat2p 多肽中所含的保守?；D移酶特征序列（Conserved acyltransferase motifs），Zheng 等從擬南芥中克隆到7 個相關基因，由之組成的GPAT家族被命名為AtGPAT[20]。隨著擬南芥基因組序列的完善，Beisson 等發現其中還存在另一個與之相關的成員，稱之為AtGPAT8[27]。由這一家族編碼的GPATs，大小接近、氨基酸序列相似，且均含有兩個跨膜氨基酸序列和四個保守的?；D移酶特征序列[20]。體外蛋白轉運分析（In vitroimport assay）顯示，AtGPAT1 具有雙重亞細胞定位特性，即位于內質網與線粒體[20]。反向遺傳學分析進而發現，AtGPAT1的突變嚴重延緩絨氈層細胞的程序性死亡，并影響花粉粒細胞內膜的形成，從而導致雄性不育[20]。

后續一些研究顯示，除AtGPAT9 之外，AtGPAT家族其它成員優先催化G-3-P 上sn-2 位置的?；磻?，而非sn-1 位置。目前大多認為這一家族的酶是高等植物所特有的，其主要功能是參與聚酯的合成。遺傳分析發現，AtGPAT4、6和8基因在角質合成過程中發揮重要作用，gpat4 gpat8雙突變體的莖和葉中角質含量明顯下降，保衛細胞角質含量的降低影響了氣孔的正常結構，造成干旱和病菌耐受性下降[28,29]。AtGPAT6參與花萼和花瓣角質合成，與花藥發育、植物育性相關，gpat6突變體的花粉萌發和花粉管伸長受到影響，種子結實率降低[30]。另外，AtGPAT5在擬南芥種皮和根中參與木栓質合成[27]。AtGPAT7與AtGPAT5序 列 相 似 度 高，AtGPAT7參 與植物損傷修復[28]。進一步的生化分析顯示，AtGPAT4、6 和8 結構相似，是獨特的雙功能酶，兼具sn-2 ?；D移酶和磷酸酶活性，可將G-3-P 轉化為2-單?；?甘油（2-Monoacylglycerol，2-MAG）[27,31]。而AtGPAT5與AtGPAT1只有sn-2?；D移酶活性，而無磷酸酶活性。迄今，AtGPAT2 和AtGPAT3 的生化特性尚不清楚[28]。

與ATS1 一樣，AtGPAT9 屬于sn-1 GPAT，優先在sn-1 位置上催化G-3-P 的?；磻?。GPAT9 是膜結合蛋白，位于內質網，參與質體外甘油脂的合成；其過表達和下調表達不影響外表皮的角質和蠟質的含量。atgpat9突變體表現出雌雄配子純合致死現象[32,33]。

在擬南芥體內，不同成員之間可能發生多種相互作用，但目前對這些互作復雜性的了解甚少，將來有必要運用新一代基因編輯技術構建多種不同的GPAT基因多突變體，進一步深入研究GPAT基因在植物體內的真實生物學功能。

2.2 油料作物GPATs基因對油脂合成的影響

除了模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）[20,30,34,35]，目前已在油菜（Brassica napus）[36～41]、花生（Arachis hypogaea）[42～46]和向日葵（Helianthus annuus）[47]等油料植物，水稻（Oryza sativa）[48]和玉米（Zea mays）[49～51]等單子葉植物，以及番茄（Solanum lycopersicum）[52～54]等植物中分離鑒定了多個與擬南芥GPAT基因同源的基因。這些植物中的GPAT基因表現出多種生理功能，在植物的生長發育中發揮著重要的作用。關于GPAT基因在植物育性和抗逆方面的功能，陳文玲等[26]與Liu 等[17]作了綜述介紹。本文重點討論油料作物GPAT基因在甘油脂合成中的功能。

2.2.1 油菜GPAT4、GPAT6和GPAT9基因對種子油脂合成的影響 現有證據表明，BnGPAT4在油菜種子油脂合成過程中扮演著重要角色，其表達量變化對種子含油量產生顯著影響。Chen 等運用RNAi技術下調甘藍型油菜BnGPAT4基因的表達，發現受RNAi干擾的轉基因株系與野生型相比，含油量下降了12.4%～24.1%；脂肪酸組分也發生了改變，油酸（C18∶1）下降了4.3%～16.5%，而亞油酸（C18∶2）和α-亞麻酸（C18∶3）則有不同程度的增加[37]。不過，目前并不完全清楚BnGPAT4 酶在植物體內的生化特性，因此BnGPAT4基因調控油菜種子油脂合成的具體機制尚待進一步完善。

目前，與BnGPAT4 高度相似的BnGPAT6 在種子油脂合成過程中的功能并不清晰。耿宇等運用RNAi 技術下調甘藍型油菜BnGPAT6基因的表達，發現轉基因種子與野生型相比，萌發延緩1～2 d，發芽勢弱，真葉出現時間晚3～4 d，推測轉基因種子萌發遲緩可能與其種子中的三酰甘油含量較低有關[39]，但缺乏直接證據證明BnGPAT6基因對種子含油量產生影響。

另外，邢蔓等的研究顯示，BnGPAT9基因在擬南芥種子中的特異性表達可在一定程度上促進種子的油脂合成，使得種子含油量提高了1.91%～2.56%，并使脂肪酸組分發生了一些變化[40]。但BnGPAT9是否構成油菜種子油脂合成的關鍵基因，目前尚缺少有力的生化證據。我們實驗室最近運用酵母遺傳互補法對BnGPAT9 進行了體內酶學活性鑒定，這將在后續分析中介紹[55]。

上世紀七十年代，原輕工業部成立了全國家用電器工業科技情報站；1980年，北京家用電器研究所（2002年更名為中國家用電器研究院）被確定為全國家用電器工業科技情報站歸口單位。同年，我國家電行業第一本行業期刊《家用電器》創刊。1996年，根據中國輕工總會輕總息［1996］11號文件，全國家用電器工業科技情報站更名為全國家用電器工業信息中心，成為中國輕工業信息中心所屬33個全國輕工行業信息中心之一，并設置在中國家用電器研究院。

2.2.2 花生GPAT9基因對油脂合成的影響 一些研究表明花生AhGPAT9在種子發育時期的表達量變化與油脂合成或積累關系密切。華方靜等分析了10 個花生品種種子的含油量及AhGPAT9在這些品種種子發育過程中的表達特性，發現AhGPAT9的相對表達量與品種含油量存在一定的相關性。Krapt. st. 16 種子含油量高達55.80%，AhGPAT9在油分積累的主要時期的表達量亦較高；相反，在含油量較低（47.32%）的特21 品種中，AhGPAT9在油分積累的主要時期表達量較低。這些結果表明Ah-GPAT9在花生種子油脂積累過程中起著重要的作用[42]。另外，Lv 等對AhGPAT9基因在花生不同組織的表達模式進行了分析，發現AhGPAT9基因在發育種子中表達量高，在42 DAP 時達到峰值，這與花生籽粒的油脂積累速率一致[45]。為了進一步明確AhGPAT9在花生種子油脂積累過程中的功能，Lv 等對AhGPAT9基因在花生中進行過表達和反義表達，發現T3過表達株系種子平均含油量達54.24%，比野生型增加4.75%，但T3反義表達株系的含油量卻降至45.80%，比野生型下降3.69%。這些結果表明AhGPAT9基因在花生種子油脂合成過程中起著關鍵作用[45]。

另有研究調查了花生AhGPAT3和AhGPAT5基因與種子油脂合成的關系。郝翠翠等分析了AhGPAT3和AhGPAT5基因在花生種子不同發育時期的表達特性，發現AhGPAT3和AhGPAT5基因在花生發育初期比較活躍[46]。但是這兩個基因是否在花生種子油脂合成過程中發揮某種作用并不清楚。

2.2.3 其他油料作物中GPAT9基因對油脂合成的影響 除油菜和花生外，一些研究還分析了向日葵和大豆等油料作物中GPAT基因與種子油脂合成的關系。Payá-Milans 等分析了向日葵HaGPAT9-1和HaGPAT9-2基因在發育種子和營養組織中的表達量，發現HaGPAT9-1在種子TAG開始積累時強烈表達，種子灌漿過程中HaGPAT9-1的表達模式與油脂積累速率相一致。相反，HaGPAT9-2基因在營養組織中強烈表達。雖然HaGPAT9-2在種子發育早期和中期短暫表達，但與HaGPAT9-1相比，前者表達弱。這些結果表明HaGPAT9-1可能與向日葵種子的油脂積累有關[47]。不過，目前缺乏對HaGPAT9-1生化特性的了解，其在向日葵種子油脂合成中的真實功能并不清楚。

目前有關大豆GPAT基因的研究報道很少。陳錦玲等運用RNA-Seq 分析了大豆（Glycine max）籽粒不同發育時期的基因表達變化，篩選獲得8 個與大豆油脂合成相關的候選基因，其中某些GPAT基因在大豆籽粒發育期間（20～50 d）表達量持續上升，與大豆籽粒油脂積累相符[56]。不過，其在大豆油脂合成中的真實功能尚不知曉。

綜上，目前有關GPAT基因在油料作物種子油脂合成過程中的功能研究，大多局限于基因表達量與含油量的關聯分析，而大部分GPAT 酶在這一過程中的生化特性并不清楚，因此，人們并不明確GPAT基因對油脂合成的影響究竟是直接效應還是間接效應。導致這一現象的一個主要原因是很多實驗室缺乏鑒定GPAT 酶的有效方法。因此，我們將在下文介紹目前GPAT 酶分析方法的研究進展，以期為農作物GPAT基因的功能研究提供參考。

3 GPAT 的酶活性測定及其基因的鑒定

3.1 體外酶學測定法

GPAT催化的脂?；磻?，將3-磷酸甘油（Glycerol-3-Phosphate，G-3-P）轉 化 為 溶 血 磷 脂 酸（LPA）。因待測的蛋白提取液中常同時含有GPAT和LPAT，生成的LPA 可進一步轉化為PA。因此，GPAT 的體外酶學測定法通常是測定源于G-3-P 的LPA 與PA 兩者的總形成量，并以此計算GPAT 酶的活性。目前常用的GPAT 體外活性測定法包括同位素標記測定法和熒光偶聯酶學測定法。

3.1.1 同位素標記測定法 目前，在GPAT 酶的體外活性測定中，常以放射性14C 或32P 同位素標記的G-3-P 為底物[21,57,58]。反應液中生成的同位素標記的LPA 和PA 產物經薄層層析法（TLC）[21]或高效液相色譜法（HPLC）[59,60]分離后，可用液體閃爍計數儀測定其總形成量（圖2）。例如，Zheng 和Zou 利用14C同位素標記的底物測定了酵母Gat1p 和Gat2p 的酶活性。在含Tris-HCl、DTT 與MgCl2的緩沖液中加入棕櫚?；?CoA 和14C 標記的G-3-P，混合均勻后加入含GPAT 酶的酵母提取液；室溫反應一定時間后，加入1%HClO4終止反應；再用氯仿-甲醇萃取，汲取下層含反應產物的有機相，并用1%HClO4洗滌有機相，最后將含14C 標記產物的有機相在氮氣下吹干。一部分產物可直接用于放射性閃爍計數，另一部分用于TLC 分析，在特定展開劑系統，LPA 和PA 的Rf值相差很大，同位素掃描儀可直接對TLC 板上的分離物質進行掃描[21]。另外，Zheng等為了鑒定擬南芥GPAT基因的功能，在酵母gat1突變體中表達AtGPAT基因，利用同樣方法測定了酵母蛋白提取液中的GPAT 活性，發現5 個AtGPAT基因具有GPAT 酶活性[20]。

圖2 利用放射性同位素標記3-磷酸甘油底物測定GPAT酶活性Fig.2 Determination of GPAT enzyme activity with glycerol-3-phosphate substrate labeled with radioisotope

同位素標記分析法直接對標記產物進行測定，具有靈敏度高的特點。這種方法可有效地測定GPAT 酶對3-磷酸甘油底物的專一性及對脂?；w的偏好性[21]。但由于同位素的使用限制，該方法對大多數實驗室而言并不適用（表1）。另外，植物中的膜結合GPAT 酶，其活性受膜脂組分的影響，因而體外酶學分析結果受反應條件的影響較大，這在一定程度上限制了數據的可比性。

表1 GPAT的酶活性測定及其基因的遺傳互補法鑒定Table 1 Measurement of GPAT enzyme activities and identification of the genes by genetic complementation

3.1.2 熒光偶聯酶學測定法 Morita 等人建立了一種熒光偶聯酶學測定法（表1），用于分析細胞中產生的PA。該方法將脂質提取物溶解于含有Triton X-100（非離子表面活性劑）的反應液中，在特定細菌脂肪酶（對PA 底物高度專一）的作用下，將PA分子中的脂肪酸基團解離出來，使PA 轉化為G-3-P。隨后，在G-3-P 氧化酶的作用下，G-3-P 被氧化，產生過氧化氫。過氧化氫與Amplex Red 反應生成高熒光產物試鹵靈（Resorufin），其熒光強度可用熒光酶標儀測定[61]。

Hassaninasab 等人在測定酵母細胞PA 含量過程中，對上述方法進行了改進[62]。他們發現，在Morita 等人開發的熒光偶聯酶學測定法中[61]，因使用了活性氧含量較高的Triton X-100 以及受脂肪酶未完全熱滅活的影響，反應液中的背景熒光值很高，導致信噪比嚴重下降。相反，當使用高純度的Triton X-100，并結合脂肪酶的充分熱滅活，其信噪比大幅提高[62]。

熒光偶聯酶學測定法具有較高的分析靈敏度，但該方法將產物PA重新水解生成底物G-3-P，步驟較為繁瑣，操作不簡便。在反應液中，除了產物LPA與PA 外，常含其他磷脂，因此分析的可靠性取決于不同來源的細菌脂肪酶的底物專一性。該酶的價格普遍很高，因此制約了熒光偶聯酶學測定法的廣泛使用（表1）。

3.2 遺傳互補法

除了位于質體的GPAT酶，其它已知GPAT酶屬于膜結合蛋白，不易分離純化，且其體外重構十分困難[21]，這在一定程度上限制了GPAT 酶的體外分析。遺傳互補法，作為一種體內酶學分析方法，具有簡便易行的優點，可以通過觀察目的基因的導入對生物體特定生理缺陷的恢復狀況，直觀地評估酶的功能。下面綜述細菌遺傳互補法和酵母遺傳互補法用于GPAT基因鑒定的研究進展。

3.2.1 細菌的遺傳互補 大腸桿菌中，GPAT 酶是由PlsB基因編碼的膜嵌合蛋白[63～65]，該基因已被克隆[64]。在BB26-36 菌株中PlsB基因發生了突變，導致該酶對G-3-P 底物的親和力下降。在不添加甘油或G-3-P 的培養基中，它不能正常生長，因此它屬于甘油或G-3-P 營養缺陷型突變體[58,66]。利用這一生長特性，人們已建立了一種基于BB26-36 菌株的細菌遺傳互補法，可用于鑒定GPAT基因（表1）。

BB26-36 菌株屬于革蘭氏陰性菌，在這類細菌細胞中，acyl-ACP 是?；磻械闹饕；w，由細菌Ⅱ型脂肪酸合成酶FASII（Type II fatty acid synthase）產生。當在培養基中添加甘油時，甘油可以被細菌快速吸收，并在甘油激酶作用下快速地轉變為G-3-P，成為?；磻械闹；荏w。PlsB 和PlsC 以acyl-ACP 為 脂 酰 基 供 體，分 別 催 化G-3-P 的第一步與第二步?；磻?，生成LPA 與PA[67]（圖3）。不過，一些細菌?；D移酶也可以利用脂?；?CoA 作為底物，它由?；?CoA 合成酶（FadD）產生[68]。

圖3 大腸桿菌plsB 突變體（BB26-36）的甘油營養缺陷型特性Fig.3 Glycerol auxotrophy of the plsB strain of Escherichia coli（BB26-36）

利用上述細菌遺傳互補法，Lewin 等分析了?；D移酶的保守氨基酸殘基對GPAT 酶活性的影響[57]。根據不同?；D移酶的氨基酸序列的相似性[69～72]，Lewin 等對?；D移酶四個保守區域的氨基酸序列進行了定點誘變，并將發生氨基酸替換的PlsB 編碼基因導入到BB26-36 菌株中；通過檢測不同突變基因恢復BB26-36 在甘油營養缺乏條件下的生長能力，評估高度保守區域的氨基酸殘基對GPAT 活性的調控作用[57]。研究發現，保守區I 的組氨酸和天冬氨酸、保守區III 的甘氨酸和保守區IV的脯氨酸在GPAT 催化中發揮重要作用，而保守區II 的苯丙氨酸和精氨酸以及保守區III 的谷氨酸和絲氨酸似乎對甘油3-磷酸底物的結合很重要[57]。

上述細菌遺傳互補法被證明可有效用于原核生物中GPAT基因的功能分析[57,58,73]。然而，另有一些研究表明，該法存在某些局限性，真核生物中的一些GPAT基因的異源表達無法彌補BB26-36 的生長缺陷（表1）。一個可能原因是，真核生物中的膜結合GPAT 酶優先使用脂?；?CoA 作為脂?；w，而在BB26-36 細胞中，?；?ACP 是主要的脂?；w，它可能不是真核生物中的膜結合GPAT 酶的適用底物[16,67,73,74]。

3.2.2 酵母的遺傳互補 作為細胞中最基本的代謝過程，甘油脂合成在低等與高等真核生物之間存在較高的保守性，因此基于酵母突變體的遺傳互補技術已被廣泛用來鑒定高等真核生物中參與甘油脂代謝的基因[8,67,75]。建立一個實用的酵母遺傳互補體系的主要挑戰是構建一種具有特定生長缺陷的突變株，這種生長缺陷只有在特定的目標基因導入的情況下才得以消除。Zheng 和Zou 發現，Gat1p和Gat2p是釀酒酵母中兩個最主要的GPAT酶，同時敲除兩者的編碼基因GAT1和GAT2會導致酵母喪失生長能力[21]。這一特性允許人們構建條件致死型gat1Δgat2Δ 酵母雙突變體（圖4），理論上，只有當導入編碼具有GPAT 酶活性的基因時，這種突變體才能恢復其在特定條件下的生長能力。

圖4 四分體分析顯示GAT1和GAT2基因雙敲除能使酵母細胞喪失生長能力[21]Fig.4 Simultaneous knockout of GAT1 and GAT2 genes renders yeast cells unable to grow as revealed by tetrad analysis

Zaremberg 等以W303 酵母菌株為遺傳材料，構建了一個名為CMY228的條件致死型gat1Δgat2Δ酵母 雙 突 變 體，其 基 因 型 為（W303，gat1Δgat2Δ+[pGAL1::GAT1 URA3]），該菌株攜帶的質粒含GAL1啟動子驅動的GAT1基因（源于酵母自身的基因）以及URA3選擇標記，GAL1啟動子受半乳糖誘導，葡萄糖抑制[77]?；贑MY228 的酵母遺傳互補體系曾被用于鑒定惡性瘧原蟲中編碼內質網GPAT 的基因[78]。同時，我們亦構建了一個以BY4742 為遺傳背景的gat1Δgat2Δ 酵 母 雙 突 變 體 菌 株，名 為NIU8（BY7472，gat1Δgat2Δ+[pGAL1::GAT1 URA3]），其攜帶的質粒與CMY228 中的一樣[79]。猶如CMY228，NIU8 菌株的生長完全依賴于該質粒的存在，換言之，GAL1啟動子驅動的GAT1基因的表達是這兩個突變體生長所必需的[79]。然而我們發現，NIU8 不但能在以半乳糖為碳源的培養基中生長，而且在葡萄糖存在的條件下，該菌株仍能生長。我們推測，在受葡萄糖抑制條件下，GAT1基因的泄漏表達可能足以產生足夠高的GPAT活性來維持gat1Δgat2Δ雙突變體的生長，這可能與GAT1基因編碼的GPAT 酶在酵母自身環境中具有很高活性有關[79]。在這種情況下，目標基因的篩選會出現假陽性現象[79]（表1）。

多數情況下，酶在其自然細胞環境中具有較高的催化活性，而在異源細胞系統中其活性往往較低。于是，當一個外源編碼GPAT 的基因與酵母自身GAT1基因的表達水平相同時，前者常會產生較低的GPAT 活性[20,21]。因此，Lei等假設，解決上述假陽性問題的一種途徑是，用一個異源GPAT基因替換質粒中所含的酵母自身GAT1基因。當該質粒導入gat1Δgat2Δ 雙突變體時，異源GPAT基因在葡萄糖抑制條件下的泄漏表達不能產生足夠高的GPAT活性用以彌補突變體的生長缺陷[79]。我們稱這種策略為“產能過剩消除策略”（the Eradication of Excess Capacity strategy）[79]?；谶@種假設，Lei 等在NIU8菌株的基礎上，構建了一個新的gat1Δgat2Δ 雙突變體菌株，名為ZAFU1（BY4742,gat1Δgat2Δ+[pGAL1::AtGPAT1 LEU2]），其中所含的質粒攜帶一個受半乳糖誘導的啟動子（GAL1）控制的擬南芥GPAT1基因及LEU2選擇基因[79]（圖5）。我們反復試驗證明，ZAFU1 菌株能在含有半乳糖的培養基中正常生長，而在葡萄糖的培養基中，即使延長生長時間至幾個月，菌株仍未出現任何生長跡象，因此有理由相信，基于ZAFU1 的遺傳互補體系出現假陽性的頻率會非常地低（表1）。

圖5 攜帶擬南芥AtGPAT1的條件致死型gat1Δ gat2Δ雙突變體酵母的構建流程Fig.5 A schematic diagram for construction of a conditional lethal gat1Δ gat2Δ double mutant of Saccharomyces cerevisiae carrying Arabidopsis AtGPAT1

在此基礎上，Lei 等構建了適用于ZAFU1 遺傳互補體系的pYES2-Kan-yADH1 穿梭載體，該質粒攜帶一個受葡萄糖誘導的酵母ADH1啟動子及一個與之相鄰的多克隆位點DNA 片段，后者作為候選基因的插入位點[79]。Lei 等研究顯示，當含已知GPAT基因的pYES2-Kan-yADH1質粒導入ZAFU1突變體時，該菌株能在葡萄糖培養基中恢復生長；相反，編碼其它脂類合成相關酶基因不能恢復ZAFU1 在葡萄糖培養基中的生長能力。這些結果表明該酵母遺傳互補體系對GPAT基因的鑒定具有很高的專一性[79]。若目的基因在葡萄糖誘導條件下的表達能夠恢復ZAFU1 的生長，則可以推斷該目的基因編碼的蛋白具有類似酵母G-3-P ?；D移酶的功能。Lei等利用該遺傳互補體系對擬南芥GPAT基因家族8位成員進行了鑒定，結果顯示在葡萄糖培養基中At-GPAT1、GPAT5或AtGPAT7的導入能使ZAFU1 菌株不同程度地恢復生長，但AtGPAT2、AtGPAT3、AtGPAT4、AtGPAT6或AtGPAT8的表達未能彌補其生長缺陷[79]。這一結果與GPATs的體外酶學分析結果相一致，AtGPAT1、AtGPAT5 與AtGPAT7 只具有將G-3-P 轉化為LPA 的?；D移酶活性，而AtGPAT4、AtGPAT6 與AtGPAT8 兼具?；D移酶與磷脂酶的活性，能將G-3-P經LPA中間產物轉化為MAG[27,31]。

由于外源GPAT基因在酵母中的表達產物活性較低，于是ZAFU1 的生長速率受到該基因在葡萄糖誘導下的表達水平的影響很大。為了提高ZAFU1菌株的生長速率及與此相關的目的基因篩選效率，陳丹丹等用長片段酵母ADH1啟動子替換pYES2-Kan-yADH1 質粒中所含的短片段酵母ADH1啟動子，使目的基因在葡萄糖誘導條件下的表達水平得到增強，從而進一步優化了基于ZAFU1 的酵母遺傳互補篩選體系[80]。該優化后的篩選體系已被用于油菜和花生等作物的GPAT 編碼基因的鑒定[55,81]。段芊芊等鑒定了甘藍型油菜中的13 個候選GPAT基因，發 現BnGPAT1-1、BnGPAT4-1、BnGPAT4-2和BnGPAT9-1基因的異源表達能恢復ZAFU1 在葡萄糖培養基中的生長，表明這些基因具有類似酵母?；D移酶編碼基因GAT1或GAT2的功能[55]。姜竹等利用該遺傳互補體系對栽培花生中的13 個候選GPAT基因進行了鑒定，發現AhGPAT5B和AhGPAT7A/B具有類似酵母?；D移酶編碼基因GAT1或GAT2的功能[81]。這些研究結果有助于深入了解作物甘油脂合成的分子調控機制。

值得指出的是，盡管酵母和植物之間在PA 生物合成途徑中存在較高的保守性，但因植物細胞比酵母具有更復雜的遺傳互作關系，通過酵母遺傳互補鑒定獲得的植物GPAT基因，需要進一步在植物體內進行功能驗證，以更加全面地了解其在植物體內的真實功能。

4 展望

油料植物不僅是食用油的主要來源，而且是可持續地生產生物能源和化工原料的潛在工廠[82]。如何有效地提高可適用于不同用途的植物油脂的生產，已成為生物技術領域一個迅速增長的研究熱點。在過去的幾十年里，人們對甘油脂的生物合成有了較為深入的了解，但是這一代謝途徑中仍存在某些未知因子。譬如，對脂肪酸組裝體系的了解尚不完善，下列問題有待解決：（i）油料植物中TAG 合成的初始反應和第二步甘油?；磻烤故怯赡男┗蚓幋a的酶直接控制的；（ii）極性和中性甘油脂的合成前體是否分別由不同的脂肪酸組裝體系控制。這些關鍵科學問題的存在致使人們仍難以有效地操控甘油脂的生物合成，從而制約油料作物的生產。

目前，通過提高已知GPAT基因在油料植物種子中的表達量以大幅增加種子含油量，并未獲得很大成功[39,40]，對這種現象至少有兩種不同的解釋。其一，這些已知GPAT 編碼基因可能并不直接參與油脂合成，這種觀點得到下面證據的支持，即對含油量不同的物種進行全基因組的表達譜比較分析顯示，已知GPAT和LPAT基因的表達水平在這些物種之間沒有明顯差異[83,84]。我們推測，油料植物中或許存在某些新的?；D移酶和由之介導的TAG合成途徑，這是因為模式植物擬南芥基因組中仍有多個功能并不完全清楚的基因，其編碼的蛋白質含有保守的脂肪?；D移酶特征序列。其二，雖然目前尚無證據表明植物中含有類似于酵母和哺乳動物中存在的磷酸二羥丙酮（DHAP）途徑（圖1），但是植物中是否存在類似合成途徑，尚不清楚。在DHAP 途徑中，甘油脂合成的初始反應是由DHAP?；D移酶（DHAPAT）催化的[21]。因此，將來有必要開展下列研究：（i）調查那些未知的含保守?；D移酶特征序列的擬南芥蛋白是否具有GPAT 和LPAT 的功能，并調查其在甘油脂合成中的作用；（ii）探究油料植物中是否存在一類不含有已知?；D移酶特征序列的新型?；D移酶；（iii）探究植物中是否存在未知的TAG 合成途徑。這些研究將有助于我們深入了解甘油脂合成前體的來源，從而為有效提高油料作物種子含油量以及改造油的組分使之適應各種不同的用途提供理論基礎。

另外，本文分析了GPAT 酶的體外與體內測定方法，并重點綜述了酵母遺傳互補法的建立與應用。我們認為，對大多數實驗室而言，酵母遺傳互補法是一種有效且簡便的GPAT 鑒定方法，可快速用于植物GPAT 編碼基因的鑒定與結構優化。隨著大規?；蚪M測序的不斷發展，越來越多的序列被注釋為候選?；D移酶基因，但迄今已鑒定的大多數膜結合的GPATs 與LPATs 共享四個?；D移酶的保守結構域[57]，運用生物信息學工具難以有效區分這些序列究竟編碼哪種類型的?；D移酶，因而在不同物種中克隆的這些?；D移酶基因的生化功能不清楚?；跅l件致死型gat1Δgat2Δ雙突變體的酵母遺傳互補法可使GPATs 的酶學功能鑒定與結構優化工作變得簡便易行，它可直觀地根據酵母細胞生長速度來評估異源表達產物GPAT 的酶活性大小。因而，上述酵母遺傳互補法的推廣與應用將有助于促進農作物GPAT基因的克隆與功能研究以及油料作物的脂類代謝研究。