羥基紅花黃色素A調控miR-20a-5p/TLR4軸抑制人類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞凋亡和炎性因子的表達

胡倩 趙嘉英 嚴宏莉

類風濕關節炎是一種慢性炎癥性疾病，其主要病理特征表現為滑膜細胞增殖、炎性細胞浸潤及關節軟骨破壞等[1]。類風濕關節炎滑膜組織中的成纖維樣滑膜細胞是滑膜炎性增生的主要效應細胞，在類風濕關節炎的發生發展中起重要作用[2]。研究顯示，抑制類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞增生和炎性反應可有效阻礙滑膜炎癥及增生，延緩類風濕關節炎的發展進程。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是中藥紅花的主要活性成分之一，具有抗炎、鎮痛和抗腫瘤等功效[3-5]。研究顯示，羥基紅花黃色素A可能通過抑制Notch信號通路減少骨關節炎大鼠體內TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的表達，減輕軟骨損傷[6]；羥基紅花黃色素A可減輕H2O2誘導的血管內皮細胞氧化應激損傷[7]。然而，羥基紅花黃色素A能否影響類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞損傷還未知。研究顯示，miR-20a-5p在糖尿病性心肌病(DCM)大鼠心肌組織和高糖誘導的心肌細胞H9C2中表達降低，上調miR-20a-5p可改善DCM大鼠心臟功能，減少心肌細胞凋亡，并抑制心肌細胞炎性反應，miR-20a-5p有可能成為DCM治療的分子靶點[8]；miR-20a-5p在卵白蛋白(OVA)誘發的哮喘小鼠肺組織中呈低表達，過表達miR-20a-5p可通過靶向抑制ATG7表達減少哮喘小鼠肺組織細胞凋亡及炎性反應[9]。然而，miR-20a-5p在類風濕關節炎發生發展中的作用還未知。Starbase靶基因在線軟件預測顯示，Toll樣受體4(TLR4)可能是miR-20a-5p的靶基因[10]。因此，本研究建立TNF-α誘導的成纖維樣滑膜細胞MH7A損傷模型，以miR-20a-5p/TLR4為切入點，主要探究了羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的MH7A細胞凋亡和炎性因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 MH7A 細胞系，上海通派生物科技有限公司；HSYA，純度>98%，上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養液、CCK-8試劑盒、雙熒光素酶活性檢測試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒，北京索萊寶；LipofectamineTM 2000試劑盒，美國Invitrogen公司；miR-20a-5p模擬物(mimics)、模擬對照序列(miR-NC)、miR-20a-5p抑制劑(anti-miR-20a-5p)和陰性對照序列(anti-miR-NC)，上海吉瑪制藥技術；胎牛血清，杭州四季青；兔抗人TLR4和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體，美國Santa Cruz公司；miRNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染:在超凈工作臺內將MH7A 細胞復蘇，加含10% 胎牛血清的DMEM培養液，置于培養箱中培養。細胞生長密度至90%時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養。將對數期MH7A細胞接種至6孔板中(2.5×105個/孔)，培養12 h后，棄培養基。用LipofectamineTM 2000脂質體法，分別將miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC轉染至MH7A細胞。轉染6 h后，棄培養液，重新加含10% 胎牛血清的DMEM培養液。再培養24 h，RT-qPCR檢測細胞中miR-20a-5p表達驗證轉染效果，并收集細胞用于后續實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖:將MH7A細胞及轉染miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC的MH7A 細胞均接種至96孔板中(2.5×104個/孔)，培養4 h后，棄培養液，分組處理。MH7A細胞分為對照組、TNF-α組、不同劑量(0.1、1.0、10 μmol/L)HSYA+TNF-α組，其中對照組細胞用常規培養液培養24 h，TNF-α組細胞用含10 ng/ml[1]TNF-α的培養液培養24 h，不同劑量(0.1、1.0、10 μmol/L)HSYA+TNF-α組細胞分別用含0.1、1.0、10 μmol/L[7]HSYA與10 ng/ml TNF-α的培養液培養24 h。轉染miR-20a-5p mimics、miR-NC的MH7A 細胞處理同TNF-α組，并分別記為miR-20a-5p+TNF-α組、miR-NC+TNF-α組。轉染anti-miR-20a-5p、anti-miR-NC的MH7A 細胞處理同10 μmol/L HSYA+TNF-α組，并分別記為anti-miR-NC+10 μmol/L HSYA+TNF-α組、anti-miR-20a-5p+10 μmol/L HSYA+TNF-α。各組細胞培養結束后，每孔加10 μl CCK-8。孵育2 h后，酶標儀(λ=450 nm)測各孔光密度(OD)值。OD值越小，說明細胞增殖活性越弱。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡:將MH7A細胞及轉染miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC的MH7A 細胞均接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養4 h后，棄培養液，分組處理，方法同1.2.2。各組細胞培養結束后，棄培養液，收集各組細胞，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次。利用Annexin?V-FITC/PI試劑盒，上流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。細胞凋亡率(%)=(早期凋亡數+晚期凋亡數)/總細胞數×100%。

1.2.4 酶聯免疫法檢測細胞培養上清中IL-1β和IL-6表達:將MH7A細胞及轉染miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC的MH7A 細胞均接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養4 h后，棄培養液，分組處理，方法同1.2.2。各組細胞培養結束后，收集細胞培養上清液，離心(3 500 r/min、5 min)后，取上清，分別利用IL-1β和IL-6試劑盒檢測上清中IL-1β和IL-6水平。

1.2.5 RT-qPCR檢測細胞中miR-20a-5p表達:將MH7A 細胞及轉染miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC的MH7A 細胞均接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養4 h后，棄培養液，分組處理，方法同1.2.2。培養24 h后，收集各組細胞，并用PBS清洗2次。然后用miRNA抽提試劑盒提取細胞中總RNA，經逆轉錄后，行PCR擴增。引物序列：miR-20a-5p上游5’-TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3’，下游5’-GGTACGATAGCGATCGAAG-3’；U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。2-△△Ct法計算miR-20a-5p相對于U6的表達量。

1.2.6 蛋白質印跡法檢測TLR4蛋白表達:將MH7A 細胞及轉染miR-20a-5p mimics、miR-NC、anti-miR-20a-5p和anti-miR-NC的MH7A 細胞均接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養4 h后，棄培養液，分組處理，方法同1.2.2。培養24 h后，收集各組細胞，并用PBS清洗2次。然后用RIPA試劑提取細胞中總蛋白，經BCA法定量、電泳、轉膜及封閉后，分別用TLR4(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)一抗4℃孵育過夜。洗膜后，再用山羊抗兔二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h。加顯影液避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析TLR4相對于GAPDH的表達量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗:由上海吉瑪制藥技術公司根據Starbase靶基因在線軟件預測顯示的miR-20a-5p與TLR4的結合位點進行PCR擴增后，插入pmirGLO雙熒光素酶，構建TLR4野生型載體(WT-TLR4)，同時將結合位點進行突變，擴增后插入pmirGLO雙熒光素酶，構建TLR4突變型載體(MUT-TLR4)。將MH7A 細胞接種至6孔板中(2.5×105個/孔)，培養12 h后，棄培養液。用LipofectamineTM 2000脂質體法，分別共轉染WT-TLR4與miR-20a-5p mimics、WT-TLR4與miR-NC、MUT-TLR4與miR-20a-5p mimics、或MUT-TLR4與miR-NC至MH7A 細胞。轉染6 h后，棄培養液，重新加含10% 胎牛血清的DMEM培養液。再培養24 h，收集各組細胞。加裂解液將各組細胞充分裂解，離心(3 500 r/min、10 min)后，取上清，檢測熒光素酶活性，結果以螢火蟲與海腎的熒光強度比值表示。

2 結果

2.1 羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的MH7A細胞增殖活性及凋亡的影響 與對照組比較，MH7A細胞經10 ng/ml TNF-α刺激24 h后，細胞增殖活性降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)；而羥基紅花黃色素A可增強TNF-α誘導的MH7A細胞增殖活性(P<0.05)，并降低細胞凋亡率(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖1、表1。

表1 HSYA對TNF-α誘導的MH7A細胞增殖活性和凋亡的影響

圖1 HSYA干預的TNF-α誘導的MH7A細胞凋亡

2.2 羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的MH7A細胞炎性因子表達的影響 與對照組比較，MH7A細胞經10 ng/ml TNF-α刺激24 h后，細胞培養上清液中IL-1β和IL-6表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；而羥基紅花黃色素A干預后，TNF-α誘導的MH7A細胞培養上清液中IL-1β和IL-6表達水平降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 HSYA對TNF-α誘導的MH7A細胞炎性因子表達的影響

2.3 羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的MH7A細胞中miR-20a-5p和TLR4表達的影響 與對照組比較，MH7A細胞經10 ng/ml TNF-α刺激24 h后，細胞中miR-20a-5p表達降低(P<0.05)，TLR4蛋白表達升高(P<0.05)；而羥基紅花黃色素A干預后，TNF-α誘導的MH7A細胞中miR-20a-5p表達升高(P<0.05)，而TLR4蛋白表達降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖2、表3。

表3 HSYA對TNF-α誘導的MH7A細胞中miR-20a-5p和TLR4表達的影響

圖2 HSYA干預的TNF-α誘導的MH7A細胞中TLR4蛋白表達

2.4 上調miR-20a-5p對TNF-α誘導的MH7A細胞增殖活性、凋亡及炎性因子表達的影響 轉染miR-20a-5p mimics的MH7A細胞中miR-20a-5p表達明顯高于轉染miR-NC的MH7A細胞及對照組MH7A細胞(F=665.214，P<0.05)，而轉染miR-NC的MH7A細胞與對照組MH7A細胞中miR-20a-5p表達比較差異無統計學意義(t=1.342，P>0.05)，表明上調miR-20a-5p表達的MH7A細胞構建成功。與TNF-α組或miR-NC+TNF-α組比較，miR-20a-5p+TNF-α組MH7A細胞增殖活性升高，而凋亡率及細胞培養上清液中IL-1β和IL-6表達水平降低(P<0.05)，而TNF-α組與miR-NC+TNF-α組各檢測指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖3，表4。

圖3 TNF-α誘導的上調miR-20a-5p的MH7A細胞凋亡

表4 上調miR-20a-5p對TNF-α誘導的MH7A細胞增殖活性、凋亡和炎性因子表達的影響

2.5 miR-20a-5p靶向負調控TLR4 Starbase靶基因軟件預測顯示的miR-20a-5p與TLR4的結合位點。雙熒光素酶報告基因結果顯示，共轉染miR-20a-5p mimics與WT-TLR4的MH7A細胞熒光素酶活性顯著低于共轉染miR-NC與WT-TLR4的MH7A細胞，而共轉染miR-20a-5p mimics與MUT-TLR4的MH7A細胞熒光素酶活性與共轉染miR-NC與MUT-TLR4的MH7A細胞比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明TLR4是miR-20a-5p的靶基因。同時，轉染miR-20a-5p mimics的MH7A細胞中TLR4蛋白表達明顯低于轉染miR-NC的MH7A細胞及對照組MH7A細胞(P<0.05)。見圖4，表5，6。

圖4 miR-20a-5p靶向調控TLR4;A miR-20a-5p與TLR4的結合位點；B miR-20a-5p與WT-TLR4共轉染后的細胞熒

表5 雙熒光素酶活性檢測結果

表6 上調miR-20a-5p對MH7A細胞中TLR4蛋白表達的影響

2.6 下調miR-20a-5p降低羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的MH7A細胞增殖活性、凋亡及炎性因子表達的影響 轉染anti-miR-20a-5p 的MH7A細胞中miR-20a-5p表達明顯低于轉染anti-miR-NC的MH7A細胞(t=107.331，P<0.05)，表明下調miR-20a-5p表達的MH7A細胞構建成功。與10 μmol/L H-HSYA+TNF-α組或anti-miR-NC+10 μmol/L H-HSYA+TNF-α組比較，anti-miR-20a-5p+10 μmol/L H-HSYA+TNF-α組MH7A細胞增殖活性降低，而凋亡率、細胞培養上清液中IL-1β和IL-6表達及細胞中TLR4蛋白光素酶活性降低；C 上調miR-20a-5p抑制細胞中TLR4蛋白表達升高(P<0.05)，而10 μmol/L H-HSYA+TNF-α組與anti-miR-NC+H-HSYA+TNF-α組各檢測指標比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖5，表7。

圖5 下調miR-20a-5p降低HSYA對TNF-α誘導的MH7A細胞凋亡及TLR4蛋白表達的影響;A 下調miR-20a-5p降低HSYA對TNF-α誘導的MH7A細胞凋亡的影響；B 下調miR-20a-5p降低HSYA對TNF-α誘導的MH7A細胞中TLR4蛋白表達的影響

表7 下調miR-20a-5p降低HSYA對TNF-α誘導的MH7A細胞增殖活性、凋亡及炎性因子表達的影響

3 討論

滑膜細胞在炎性因子的刺激下，增殖能力明顯增強，且釋放多種炎性因子，在類風濕關節炎的發生發展中起關鍵作用[11]。TNF-α是一種促炎因子，可引起成纖維樣滑膜細胞炎性損傷，促進風濕關節炎的發展進程[12]。MH7A細胞來自于類風濕關節炎患者的成纖維樣滑膜細胞，增殖速度較快，且可多次傳代，是類風濕關節炎研究的常用細胞[2]。本研究利用TNF-α刺激MH7A細胞，結果顯示，MH7A細胞經TNF-α刺激24 h后，細胞增殖活性降低，凋亡數及炎性因子IL-1β和IL-6的分泌水平增加，與相關報道結果[13]一致，提示TNF-α誘導的MH7A細胞損傷模型建立成功。

近年來，中藥或其活性成分在風濕性關節炎的治療中廣受關注。作為中藥紅花的主要活性成分，羥基紅花黃色素A具有多種藥理活性。研究顯示，羥基紅花黃色素A可抑制心肌缺血再灌注損傷大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP等炎性因子的表達，對心肌缺血再灌注損傷大鼠發揮保護作用[14]；羥基紅花黃色素A可能通過下調miR-1表達降低H2O2誘導的心肌細胞H9c2活性氧(ROS)的生成和細胞凋亡率，減輕心肌細胞氧化損傷[15]。本研究將一定劑量的羥基紅花黃色素A作用于TNF-α誘導的成纖維樣滑膜細胞MH7A后，發現其可提高TNF-α誘導的MH7A細胞增殖活性，減少細胞凋亡，且呈劑量依賴性；進一步檢測發現，羥基紅花黃色素A可呈劑量依賴性抑制TNF-α誘導的MH7A細胞分泌IL-1β和IL-6炎性因子，這提示羥基紅花黃色素A可減輕TNF-α誘導的MH7A細胞炎性損傷，其可能具有治療類風濕關節炎的潛在價值。

miRNA可通過調控靶基因的表達影響細胞增殖、凋亡、氧化應激及炎性反應等生理或病理過程，參與多種疾病的發展進程[16]。研究顯示，miR-23、miR-650和miR-143-3p等多種參與調控滑膜細胞的增殖、凋亡及炎性反應，是類風濕關節炎治療的潛在分子靶點[17]。本研究首先檢測了TNF-α對MH7A細胞中miR-20a-5p表達的影響，TNF-α能夠抑制MH7A細胞中miR-20a-5p的表達，提示miR-20a-5p可能參與TNF-α誘導的MH7A細胞損傷；通過轉染miR-20a-5p模擬物至MH7A細胞，再用TNF-α刺激上調miR-20a-5p的MH7A細胞發現，細胞增殖活性增加，而凋亡數及炎性因子IL-1β和IL-6的分泌減少，這表明上調miR-20a-5p可抑制TNF-α誘導的MH7A細胞凋亡及炎性損傷，miR-20a-5p有可能成為類風濕關節炎治療的分子靶點。本研究結果還顯示，羥基紅花黃色素A可呈劑量依賴性促進TNF-α誘導的MH7A細胞中miR-20a-5p的表達，而下調miR-20a-5p降低羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的MH7A細胞凋亡及IL-1β和IL-6炎性因子的表達，提示羥基紅花黃色素A可能通過上調miR-20a-5p表達來抑制TNF-α誘導的MH7A細胞凋亡及IL-1β和IL-6炎性因子表達。

為了進一步探究羥基紅花黃色素A通過上調miR-20a-5p抑制TNF-α誘導的MH7A細胞凋亡及IL-1β和IL-6炎性因子表達的分子機制，本研究證實了TLR4是miR-20a-5p的靶基因，且上調miR-20a-5p可降低MH7A細胞中TLR4蛋白表達，說明miR-20a-5p靶向負調控TLR4。TLR4與炎性反應密切相關，其與相應配體作用后，可啟動核因子-κB(NF-κB)信號通路，調控炎癥相關基因的轉錄翻譯和表達，產生和釋放IL-6和IL-8等炎性因子，而這些炎性因子又可作用于TLR4等信號通路，進一步加劇炎性反應[18]。本研究結果顯示，羥基紅花黃色素A可抑制TNF-α誘導的MH7A細胞中TLR4蛋白表達，而下調miR-20a-5p則降低了羥基紅花黃色素A對TNF-α誘導的MH7A細胞中TLR4蛋白表達的抑制作用，進一步提示羥基紅花黃色素A可能通過上調miR-20a-5p進而抑制TLR4的表達來減少TNF-α誘導的MH7A細胞凋亡及炎性因子表達，發揮對MH7A細胞的保護作用。