不同運動方式對2型糖尿病大鼠骨骼肌Rab5蛋白及糖代謝的影響*

關東如，方 明，朱嫚子，王 克，崔 勇，柏友萍△

（1.安徽師范大學體育學院，蕪湖 241000；2.青島體育事業發展中心，山東 青島 266071；3.皖南醫學院，安徽 蕪湖 241003）

Ras相關蛋白5（Ras-related proteins 5，Rab5）因其在機體代謝的重要作用受到廣泛關注，Rab5蛋白是Rab蛋白家族的成員之一，是早期胞吞途徑中一個重要的限速成分，在骨骼肌、肝臟和心臟等多組織均有表達。相關研究表明，Rab5參與調節細胞膜上葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporte 4，GLUT4）的轉運，GLUT4是骨骼肌葡萄糖發生轉運的主要蛋白，僅位于肌肉和脂肪的胰島素敏感組織中。Rab5表達減少可能造成外周GLUT4的轉錄和翻譯能力降低，引起組織糖代謝穩態失衡，進而引起血糖升高［1］。

規律性運動可增加胰島素敏感性、提高骨骼肌質量并增強其糖脂代謝能力，改善2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者體成分及骨骼肌病理損傷［2］。骨骼肌作為運動的主要功能器官，占人體總比重40%左右，攝取和代謝機體約80%的葡萄糖，因此，深入研究骨骼肌對于揭示T2DM狀態下骨骼肌代謝紊亂尤為重要［3］。目前，有關運動是否可以通過影響骨骼肌Rab5轉錄與翻譯，進而影響骨骼肌GLUT4轉運能力及調控血漿Rab5含量，發揮對T2DM保護作用的問題目前尚不清楚。本實驗室在前期的研究中，以運動為平臺，通過建立相關實驗模型，在運動對肥胖、機體IR、糖脂代謝等方面的影響進行多方面研究，為本研究奠定良好的基礎［4，5］。因此，本研究設計持續運動、間歇負重運動兩種不同的運動方案進行動物實驗，探討其不同運動方式對2型糖尿病大鼠骨骼肌Rab5及糖代謝的影響，旨在為優選T2DM運動療法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

STZ購自美國Sigma公司；RAB5A Antibody購自美國Proteintech公司；山羊抗兔IgG HL購自美國Abcam公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；GLUT4 Polyclonal Antibody購自中國Abclonal公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國碧云天公司；GHb ELISA試劑盒購自美國研域公司；RT逆轉錄試劑盒購自德國Fermentas公司；Rab5 ELISA試劑盒購自美國研域公司；TEMED購自中國碧云天公司。

1.2 T2DM建模與分組

購自上海西普爾-必凱實驗動物有限責任公司（許可證：SCXK（滬）2018-0006）的雄性7周齡SPF級SD幼鼠。分籠飼養，自由飲食飲水。進行3 d的適應喂養，隨機選取8只為空白對照組（CR），普食喂養；其余為實驗組，高脂高糖喂養，喂養6周后，實驗組禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ，72 h后采用羅氏血糖儀（YZB-GER/5513-2014，德國）測隨機血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病建模成功。選取T2DM大鼠24只，按組間血糖無差異原則（P＞0.05）分為3組，每組8只，組別（簡寫）：糖尿病模型組（DRM）、持續運動組（DCRE）、間歇負重運動組（DWRE）。所有實驗動物的操作均符合中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》要求，獲得安徽師范大學動物保護和倫理委員會批準（2020023）。

1.3 運動方案

本次運動方案設計以本實驗室前期運動方案為基礎，針對T2DM大鼠的運動能力進行設計與實施。運動采用大鼠跑臺訓練（安徽正華，中國），進行適應性練習4 d，每天3～5次，跑臺坡度為0°，負重跑步訓練器由本實驗室自主設計（專利號：ZL 2019 2 1996838.5）。持續運動方案：前1～2周采用準備活動15 m/min（10 min）、運動20 m/min（40 min）、整理活動15 m/min（10 min），后3～8周為18 m/min（10 min）、25 m/min（40 min）、15 m/min（10 min）；間歇負重運動方案：采用1～2周負荷重量15%、3～4周為30%、5～8周為45%，運動均為15 m/min（5 min），共12組，組間休息3 min，負荷重量百分比=負重重量/大鼠體重×100%。

1.4 樣本采集與處理

末次運動結束后，每組大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3.0 ml/kg）進行麻醉，取腹主動脈血，保存于-80℃的冰箱中待測Rab5和GHb濃度；采集大鼠腓腸肌組織分裝在已滅菌的EP管中放-80℃保存，用于大鼠骨骼肌組織Rab5、GLUT4 mRNA和Rab5蛋白的測定。每組隨機留取1只大鼠施以灌注固定，用于HE染色觀察骨骼肌組織形態學變化，免疫熒光組化測定Rab5蛋白。

1.5 HE染色測骨骼肌組織形態和免疫熒光組化測骨骼肌Rab5蛋白表達

選取大鼠后腿腓腸肌組織用多聚甲醛固定、脫水、洗脫、包埋及切片（4μm）。HE染色選擇骨骼肌的切片脫蠟、洗滌及酒精梯度脫水，蘇木素-伊紅滴染，二甲苯透明處理封片，光學顯微鏡（Olympus/BX43日本）拍片。免疫熒光組化測骨骼肌Rab5蛋白表達：選擇骨骼肌切片，經過脫蠟和水化，PBS漂洗，枸櫞酸緩沖液中經不同時間高火和低火進行抗原修復，自然冷卻PBS漂洗。PBT打孔，加入熒光封閉液，敷Rab5抗體（一抗），4℃過夜，二抗孵育，PBS漂洗，滴入抗衰劑，封片，共聚焦顯微鏡（LAICA/SP8 M德國）及配套軟件進行圖像的拍攝。

1.6 實時熒光定量PCR測骨骼肌Rab5與GLUT4 mRNA表達

骨骼肌組織用液氮研磨后，分別用Trizol、氯仿、異丙醇等試劑提取組織總RNA，RNA定量后按照試劑說明書進行逆轉錄合成cDNA，進行PCR擴增，Rab5與GLUT4引物序列見表1，以熒光定量PCR儀（西安天隆/TL988 中國）檢測，β-actin為內參引物，△Ct=Ct（目的基因）-Ct（β-actin），以2-△Ct進行分析（計算相對量，結果擴大1 000倍）。

Tab.1 Primer sequences for real-time PCR

1.7 Western blot測骨骼肌Rab5蛋白表達

組織用液氮研磨后，用RIPA裂解液（RIPA∶PMSF=99∶1）冰上裂解30 min，蛋白樣品定量變形后，SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品，而后蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。滴加Rab5抗體，在4℃條件下孵育過夜，TBST清洗，每次10 min，清洗3次，敷二抗，室溫孵育1 h，ECL極超敏發光液，A∶B=1∶1，將配制的發光液滴在PVDF膜上，用凝膠成像系統成像并拍照，采用Image J灰度分析軟件進行圖像定量分析，將目的蛋白條帶的灰度值與內參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值作為蛋白表達量。

1.8 ELISA測血漿Rab5與GHb濃度

嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，結束后立即放入酶標儀中，在450 nm波長處測定各孔OD值，Rab5的線性回歸方程為y=0.018+0.034x（ng/ml），相關系數R=0.999；GHb回歸方程為y=0.008+0.001x（ng/ml），相關系數R=0.998，將方程輸入SPSS 21.0軟件中，得到相應的濃度值，再將濃度值擴大5倍得到樣本實際濃度值。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 兩種運動方式對T2DM大鼠骨骼肌病理形態的影響

CR骨骼肌細胞形態正常，肌外膜完好，肌纖維排列規則，細胞間間隙清晰，組織結構完整；與CR相比，DRM骨骼肌組織結構發生輕微改變，出現骨骼肌肌纖維面積縮小，細胞間隙增大，結締組織增多，個別細胞存在腫大，表現出病理性損傷；與DRM相比，DCRE和DWRE的骨骼肌肌纖維面積有所增加，細胞間隙變小，結締組織有所減少，骨骼肌組織形態明顯改善（圖1）。

Fig.1 Comparison of HE staining in skeletal muscle among groups（×200）

2.2 兩種運動方式對T2DM大鼠骨骼肌Rab5免疫熒光蛋白表達的影響

各組別Rab5熒光蛋白表達均位于肌細胞膜上；與CR相比，DRM熒光表達量顯著較低，亮度強度減弱，蛋白表達減少；與DRM相比，DCRE、DWRE熒光表達量增多，亮度有所增強，蛋白表達量有所提高（圖2）。

Fig.2 Comparison of Rab5 fluorescence expression in skeletal muscle among groups（×200）

2.3 兩種運動方式對T2DM大鼠骨骼肌Rab5 mRNA和蛋白表達及血漿Rab5濃度的影響

骨骼肌Rab5 mRNA表達：與CR相比，DRM顯著降低（P＜0.01）；與DRM相比，DCRE顯著增高（P＜0.01），DWRE顯著增高（P＜0.05）；DCRE高于DWRE，但無統計學差異（P＞0.05，表2）。

骨骼肌Rab5蛋白表達：與CR相比，DRM Rab5蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與DRM相比，DCRE、DWRE Rab5蛋白表達均顯著升高（P＜0.05），DCRE和DWRE之間無統計學差異（P＞0.05，表2，圖3）。

血漿Rab5濃度：與CR相比，DRM顯著升高（P＜0.01）；與DRM相比，DCRE和DWRE血漿Rab5濃度均顯著降低（P＜0.01）；DWRE血漿Rab5濃度低于DCRE，但無統計學差異（P＞0.05，表2）。

Tab.2 Comparison of the Rab5 mRNA and protein expressions in skeletal muscle，and plasma Rab5 concentration among groups（±s）

Tab.2 Comparison of the Rab5 mRNA and protein expressions in skeletal muscle，and plasma Rab5 concentration among groups（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs CR；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DRM

Group Rab5 2-Δct（n=6）Rab5（n=5）Rab5（ng/ml）（n=6）CR 173.78±45.70 1 13.109±0.97 DRM 110.88±28.84**0.86±0.05**17.584±2.13**DCRE 191.80±45.27##0.97±0.08#13.908±1.35##DWRE 161.68±27.49#0.97±0.07#13.161±1.53##

Fig.3 Comparison of Rab5 protein expression in skeletal muscle among groups（n=5）

2.4 兩種運動方式對T2DM大鼠骨骼肌GLUT4 mRNA表達和血漿GHb濃度的影響

骨骼肌GLUT4 mRNA表達：與CR相比，DRM GLUT4mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；與DRM相比，DCRE和DWRE GLUT4 mRNA表達均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），DCRE和DWRE之間無統計學差異（P＞0.05，表3）。

血漿GHb濃度：與CR相比，DRM血漿GHb濃度顯著升高（P＜0.01）；與DRM相比，DCRE和DWRE血漿GHb濃度均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；DWRE血漿GHb濃度低于DCRE，但無統計學差異（P＞0.05，表3）

Tab.3 Comparison of GLUT4 mRNA expressions in skeletal muscle among groups（±s，n=6）

Tab.3 Comparison of GLUT4 mRNA expressions in skeletal muscle among groups（±s，n=6）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs CR；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DRM

Group GLUT4 2-Δct GHb（ng/ml） CR 247.54±78.31 729.29±136.06 DRM 103.47±24.70** 1025.00±60.90**DCRE 210.81±75.69# 922.86±34.62#DWRE 225.27±82.65## 896.43±73.64##

3 討論

骨骼肌作為糖消耗的主要組織，也是T2DM高糖狀態下損害的重要靶位，深入研究其疾病狀態下病理形態對于闡明糖尿病發生發展有著重要病理意義［6］。本實驗的骨骼肌HE染色表明：T2DM大鼠骨骼肌組織結構發生輕微改變，出現骨骼肌肌纖維面積縮小，細胞間隙增大，結締組織增多，個別細胞存在腫大，表現出病理性損傷。8周的持續運動和間歇負重運動均可改善T2DM大鼠骨骼肌病理損傷，兩種運動方式之間無明顯的優劣。

T2DM骨骼肌轉錄水平和代謝組學均發現通過轉錄水平和轉錄后翻譯水平改變骨骼肌的蛋白合成而影響骨骼肌重塑、減少糖攝取，最終影響糖脂代謝和運動能力［7］。在骨骼肌中，有眾多相關蛋白影響骨骼肌對糖、脂吸收和利用，影響機體代謝進程。其中有關Ras酶超家族成員之一的Rab5蛋白對機體代謝影響的研究備受關注。它類屬GTP酶，被認為是最早參與蛋白分選和維持胞內系統穩態的成員，在骨骼肌、肝臟等代謝組織中均有表達，調控機體代謝穩態過程［8］。代謝組學及相關機制研究表明：Rab5含量下降或功能發揮異常，會影響信號的正常傳遞，導致葡萄糖利用率降低進而出現胰島素抵抗（insulin resistance，IR）；敲除骨骼肌中Rab5基因，骨骼肌感應胰島素能力減弱，出現IR和葡萄糖不耐受等代謝失衡癥狀［9］；Rab5在骨骼肌再生修復中參與調控胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）信號傳導，協調骨骼肌內胰島素敏感性和代謝活動［10，11］。因此，根據已查閱相關文獻可以證明，Rab5是骨骼肌和葡萄糖代謝的重要蛋白。

有關在T2DM骨骼肌中Rab5含量變化的研究鮮有報道，因此，在本研究免疫熒光技術觀察Rab5在骨骼肌肌細胞中定位的結果表明，活化的Rab5存在于肌細胞胞膜中，且在T2DM大鼠中，骨骼肌Rab5蛋白明顯降低，這提示高糖狀態下Rab5的含量已經發生改變。在此基礎上，本研究又通過qRTPCR及Western blot技術進行進一步實驗，其結果表明三者在一定程度上具有相似性。Rab5在T2DM大鼠骨骼肌中的蛋白表達下降，可能參與調節骨骼肌糖代謝。據報道Rab5與GLUT4關系密切，Rab5參與調控GLUT4從細胞內轉移到細胞外膜并與之相互融合的過程［12］。因此，本研究推測在T2DM中，骨骼肌Rab5含量降低可能影響GLUT4表達出現異常?；谶@一假設，本研究通過檢測大鼠骨骼肌GLUT4 mRNA表達發現：在T2DM骨骼肌中，GLUT4基因表達顯著降低。因此，該結果提示，在高糖狀態下骨骼肌Rab5含量降低可能是導致GLUT4表達量減少的重要原因，進而引起葡萄糖轉運能力出現障礙，糖代謝出現紊亂。

相關研究顯示，運動可以通過調控骨骼肌GLUT4水平，改變骨骼肌代謝能力，在該環節中，運動通過提高或抑制諸多骨骼肌中與糖代謝有關的蛋白含量成為GLUT4轉運能力增強的關鍵因素。例如，Blüher等［13］研究發現，運動可能通過磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）相關途徑提高GLUT4的表達，增強骨骼肌組織葡萄糖的攝取和利用及脂肪酸的氧化，改善IR。Sylow等［14］研究發現，GLUT4轉運水平的提高，可能是通過運動刺激小鼠Rac1水平升高從而增強骨骼肌對葡萄糖的攝取。張新霞［15］采用運動療法后發現，T2DM大鼠骨骼肌GLUT4 mRNA和蛋白表達水平升高，這可能是通過抑制FOXO1實現對T2DM大鼠體內炎癥反應的緩解。在本實驗中，通過8周持續運動和間歇負重運動均提高T2DM大鼠骨骼肌Rab5基因及蛋白表達，同時也可提高骨骼肌GLUT4 mRNA表達。該結果表明，Rab5可能是不同運動方式提高骨骼肌GLUT4含量的關鍵蛋白。

為了進一步驗證運動提高Rab5蛋白表達并增強GLUT4轉運能力對機體血糖水平的影響。本研究選取糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin A1c，GHb）作為機體血糖水平指標，GHb短期變異性較低，不受降糖藥物、空腹、抽血時間等影響，可反映2～3個月的血漿葡萄糖平均水平，被視為臨床評估血糖控制的“金標準”，對及時了解糖尿病患者血脂及血糖水平有著重要價值［16，17］。本實驗中，T2DM大鼠血漿GHb濃度明顯增加，而在8周持續運動和間歇負重運動中均明顯減少血漿GHb濃度，說明持續運動與間歇負重運動均能降低機體的高血糖水平，但兩種運動方式對降糖的作用尚未見明顯的差異性。

本實驗T2DM大鼠血漿中Rab5濃度明顯升高，血漿Rab5濃度與骨骼肌Rab5的基因與蛋白表達呈現不一致性，有關血漿Rab5濃度改變的文獻相對較少，尤其在T2DM的機體中。其原因可能是在高血糖狀態下，機體代謝紊亂導致血漿Rab5濃度增高，機體對應激狀態的代償性反應，具體原因有待于進一步研究。通過8周的持續運動與間歇負重運動均降低血漿Rab5濃度，兩種運動方式之間對Rab5濃度的影響沒有明顯的差異。運動可使T2DM血漿Rab5濃度趨于正常，這可能與該干預方式緩解高糖狀態下機體代謝紊亂有關，但還需要后期進行大量的實驗加以證明。

綜上所述，持續運動和間歇負重運動均能提高T2DM大鼠骨骼肌Rab5的轉錄和翻譯水平，增強GLUT4轉運能力，減輕高血糖引起的骨骼肌肌纖維損傷。本研究結果表明，運動可能通過提高骨骼肌Rab5的蛋白表達，在緩解T2DM大鼠骨骼肌糖代謝穩態失衡過程中發揮一定的作用，但兩種運動方式對其影響未見明顯差異。