有氧運動對非酒精性脂肪肝小鼠肝臟CNPY2-PERK通路的影響*

李軍漢，熊 偉，王佳倩，李亞龍，蔣昌君

（1.成都體育學院運動醫學與健康學院，四川 成都 610041；2.四川省人民醫院肝外科，成都 610041）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）以彌漫性肝細胞脂肪性變為主要特征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎和肝硬化等，是由酒精和其他明確的肝損傷以外因素所致的臨床病理綜合征［1］，其患病率在世界范圍內呈上升趨勢［2］，嚴重危害人類健康。目前，NAFLD在臨床治療上尚無特效藥物［3］。研究［4］報道，生活方式改變可有效改善NAFLD。有研究表明，運動可有效抑制NAFLD的病理進展，減少肝臟脂肪沉積。近年來，運動治療NAFLD受到國內外學者的廣泛關注。然而，運動改善NAFLD的作用機制尚有待進一步研究。

冠層成纖維細胞生長因子信號調節器2（canopy fibroblast growth factor signaling regulator 2，CNPY2）在機體各組織器官廣泛表達，屬于Canopy家族成員（CNPY1，2，3和4）之一，由182個氨基酸組成，分子量約21 KDa，是胞漿分泌型蛋白，以心、肝、胰腺表達較高。Hong［5］報道，CNPY2是內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的重要分子組成，CNPY2正向調控PKR樣內質網激酶（PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）-C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）信號通路，是一種新的ERS起始因子。CNPY2的研究仍處于起步階段，有關CNPY2-PERK通路的文獻見于人臍靜脈內皮細胞缺血/再灌注［6］的研究報道。最新研究［7］發現，有氧運動可有效改善NAFLD，其機制與有氧運動調控肝臟PERK-CHOP信號通路有關。然而，CNPY2-PERK信號通路在有氧運動改善NAFLD中是否發揮作用，尚未見文獻報道。本研究通過高脂膳食喂養誘導NAFLD小鼠模型，采用有氧運動干預，探討有氧運動對NAFLD小鼠肝臟CNPY2-PERK通路的影響，以期為運動防治NAFLD的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與模型制備

8周齡雄性C57/BL6J小鼠，SPF/VAF級，體重為（20.1±1.2）g，許可證編號：JSNJ（蘇）2020-0003，由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供。所有小鼠在成都體育學院實驗中心小動物房內分籠飼養，相對濕度45%～55%，室溫18～22℃，自由飲食飲水，12 h陰暗交替。所有小鼠適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為對照組（C）、對照+運動組（CE），NAFLD模型組（M）和NAFLD模型+運動組（ME），每組10只。C組和CE組給予普通飼料喂養18周，M組和ME組給予高脂飼料喂養18周，高脂飼料配方如下：豬油28%、全脂奶粉10.8%、蔗糖5.6%、微晶纖維素1.6%、酪蛋白11.5%、磷酸氫鈣1.8%、實驗動物預混料2%、石粉0.4%、基礎飼料38%，此配方中能量占比約60%來源于脂肪，21%來源于糖，19%來源于蛋白質［8］。普通飼料和高脂飼料均由江蘇協同醫藥生物工程有限責任公司提供［編號：蘇飼證（2020）01008］。在實驗第9周，從各組中分別隨機抽取2只小鼠，禁食12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉取肝臟左葉做油紅O病理形態檢測，結合血脂變化，以確認模型制備成功［9］。第10周開始，CE組和ME組進行有氧跑臺訓練。

1.2 跑臺訓練方案

跑臺訓練方案參考現有文獻［10］。運動組小鼠先進行1周適應性跑臺訓練，初始速度為8 m/min×10 min，20 min/d，每天以0.5 m/min的速度 和10 min/d的時間遞增，直至運動時間達到60 min/d，運動速度達到12 m/min，正式運動持續8周，每周運動5 d，直至實驗結束。

1.3 樣本采集與處理

為避免運動應激反應，實驗結束后48 h取材。以4 ml/kg腹腔內注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，摘取小鼠眼球取血。以腹部正中切口打開腹腔，迅速取出肝臟，稱肝濕重。肝臟一部分用4%多聚甲醛固定，用于HE染色和免疫組化檢測；一部分固定包埋，用于冰凍切片和油紅O染色；另一部分放置于液氮中速凍，轉入-80℃冰箱儲存，用于Western blot和qRT-PCR檢測。

1.4 肝臟病理形態

用4%多聚甲醛將肝組織固定，常規石蠟包埋，切片后蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝組織病理學改變。采用NAS評分［11］標準對肝組織脂肪性變進行病理學評分。肝組織常規油紅O染色，脂滴為紅色，脂滴光密度采用IPP 6.0圖像分析系統進行分析。

1.5 血液生化指標

全自動生化儀檢測小鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（total triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-c）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平，檢測方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 Western blot

取肝組織加入RIPA裂解液裂解后提取肝組織中總蛋白。50μg蛋白樣品經12.5%SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜上，經5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h。5%BSA-TBST稀釋一抗CNPY2（1：400），PERK（1∶500），p-eIF2a（1∶1 000）、CHOP（1∶1 000），β-actin（1∶10 0000），5%BSA-TBST稀釋HRP結合的羊抗兔IgG（1∶5 000），ECL發光法曝光，顯影，定影。β-actin作為內參，用Gel-pro32圖像分析軟件進行分析，蛋白表達量用“目的蛋白/β-actin”計算。

1.7 qRT-PCR

按照Trizol試劑盒說明書提取肝組織總RNA，逆轉錄獲得eDNA，采用SYBR Green I實時熒光定量PCR方法檢測各組肝組織CNPY2，PERK基因的表達水平。反應條件：95℃×30 s，95℃×3 s，55℃×30 s，72℃×30 s，45個循環。每個樣本重復檢測3次，以β-actin作為內參，計算相對量，采用2-ΔΔCT法分析。引物設計見表1，由上海生工公司設計合成。

Tab.1 Oligonucleotide primers used for qRT-PCR

1.8 免疫組化

免疫組化嚴格按照SABC免疫組化染色試劑盒說明書操作步驟進行。DAB顯色，常規脫水、透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察，棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，用IPP 6.0免疫組化分析軟件進行定量分析。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 各組肝臟病理形態變化

肝臟病理結果顯示：C組和CE組肝細胞內可見少量脂肪性變和脂滴，肝小葉結構清晰；M組肝細胞內充滿大量脂肪空泡，肝細胞脂肪性變顯著，肝細胞內可見大量脂滴；ME組肝細胞脂肪性變程度和脂滴數量位于C組和M組之間（圖1）。肝細胞脂肪性變積分結果顯示：M組肝細胞脂肪性變積分和脂滴密度較C組顯著升高（P＜0.05），ME組肝細胞脂肪性變積分和脂滴密度較M組顯著降低（P＜0.05），CE組肝細胞脂性變積分和脂滴密度與C組比較，沒有顯著性差異（P＞0.05，表2）

Fig.1 The hepatic pathological changes in mice of each group（Bar=10μm，×400）

Tab.2 Comparisons of the quantification of histological pathology in mice of each group（±s，n=8）

Tab.2 Comparisons of the quantification of histological pathology in mice of each group（±s，n=8）

C：Control；CE：Control+Exercise；M：Model；ME：Model+Exercise；AIOD：Average integrated optical density area*P＜0.05 vs C group；#P＜0.05 vs M group

Group Histology ratings（Points）Density of lipid drops（AIOD，μm2）C 0.857±0.143 0.06±0.001 CE 0.574±0.202 0.04±0.001 M 3.857±0.143* 0.29±0.004*ME 1.714±0.286# 0.17±0.002#

2.2 各組體重和肝指數變化

各組小鼠體重結果顯示（表3），實驗開始時，各組小鼠體重無顯著性差異（P＞0.05）；數周后，M組和ME組小鼠體重增長快速，至第9周末，M組小鼠體重顯著高于C組（P＜0.05），ME組體重較M組沒有顯著性差異（P＞0.05）；實驗結束時，M組體重較C組顯著升高（P＜0.05）；ME組體重較M組顯著降低（P＜0.05），CE組體重較C組沒有顯著性差異（P＞0.05）。肝濕重和肝指數（肝指數=肝濕重/體重）結果顯示，M組肝濕重和肝指數較C組顯著升高（P＜0.05），ME組肝濕重和肝指數較M組顯著降低（P＜0.05），CE組肝濕重和肝指數與C組比較，沒有顯著性差異（P＞0.05）

Tab.3 Comparisons of the body weight and liver index in mice of each group（±s，n=8）

Tab.3 Comparisons of the body weight and liver index in mice of each group（±s，n=8）

C：Control；CE：Control+Exercise；M：Model；ME：Model+Exercise*P＜0.05 vs C group；#P＜0.05 vs M group

Group Original body weight（g）The ninth body weight（g）Final body weight（g）Liver weight（g） Liver index（%）C 20.020±0.198 26.920±0.361 29.130±0.501 0.812±0.023 2.729±0.071 CE 19.650±0.150 25.760±0.585 26.680±0.369 0.759±0.022 2.678±0.115 M 20.420±0.324 38.000±1.077* 50.450±1.092* 1.884±0.161*3.664±0.221*ME 19.700±0.283 35.300±0.887 41.010±1.199# 1.041±0.058#2.581±0.087#

2.3 各組血液生化指標變化

小鼠血液生化指標結果顯示（表4）：M組血清ALT、AST、TC、TG和LDL-c含量較C組顯著升高（P＜0.05），ME組以上指標較M組顯著降低（P＜0.05）；M組血清HDL-c含量較C組顯著降低（P＜0.05），ME組血清HDL-c含量較M組沒有顯著性差異（P＞0.05）；CE組以上血液生化指標與C組比較，沒有顯著性差異（P＞0.05）。

Tab.4 Comparisons of the serum lipid and liver function enzymes in mice of each group（±s，n=8）

Tab.4 Comparisons of the serum lipid and liver function enzymes in mice of each group（±s，n=8）

C：Control；CE：Control+Exercise；M：Model；ME：Model+Exercise*P＜0.05 vs C group；#P＜0.05 vs M group

Group TG（g/L） TC（g/L） HDL-c（g/L） LDL-c（g/L） ALT（U/L） AST（U/L）C 0.817±0.063 2.820±0.152 3.932±0.211 0.240±0.007 40.530±4.784 140.600±13.150 CE 0.667±0.018 2.662±0.064 3.813±0.080 0.202±0.012 39.620±3.831 130.000±13.920 M 1.422±0.142* 5.760±0.304* 2.102±0.066* 1.175±0.088* 167.800±25.410*203.500±8.664*ME 0.865±0.065# 4.893±0.229# 2.477±0.068 0.618±0.050# 58.080±4.870#154.800±9.034#

2.4 各組肝組織CNPY2-PERK通路蛋白表達變化

Western blot結果顯示（表5，圖2）：M組CNPY2、PERK、p-eIF2a、CHOP蛋白表達較C組顯著升高（P＜0.05）；ME組以上指標較M組顯著降低（P＜0.05）；CE組以上指標與C組比較，沒有顯著性差異（P＜0.05）。

Tab.5 The relative expressions of CNPY2-PERK pathway in mice of each group（±s，n=6）

Tab.5 The relative expressions of CNPY2-PERK pathway in mice of each group（±s，n=6）

C：Control；CE：Control+Exercise；M：Model；ME：Model+Exercise*P＜0.05 vs C group；#P＜0.05 vs M group

Group CNPY2 PERK p-eIF2a CHOP CNPY2 mRNA PERK mRNA C 0.369±0.039 0.654±0.131 0.709±0.033 0.692±0.050 0.713±0.095 0.910±0.166 CE 0.255±0.024 0.589±0.125 0.712±0.055 0.625±0.062 0.697±0.052 0.810±0.049 M 0.655±0.035* 1.469±0.143* 1.099±0.044* 0.954±0.024* 1.227±0.027* 1.843±0.203*ME 0.459±0.019# 0.695±0.131# 0.767±0.043# 0.704±0.091# 0.890±0.026# 1.220±0.109#

Fig.2 The relative expressions of proteins in CNPY2-PERK pathway

2.5 各組肝組織CNPY2/PERK通路mRNA表達變化

qRT-PCR結果顯示（表5）：M組CNPY2 mRNA和PERK mRNA表達較C組顯著升高（P＜0.05）；ME組以上指標較M組顯著降低（P＜0.05）；CE組以上指標與C組比較，沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.6 各組肝組織CNPY2、PERK陽性表達變化

免疫組化結果顯示：CNPY2和PERK陽性產物主要分布在細胞質及細胞間質，M組各蛋白表達較C組范圍廣，著色深；ME組各蛋白表達較M組范圍少，著色淺；C組和CE組各蛋白表達最少，著色最淺（圖3）；CNPY2、PERK蛋白陽性表達結果顯示，M組CNPY2、PERK蛋白陽性表達較C組顯著升高（P＜0.05），ME組上述指標較M組顯著降低（P＜0.05），CE組上述指標與C組比較，沒有顯著性差異（P＞0.05，表6）。

Fig.3 The positive staining of CNPY2 and PERK in mice of each group（Immunohistochemistry，Bar=40μm，×400）

Tab.6 Comparisons of the percentage of positive staining of CNPY2 and PERK in mice of each group（%，±s，n=6）

Tab.6 Comparisons of the percentage of positive staining of CNPY2 and PERK in mice of each group（%，±s，n=6）

C：Control；CE：Control+Exercise；M：Model；ME：Model+Exercise*P＜0.05 vs C group；#P＜0.05 vs M group

Group The positive staining of CNPY2 The positive staining of PERK C 0.180±0.001 0.240±0.003 CE 0.110±0.001 0.110±0.001 M 0.590±0.005* 2.530±0.007*ME 0.250±0.003# 0.380±0.003*#

3 討論

NAFLD多發生于40～60歲人群，其主要病理學特征為肝細胞內脂質沉積，早期病理僅為單純性肝細胞脂肪樣變，而中晚期會繼發炎性細胞浸潤、肝細胞凋亡和壞死。NAFLD最初被認為是一種良性肝病，但現在被認為是代謝綜合征在肝臟的表現［12］。臨床上NAFLD除了依靠病史、癥狀、體癥進行診斷外，其主要的實驗室手段包括血脂和肝功能酶水平檢測、肝臟B超、CT、MRI和活檢，其中，病理組織學是診斷NAFLD的金標準［13］。本研究采用高脂飲食誘導NAFLD小鼠模型，肝臟病理形態結果顯示M組肝細胞脂肪性變和脂滴數量較C組顯著增加，提示本研究NAFLD動物模型復制成功。

減少體重被廣泛認為是治療NAFLD最有效的手段之一，而運動常常作為重要的減體重手段［14］。本研究結果顯示，有氧運動可有效減緩高脂膳食誘導的體重增加。脂質代謝紊亂是誘發NAFLD的主要因素之一，TC、TG、LDL-c、HDL-c為反映肝臟脂代謝的重要指標［15］。本研究結果顯示，高脂膳食誘導血清TC、TG、LDL-c顯著升高，HDL-c顯著降低，而有氧運動顯著降低血清TC、TG、LDL-c水平。研究［7］報道，中低強度有氧運動和遞增強度有氧運動均可有效降低血清TC、TG、LDL-c水平，提示運動改善NAFLD脂代謝，不受運動強度或訓練方案的影響。研究發現，運動改善脂代謝是影響肝臟脂質沉積的獨立因素，與體重變化無關［16］。ALT、AST作為肝損傷的標志性轉氨酶，常被作為評價肝損傷的指標。在生理狀態下，ALT、AST主要存在于肝細胞胞漿內，當NAFLD產生時，肝細胞膜的結構與功能嚴重受損，細胞膜通透性增加，ALT、AST進入血液，導致血清ALT、AST水平升高。研究［7］報道，中高強度體育活動和中低強度體育活動可顯著降低NAFLD患者血清ALT、AST水平，提示不同強度的運動鍛煉均可有效緩解NAFLD肝損傷。

PERK/eIF2a/CHOP信號通路是ERS介導細胞凋亡的主要途徑之一，研究［17］發現，PERK/eIF2α通路具有調節脂肪生成和脂肪變性的功能。研究［5］報道，CNPY2敲除可以阻斷PERK/eIF2a/CHOP通路，對衣霉素誘導的急性NAFLD和高脂誘導的NAFLD均有較強的保護作用。本研究結果顯示，高脂膳食誘導小鼠肝臟CNPY2-PERK信號通路相關分子表達升高，有氧運動顯著降低CNPY2-PERK信號通路相關分子表達，提示CNPY2-PERK信號通路參與NAFLD形成，有氧運動有效改善NAFLD，其機制可能與其顯著降低CNPY2-PERK信號通路相關分子表達有關。

運動對NAFLD的影響，與運動方式、運動強度和運動量有關。研究［7］報道，有氧運動與抗阻運動改善NAFLD的效果相似，中等強度有氧運動或高強度間歇訓練均有效減少肝臟TG，而80%最大攝氧量的大強度運動反而加重NAFLD。本研究結果顯示，較長時間的中等強度有氧運動可有效抑制高脂膳食誘導的NAFLD。有趣的是，與C組比較，CE組小鼠肝組織結構、體重、肝指數、血脂和肝功能酶水平、以及肝臟CNPY2-PERK信號通路相關分子表達均未見顯著性差異，提示有氧運動可有效減輕NAFLD小鼠病理結構變化，改善NAFLD小鼠血脂紊亂和肝功能酶水平，下調NAFLD小鼠肝臟CNPY2-PERK信號通路相關分子表達，但對于健康小鼠，有氧運動不具上述特點和作用。研究［18］報道，持續6周的跑臺訓練，無論是低強度，中等強度，遞增強度還是大強度，正常大鼠肝臟中PERK的表達均未見顯著變化，而長期訓練后肝臟中的PERK有明顯下降［19］。我們推測，本研究中有氧運動對正常肝臟未有顯著性影響，可能與運動時間較短有關。

綜上所述，CNPY2-PERK信號通路參與高脂膳食誘導NAFLD的形成。有氧運動可有效改善NAFLD，其機制可能與有氧運動降低CNPY2-PERK通路相關分子表達有關