吡咯喹啉醌高產菌株選育及發酵優化

張靜，劉孟粟，秦志杰，曾偉主，周景文*

1(江南大學,糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫,214122)2(江南大學,未來食品科學中心，江蘇 無錫,214122)

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)是繼黃素核苷酸(FMN/FAD)和吡啶核苷酸(NAD/NADP)之后被發現的第三種氧化還原酶的輔因子并且PQQ可以參與氧化還原過程[1]。PQQ可作為輔酶參與電子傳遞并表現出很強的抗氧化性[2-3]，具有防護肝損傷[4-7]、促進生物體生長[8]、加快神經生長因子合成速率[9]、增強細菌對一些極端條件的耐受性[10-11]、清除氮自由基[12]等功能。在食品、醫藥和化妝品領域都有重要的應用價值。

目前，主要采用化學合成法和微生物發酵法合成PQQ。其中，化學合成法合成PQQ產量較高，但是存在的問題有合成步驟復雜、生產成本較高、副產物處理困難和產物回收率低。微生物發酵法生產PQQ成本低，主要采用以甲醇為碳源及其他無機鹽培養基，反應條件溫和、易于建立發酵控制策略及放大培養，因此微生物發酵法成為最有前景的工業化生產路線[13]。然而，能合成PQQ的菌株只有部分的革蘭氏陰性菌[14-16]，其中甲基營養菌合成PQQ的能力較強，目前研究最多的甲基營養菌是扭脫甲基桿菌(Methylobacteriumextorquens)、脫氮生絲微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)及氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)等?，F階段關于PQQ完整的代謝合成途徑尚未完全闡明，通過代謝工程改造方法來提高PQQ產量仍然存在很多限制。因此目前提高PQQ產量的方法以篩選高產菌株為主，如柯崇榕[17]針對Hyphomicrobiumdenitrificans通過紫外誘變結合NTG誘變相結合的方式并對菌株進行一定的定向馴化篩選到了兩株高產菌株；李紅月等[18]以MethylobacteriumextorquensI-F2為研究對象，通過ARTP誘變、流式分選的高通量篩選策略，并進一步對樣品制備條件和流式分選過程進行優化，最終篩選出一株PQQ高產突變菌株。

本研究以HyphomicrobiumdenitrificansCGMCC 1.12893為出發菌，采用常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變原始菌株，并結合光譜法和高效液相色譜法對突變株進行初篩及復篩，獲得一株高產PQQ的誘變菌株。對篩選得到的高產突變菌株進行發酵培養基優化然后在5 L發酵罐上進行驗證培養，進一步提高PQQ產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

脫氮生絲微菌CGMCC 1.12893，購于武漢微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養基

培養基：甲醇25 mL/L、(NH4)2SO42 g/L、Na2HPO4·12H2O 5 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、KH2PO41.4 g/L。

微量元素(g/L)：ZnSO4·7H2O 5.75；MnCl2·4H2O 0.32；CoCl2·6H2O 0.47；NaMoO4·2H2O 0.48；CaCl2·2H2O 2.9；FeSO4·7H2O 2.8。

維生素(g/L)：生物素 0.05；泛酸鈣 1；煙酸 1；肌醇 25；硫胺素HCl 1；吡哆醛鹽酸鹽 1；對氨基苯甲酸 0.02。

1.1.3 主要試劑

甲醇、(NH4)2SO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、CoCl2·6H2O、NaMoO4·2H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、泛酸鈣，國藥集團化學試劑有限公司；核黃素、生物素、維生素B1、對氨基苯甲酸，生工生物(上海)有限公司；煙酸、肌醇、吡哆醛鹽酸鹽，上海麥克林生化科技有限公司，PQQ，上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.1.4 儀器與設備

ZQZY-CF8搖床，上海知楚儀器有限公司；CBM-20A高效液相色譜儀，日本Shimadzu 公司；Nanodrop ND-ONE分光光度計，美國Thermo公司；Eppendorf-5245離心機，美國Eppendorf公司；ARTP-IIS常壓室溫等離子體誘變儀，無錫源清天木生物科技有限公司；Synergy H1酶標儀，南京拜爾沃克智能科技有限公司；T&J-Atype 5 L發酵罐，迪必爾生物工程(上海)有限公司。

1.1.5 搖瓶培養條件

將安瓿管中菌粉用培養基混勻后30 ℃，220 r/min振蕩培養，待菌株長至對數期進一步平板劃線進行活化，30 ℃培養5 d。挑取單菌落接種至5 mL液體培養基，菌株長至對數期后按10% (體積分數)接種量轉接至25 mL裝液量的250 mL搖瓶中，30 ℃，220 r/min振蕩培養。

1.2 實驗方法

1.2.1 ARTP誘變處理

本研究采用ARTP誘變對出發菌株進行處理，將菌株接種于培養基中生長至對數期，然后稀釋菌液使其OD650值在0.5～0.6。取1 mL菌液于1.5 mL的無菌EP管中，離心棄去上清液，用 pH=7的PBS緩沖液洗滌2次后，再加入1 mL緩沖液使菌體混合均勻。吸取10 μL菌懸液涂布于無菌的ARTP載片表面，然后用ARTP進行誘變，分別照射0、50、100、150、200、250、280、300 s。樣品處理完畢，載片自動掉落至裝有1 mL含有5%甘油的PBS緩沖液中，持續充分振蕩1 min，將誘變后菌體充分洗脫形成菌液，然后稀釋10-1～10-3倍數進行涂板，觀察平板上菌落的生長情況并計算致死率。計算如公式(1)所示：

(1)

式中:A表示未經ARTP處理的空白對照平板上長出的單菌落個數;B表示經過ARTP誘變處理后的平板上長出的單菌落個數。

1.2.2 高通量篩選方法

在30 ℃、220 r/min條件下將誘變后的單菌落接于48孔深孔板中培養10 d，離心后取200 μL上清液至96孔淺孔板中，用酶標儀分別檢測326 nm處與400 nm處的吸光值，并計算OD326值與OD400值的差值，同時將培養基以同樣的條件處理和檢測，從而扣除培養基吸光值。簡言之，利用PQQ在固定波長247 nm和330 nm處的特征吸收峰，并排除其他物質的干擾，選擇326 nm和400 nm為檢測波長以減少系統誤差[19]。PQQ含量越高差值越高，然后進行復篩驗證。

1.2.3 PQQ檢測方法

采用高效液相色譜法對PQQ含量進行檢測。將發酵液8 000 r/min離心5 min，取上清液用0.22 μm的水系膜過濾。HPLC條件：色譜柱Sun Fire C184.6 mm×250 mm (5 μm)。檢測波長254/330 nm、柱溫40 ℃，流動相為V(水+1‰ TFA)∶V(乙腈+1‰ TFA)=85∶15、流速為0.5 mL/min。

1.2.4 搖瓶發酵培養基條件優化

首先采用單因素試驗確定碳源、氮源、金屬離子及維生素的最佳組合。碳源：甲醇、乙醇、甘油，含量分別為25 mL/L，葡萄糖質量濃度為20 g/L，V(甲醇)∶V(乙醇)=1∶1、1∶4、4∶1；氮源：硫酸銨、尿素、蛋白胨、硝酸鈉，質量濃度分別為2.0 g/L，氨水含量為2.0 mL/L；金屬離子：Mg2+(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L)、Fe2+(1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 g/L)、Ca2+(0.01、0.1、0.2、0.4、0.6 g/L)；維生素：核黃素(0.5、1.0、2.0 g/L)、對氨基苯甲酸(0.02、0.05、0.1、0.2 g/L)。為了進一步確定各因素(甲醇、硫酸銨、Mg2+、Ca2+、核黃素、對氨基苯甲酸)的最佳含量，在單因素實驗的基礎上進行六因素三水平的正交實驗，如表1所示，進一步優化培養基。

表1 正交試驗表Table 1 Orthogonal experiment table

1.2.5 5 L發酵罐培養條件

在正交試驗得出的最優培養基的基礎上，在5 L發酵罐上進行驗證培養。5 L發酵罐裝液量為 2.5 L，以恒速流加的方式進行補料，控制發酵罐內的甲醇含量在0～5 g/L，用氨水維持pH為7.0，菌體生長階段溶氧控制在70%～80%，PQQ產生階段溶氧控制在20%～30%。觀察在發酵過程中菌株的生長情況及PQQ的產生情況。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變致死曲線的繪制

ARTP誘變的原理是通過控制產生的等離子體射流的強度引起其基因損傷，進而使生物特性有一定的改變，較高的致死率可以獲得有效的突變率，研究結果表明致死率在90%以上時效果較佳[20]。菌株ARTP誘變的致死曲線如圖1所示，在10-1的梯度下，照射時間為0～150 s時，致死情況較不明顯；當照射時間為150～250 s時，致死率持續增長，280 s時致死率達到95%。一般認為致死率越高，誘變效果越好，但保持相對較低的致死率又有利于正突變的產生，所以本研究選擇的誘變時間為250～280 s。

圖1 致死曲線Fig.1 The lethality curve

2.2 高通量篩選方法

目前，PQQ的檢測方法主要有重組酶法、光譜法和高效液相色譜法[19]。重組酶法操作簡單但是重復性不佳；光譜法精密度較好，但存在只適合檢測純度較高的PQQ的缺點；高效液相色譜法可定性定量的檢測PQQ。本研究采用光譜法初篩和高效液相色譜法復篩的高通量篩選方法，設置了不同質量濃度(0、5、10、25、50、100、200 mg/L)的PQQ標準品，酶標儀檢測發現其線性關系較好，標準曲線如圖2-a所示。PQQ標準品的出峰時間如圖2-b所示，在8 min左右時，254 nm和330 nm處均有峰出現。

a-光譜法檢測PQQ的標準曲線;b-PQQ標品HPLC圖圖2 光譜法檢測PQQ的標準曲線Fig.2 Standard curve for detecting PQQ by spectroscopy

2.3 吡咯喹啉醌高產菌株的獲得

將活化好的菌株進行ARTP誘變處理250～280 s，再進行孔板發酵?；诠庾V法采用酶標板進行初篩(圖3-a)，選擇孔板產量較高的39株菌株繼續進行搖瓶復篩，復篩結果如圖3-b所示。誘變后菌株的PQQ產量和對照組(編號為0)相比，大部分產量明顯提高。在PQQ產量提高的菌種中，34號菌株的PQQ產量提高的最多，PQQ產量為48.4 mg/L，相比對照菌株(31.4 mg/L)提升了54.1%。對突變株34進行連續傳代6代培養，并檢測PQQ產量，如表2所示，PQQ產量保持穩定。

表2 突變菌株遺傳穩定性Table 2 The genetic stability of mutant strains

a-PQQ高產菌株初篩;b-PQQ高產菌株復篩圖3 PQQ高產菌株的初篩及復篩Fig.3 Preliminary screening and re-screening of PQQ high-yield strains

2.4 搖瓶發酵培養基成分的優化結果

2.4.1 不同碳源條件下對PQQ的影響

研究不同碳源對生物量和PQQ產量的影響，結果如圖4所示。當碳源是甲醇、乙醇和甘油時，可促進菌株的生長(圖4-a)；甲醇和乙醇為碳源時PQQ產量較高，分別在216 h和240 h達到最大值,為47.4 mg/L和47.9 mg/L(圖4-b)。綜上，當甲醇和乙醇為碳源時發酵結果較好。

又進一步研究了甲醇和乙醇為混合碳源時對其的影響。當V(甲醇)∶V(乙醇)=1∶4時，OD650值達到最大值2.0(圖4-c)，PQQ產量在192 h達到最高值51.8 mg/L(圖4-d)。但據文獻報道，生絲微菌屬于兼性甲基營養菌，其不能利用甲烷，但可以利用甲醇等其他一碳化合物進行生長[17]。雖然在甲醇乙醇為混合碳源的情況下產量提高了4.4 mg/L，但其結果有待進一步驗證，因此在后續的實驗中選擇了甲醇為單一碳源。

a-不同碳源的OD650值;b-不同碳源的PQQ產量;c-甲醇和乙醇不同比例下的OD650值;d-甲醇和乙醇不同比例下的PQQ產量圖4 不同碳源對生物量和PQQ產量的影響Fig.4 Effect of different carbon sources on biomass and PQQ yield

2.4.2 不同氮源條件下對PQQ的影響

考察不同氮源對生物量和PQQ合成的影響。當氮源是氨水和硝酸鈉時，對菌株的生長有明顯的促進作用，在192 h時OD650值達到了最大值分別為3.0和2.7 (圖5-a)。以硫酸銨、氨水和硝酸鈉為氮源時PQQ產量相對較高，分別為47.7、45.7、52.5 mg/L(圖5-b)，考慮到安全和成本問題，選擇硫酸銨為氮源。

a-不同氮源的OD650值;b-不同氮源的PQQ產量圖5 不同氮源對生物量和PQQ產量的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on biomass and PQQ yield

2.4.3 不同濃度的金屬離子對PQQ的影響

分別考察了Mg2+、Fe2+及Ca2+對生物量和PQQ合成的影響。結果表明，不同濃度的Mg2+對菌株生長的影響情況大致相同(圖6-a)，當Mg2+質量濃度為3.0、4.0 g/L時，在發酵240 h達到最大值,分別為62.6 mg/L和62.9 mg/L (圖6-b)；當Fe2+質量濃度為0.015 g/L時，其OD650的最大值為2.0 (圖6-c)并且在Fe2+質量濃度為0.002 8 g/L時PQQ產量最高，為47.8 mg/L(圖6-d)；當Ca2+質量濃度為0.01 g/L時，OD650值在發酵240 h時達到最大值2.0(圖6-e)；在發酵240 h，Ca2+質量濃度為0.6 g/L時PQQ產量最高，為58.8 mg/L(圖6-f)，均高于對照組47.7 mg/L (圖6-b)。

2.4.4 不同濃度的維生素對PQQ的影響

考察了核黃素及對氨基苯甲酸對生物量及PQQ合成的影響。結果表明，核黃素的質量濃度為1.0 g/L時，在發酵240 h時OD650值達到了最大值，為2.4(圖7-a)；核黃素質量濃度為2.0 g/L時，PQQ產量達到最大值，為66.4 mg/L (圖7-b)；由圖7-c可知，較高濃度的對氨基苯甲酸對菌體的生長和PQQ產量都有一定的促進作用，當對氨基苯甲酸質量濃度為0.2 g/L時，OD650值達到1.7，PQQ產量最高達53.3 mg/L(圖7-d)。

2.4.5 正交試驗結果

基于上述單因素試驗結果，采用L53(36)正交試驗表進行正交優化試驗。正交實驗的53組實驗結果如表3所示，第2、6、10、41、51組PQQ產量和對照相比都有相應的提升，第51組PQQ產量提升的最高，達到105.8 mg/L，提升了118.7%。因此，優化后的培養基配方為：甲醇25 mL/L、(NH4)2SO43 g/L、Na2HPO45 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、KH2PO41.4 g/L、核黃素2 g/L、對氨基苯甲酸0.2 g/L。重復實驗驗證結果表明，PQQ平均產量為105.2 mg/L。

表3 正交試驗表Table 3 Orthogonal test table

a-不同Mg2+濃度的OD650值;b-不同Mg2 +濃度的PQQ產量;c-不同Fe2+濃度的OD650值;d-不同Fe2+濃度的PQQ產量;e-不同Ca2+濃度的OD650值;f-不同Ca2+濃度的PQQ產量圖6 不同濃度金屬離子對生物量和PQQ產量的影響Fig.6 Effect of different metal ions concentration on biomass and PQQ yield

其結果的顯著性分析如表4所示，發現金屬元素中Ca2+P值<0.01，Mg2+的P值<0.05，Ca2+和Mg2+對PQQ產量有顯著的影響，其余因素如甲醇、硫酸銨、核黃素和對氨基苯甲酸等對PQQ產量影響不顯著。

表4 顯著性分析Table 4 Significance analysis

a-不同質量濃度核黃素的OD650值;b-不同質量濃度核黃素的PQQ產量;c-不同質量濃度對氨基苯甲酸的OD650值;d-不同質量濃度對氨基苯甲酸的PQQ產量圖7 不同濃度維生素對生物量和PQQ產量的影響Fig.7 Effect of different vitamins concentration on biomass and PQQ yield

2.5 5 L發酵罐驗證培養

基于搖瓶水平優化的培養基的配方，繼續在5 L罐上對突變菌株和培養基進行驗證培養。結果如圖8所示，菌株的延滯期較長，在前48 h菌株生長較為緩慢，在發酵240 h時菌株的OD650值達到最大為83，甲醇在發酵前期消耗緩慢，48 h后消耗較快，發酵后期通過補料維持甲醇含量在0～5 g/L內，PQQ在72 h 后PQQ逐漸積累，240 h積累量達349.8 mg/L。相比搖瓶水平，在發酵罐上PQQ的產量明顯提高，提高了2.3倍。

圖8 5 L罐上發酵過程曲線Fig.8 Process curve of fermentation on 5 L bioreactor

3 討論

PQQ作為一種氧化還原酶的輔因子，在食品、醫藥和化妝品等領域具有重要的應用價值。雖然目前在基因工程方面取得了一定的進展，如ZHAO等[21]通過比較基因組學分析了誘變前后菌株基因組的差異及甲基桿菌PQQ過量產生的機制；WANG等[22]利用前體肽pqqA轉化成了PQQ,但是PQQ的合成機理尚未得到清晰闡明，通過基因工程來獲得PQQ高產菌株相對比較困難。目前，主要通過誘變育種和發酵工藝優化的方法來提高PQQ產量，并且在國內外研究中篩選得到的PQQ高產菌株主要是甲基營養型菌。如廖燦[23]、李慧芝等[24]分別對菌株HyphomicrobiumdenitrificansFJNU-6和MethylobacteriumextorquensAM1進行誘變并篩選得到的正突變株，獲得較高產量的PQQ生產菌株；隨后，LIU等[25]通過對HyphomicrobiumdenitrificansFJNU-6兩階段控氧發酵工藝優化將PQQ產量提高至1 070 mg/L。鄭玲輝等[26]利用NTG對Hyphomicrobiumsp.1112進行誘變，獲得了一株在80 T發酵罐中培養240 h，PQQ產量高達1 783 mg/L高產誘變菌株。

本研究以一株能積累PQQ的甲基營養菌脫氮生絲微菌CGMCC 1.12893為出發菌株，其初始產量為31.4 mg/L。根據PQQ在固定波長下具有特征吸收峰的特點，采用光譜法結合液相色譜法篩選獲得了一株ARTP誘變后的高產菌株。針對篩選得到的高產菌株在搖瓶水平對碳源、氮源、金屬離子及維生素成分進行了優化，PQQ產量提高至105.2 mg/L，相對于初始菌株提高了3.4倍。將突變菌株和優化后的培養基在5 L發酵罐上放大培養，發酵240 h后PQQ產量達到349.8 mg/L。PQQ合成和甲醇脫氫酶的合成是一個相互協調的過程，通過誘變育種及發酵優化的方法使PQQ產量相對于初始菌株得到了很大的提升，但是遠未達到工業生產水平，依然面臨很大的挑戰?？鲁玳臶27]針對HyphomicrobiumdenitrificansFJNU-6 經過10輪適應性馴化獲得了一株搖瓶穩定產量達65 mg/L的高產菌株FJNU-8，5 L發酵罐分批發酵PQQ產量達到1 087 mg/L。因此，在今后的研究中可以采用多種誘變相結合的方式對菌株進行誘變，并結合微流控技術篩選得到PQQ產量更高的突變株，以及在發酵罐上對不同發酵時期的溶氧、pH、補料方式及罐內甲醇含量等條件進行優化，以期進一步提高PQQ的產量。