酶-堿聯合工藝改善豬大腸嫩度和保水性的工藝優化

程成鵬，賀稚非,2，唐春，劉姝韻，肖旭，李洪軍,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)3(四川高金實業集團股份有限公司，四川 遂寧，629000)

肌肉組織按照其結構和功能可分為三類：骨骼肌、心肌和平滑肌[1]。豬大腸屬于平滑肌，不僅是人們餐桌中常見食材，還有潤腸治燥、去下焦風熱、補虛、止渴、止血、止小便的功效，在我國有廣泛的消費基礎[2]。但是豬大腸在熱加工后嫩度和保水性會明顯下降，導致豬大腸彈性差，咀嚼性差等現象。因此，探尋豬大腸最佳嫩化和保水工藝，可為豬大腸精深加工提供理論參考。

嫩度是影響肉的感官的重要因素之一[3]，在消費者的購買決策中起著重大的作用[4]。肉的嫩度由兩大因素組成即基礎硬度和尸僵硬度[5]?；A嫩度與膠原蛋白濃度有關[6]。膠原蛋白是肌肉中主要的結締組織蛋白[7]，不同類型的肌肉纖維的膠原蛋白含量不同，因此不同纖維類型組成的肌肉的嫩度也不同[8]。pH值的變化會導致肌肉和結締組織腫脹，這種腫脹與肌肉膠原蛋白的溶解性有關[9]。因此可以通過提高肉的pH值，協助膠原蛋白溶解以及提高肉的保水性來改善嫩度[10]。PURCHAS[11]研究發現宰后公牛牛肉的pH與嫩度之間存在明顯的曲線關系，一定范圍內，隨著pH的升高，剪切力呈現先升高后降低的趨勢。當pH升高到6.2時，剪切力達到最大值。另外有研究發現，宰后肌肉的pH越高，其嫩度越好[12]。李鵬[13]比較了不同極限pH值下牛肉成熱過程中嫩度的變化，發現高pH時牛肉嫩化速率最快，低pH時牛肉嫩化速率次之，中pH時牛肉嫩化速率最慢。另外木瓜蛋白酶也可以加快肌肉蛋白質的水解，使得其嫩度和風味得到明顯改善[14-15]。

然而利用堿溶液處理豬大腸，改善其品質的研究并不多見。采用酶-堿聯合的方法處理豬大腸，改善其嫩度的方法更是尚未報道。本實驗基于GA-BP神經網絡模型，優化酶-堿聯合嫩化豬大腸工藝，為豬大腸的精深加工提供技術參考和理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

豬大腸由四川高金實業集團股份有限公司提供，生豬為三元豬。屠宰后用溫水對豬大腸進行簡單翻洗，去除糞便。置于-18 ℃的環境下貯藏。

1.2 主要試劑

食品級NaOH，濱化集團股份有限公司；木瓜蛋白酶(50 000 u/g)，河北萬邦實業有限公司。

1.3 儀器與設備

FA214A分析天平，上海豪晟科學儀器有限公司；磁力攪拌水浴鍋，常州恩培儀器制造有限公司，C-LM3B型數顯式肌肉嫩度儀，東北農業大學；Elix10純水機，美國密理博公司；恒溫恒濕試驗箱，南京泰斯特試驗設備有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品制備

1.4.1.1 實驗設計

嫩化工藝A:原料豬大腸處理→木瓜蛋白酶處理→清水浸泡

嫩化工藝B:原料豬大腸處理→食品級NaOH處理→清水浸泡

嫩化工藝C:原料豬大腸處理→木瓜蛋白酶處理→清水浸泡→食品級NaOH處理→清水浸泡

嫩化工藝D:原料豬大腸處理→食品級NaOH處理→清水浸泡→木瓜蛋白酶處理→清水浸泡

嫩化工藝E:原料豬大腸處理→煮制→木瓜蛋白酶處理→清水浸泡→食品級NaOH處理→清水浸泡

其中木瓜蛋白酶質量分數為1.8%，木瓜蛋白酶處理時間為60 min，NaOH質量濃度為1 g/L，NaOH處理時間為20 min。

1.4.1.2 樣品處理

將豬大腸置于4 ℃恒溫恒濕試驗箱中解凍12 h,去除表面可見脂肪，清洗干凈，將其切分為大小均勻,長為3 cm，質量約3.3 g的肉塊,每組3個樣品對照。將其以1∶10(g∶mL)的料液比放入盛有一定濃度的食品級NaOH或者木瓜蛋白酶溶液的燒杯中，按照不同的嫩化工藝流程在恒溫水浴鍋中進行恒溫浸泡處理，一定時間后取出。

1.4.2 單因素試驗

按照嫩化豬大腸最佳工藝流程，研究不同木瓜蛋白酶處理時間 (20、40、60、80、100 min)、木瓜蛋白酶質量分數(1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%)、NaOH質量濃度(0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/L)、NaOH處理時間(20、25、30、35、40 min)對豬大腸嫩化效果的影響。

1.4.3 制成率測定

濾干豬大腸水分，再用濾紙吸干豬大腸內外表面水分，用分析天平準確稱量質量并記錄，制成率計算如公式(1)所示：

(1)

式中：m1為嫩化后豬大腸質量；m2為嫩化前豬大腸質量。

1.4.4 蒸煮損失測定

參考李明奇[16]的方法，稍作修改。先將處理后的豬大腸進行稱重，記為W1，再置于蒸煮袋中，于90 ℃條件下進行恒溫水浴處理20 min，之后用濾紙吸干豬大腸內外表面水分并稱重，記為W2，每個樣品平行測定3次。按公式(2)計算結果:

(2)

1.4.5 剪切力測定

剪切力的測定參照王兆明[17]的方法，稍作修改。按照上述工藝流程嫩化后，將豬大腸置于蒸煮袋中并在90 ℃條件下進行恒溫水浴處理20 min。將處理好的樣品切成1 cm×1 cm×5 cm的長方體，用嫩度儀同時對兩塊樣品進行測試，樣品測3次取其平均值。

1.4.6 感官評定

參考張斌等[18]的方法略作修改。選擇10名(5男5女)食品科學學院的研究生組成感官評價小組，并進行感官評定實驗培訓，對酶-堿聯合嫩化后豬大腸的色澤、咀嚼性、氣味、硬度和風味進行感官評定，感官評分標準見表1。

表1 感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards

1.4.7 響應面設計

以木瓜蛋白酶處理時間、木瓜蛋白酶質量分數、NaOH濃度、NaOH處理時間為自變量進行單因素試驗，根據單因素試驗結果，以感官評分為響應值，用Design-Expert 8.0.6.1進行響應面試驗設計。試驗各因素水平見表2。

表2 響應面優化的因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface optimization

1.4.8 ANN模型的建立

根據響應面實驗設計原理，獲取BP神經網絡訓練模型所需要的訓練、測試和驗證數據。NaOH濃度(A)、NaOH處理時間(B)、木瓜蛋白酶處理時間(C)、木瓜蛋白酶質量分數(D)，以感官評分作為模型輸出，建立結構為3-n-1的單輸出網絡[18-19]，如圖1所示。模型訓練由MATLAB R2016a軟件實現。

圖1 BP神經網絡結構Fig.1 The diagram of BP neural network structure

1.5 數據處理

單因素方差分析采用SPSS Statistics 19.0軟件(軟件國際商業機器公司)進行處理。所有數據均采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件(State-East 公司)進行響應面分析。采用Origin 2018(OriginLab公司)繪圖。采用MATLAB R2016a(美國MathWorks公司)進行ANN模型構建。

2 結果與分析

2.1 不同嫩化工藝對豬大腸嫩化效果對比

由圖2可知，與空白組對比，A組(單獨酶處理)和B組(單獨堿處理)均能明顯提高豬大腸嫩度，但是嫩化效果沒有酶-堿聯合嫩化豬大腸工藝效果好。在所有嫩化工藝中，C組(先酶處理后堿處理)對豬大腸嫩化效果最好，其嫩化效果好于D組(先堿處理后酶處理)的原因可能是先用木瓜蛋白酶處理可以水解膠原蛋白和彈性蛋白，加快蛋白質的分解速率，加速了高pH環境對豬大腸肌肉內質網的破壞作用。也使得再經堿處理后肌肉中蛋白有更高的溶解性，從而提高豬大腸的嫩度[13]。E組(煮制，再先酶處理后堿處理)相對于C組，蒸煮損失有所下降，原因是蒸煮后的豬大腸，再經酶-堿聯合處理后，蛋白質變性，其得率本身就小于C組。另外，經蒸煮后，再經酶-堿嫩化處理，其嫩化效果小于C組?？赡苁且驗樨i大腸在堿液中表面膜和結締組織被部分破壞，蛋白質結構發生改變。木瓜蛋白酶水解膠原蛋白和彈性蛋白從而增加肉豬大腸的嫩度[14]。因此，綜合考慮選擇嫩化工藝C(先酶處理后堿處理)對豬大腸進行嫩化處理。

圖2 不同嫩化工藝對豬大腸的嫩化效果對比結果Fig.2 Comparison of tenderizing effects of different tenderizing processes on pig large intestine注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 食品級NaOH濃度對豬大腸品質的影響

由圖3-a可知，當NaOH質量濃度在0.6～1.2 g/L時，得率呈現一個逐漸上升的趨勢，之后隨著NaOH濃度上升，樣品得率較NaOH質量濃度為0.6～1.2 g/L時變化小。此時豬大腸吸水最多?？赡茉蚴桥c肉嫩度相關的蛋白在高pH肉中降解速率更快。高pH環境會影響內源蛋白酶的水解活性，從而影響蛋白質的降解速率。蒸煮損失隨著NaOH濃度的變化呈現先下降后上升的趨勢，當NaOH質量濃度達到1.2 g/L時，蒸煮損失最小。由圖3-b可知，NaOH質量濃度在0.6～1 g/L時，剪切力明顯下降。NaOH質量濃度在1～1.2 g/L時，剪切力下降的相對平緩。之后隨著濃度的增加，剪切力明顯下降，并且感官明顯變差?？赡艿脑蚴秦i大腸內部蛋白質和結締組織結構已經遭到破壞。

a-對得率和蒸煮損失的影響；b-對剪切力的影響圖3 食品級NaOH濃度對豬大腸品質的影響Fig.3 Effect of food grade NaOH concentration on the quality of pig large intestine

2.2.2 食品級NaOH處理時間對豬大腸品質的影響

由圖4-a可知，隨著NaOH處理時間的增加，得率呈先上升后下降的趨勢，當NaOH處理時間為24 min時，得率達到最大值，此時豬大腸吸水最多。NaOH處理時間在16～24 min時，蒸煮損失上升不明顯，當NaOH處理時間超過24 min時，蒸煮損失明顯上升，說明此時溫度對豬大腸的持水性有較大的影響。NaOH處理適當時間，能夠使蛋白質溶解暴露親水基團[20]，另外在豬大腸蛋白質偏離等電點時，靜電引力較弱，親水性較強，從而提高豬大腸吸水性。由圖4-b可知，隨著NaOH處理時間的增加，剪切力呈逐漸下降的趨勢，但當處理時間超過24 min后，剪切力迅速下降，豬大腸咀嚼性較差，此時豬大腸內部結構已遭到破壞，嚴重影響食用價值。

a-對得率和蒸煮損失的影響；b-對剪切力的影響圖4 食品級NaOH處理時間對豬大腸品質的影響Fig.4 Effect of food grade NaOH treatment time on the quality of pig large intestine

2.2.3 木瓜蛋白酶處理時間對豬大腸品質的影響

由圖5-a可知，隨著木瓜蛋白酶處理時間的增加，得率呈現先上升后下降的趨勢，當木瓜蛋白酶處理為60 min時達到最大值，此時豬大腸吸水最多。蒸煮損失隨著木瓜蛋白酶處理時間的增加，呈現先下降后上升的趨勢?？赡茉蚴悄竟系鞍酌赣凶罴炎饔脮r間，過度處理會導致蛋白水解過度，保水性下降[21]。當木瓜蛋白酶處理為60 min時達到最大值，此時豬大腸持水性較好。此時豬大腸的結締組織、膠原蛋白等，在木瓜蛋白酶的作用下進行了適當的降解，豬大腸中的肌纖維結構受到了適當的破壞[14]。由圖5-b可知，隨著木瓜蛋白酶處理時間的增加，剪切力呈現先下降后上升的趨勢。當木瓜蛋白酶處理為60 min時達到最小值。

a-對得率和蒸煮損失的影響；b-對剪切力的影響圖5 木瓜蛋白酶處理時間對豬大腸品質的影響Fig.5 Effect of papain treatment time on the quality of pig large intestine

2.2.4 木瓜蛋白酶質量分數對豬大腸品質的影響

由圖6-a可知，當木瓜蛋白酶質量分數為1.2%～1.8%時得率呈現逐漸上升的趨勢。當木瓜蛋白酶質量分數為1.8%～2.0%時，得率略有增加，但是變化不明顯。蒸煮損失隨著木瓜蛋白酶質量分數的增加呈現先下降后上升的趨勢。當木瓜蛋白酶質量分數為1.8%時，蒸煮損失最小，此時豬大腸持水力較好。由圖6-b可知，剪切力隨著木瓜蛋白酶質量分數的增加呈現下降的趨勢，當木瓜蛋白酶質量分數為1.8%～2%時，剪切力略有下降，但變化相對不大。適當質量分數的木瓜蛋白酶會適當酶解肌纖維細胞及其肌間結締組織，破壞豬大腸的原有結構，提高豬大腸保水性和降低剪切力[22-23]，當木瓜蛋白質質量分數過大，作用的底物濃度變化不大，因此變化效果不明顯。

2.3 BP神經網絡預測結果

2.3.1 響應面分析因素和水平選擇

根據響應面實驗設計原理，獲取BP神經網絡訓練模型所需要的訓練、測試和驗證數據。其中NaOH質量濃度中心水平值為1.2 g/L、NaOH處理時間中心水平值為24 min、木瓜蛋白酶處理時間中心水平值為60 min、木瓜蛋白酶質量分數中心水平值為1.8%。響應面優化豬大腸嫩化工藝試驗結果見表3。

a-對得率和蒸煮損失的影響；b-對剪切力的影響圖6 木瓜蛋白酶質量分數對豬大腸品質的影響Fig.6 Effect of papain content on the quality of pig large intestine

表3 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 3 The design matrix and result of Box-Behnken experiments

運用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對表中的數據進行回歸擬合，得到酶-堿聯合處理后感官評分(Y1)與4個因素A、B、C、D的關系為：Y1=8.87+80.68A+0.12B+0.16C+0.087D+0.32AB+0.12AC-0.11AD+0.21BC+0.23BD+0.15CD-1.42A2-0.36B2-1.00C2-0.57D2?；貧w方程中每項系數絕對值的大小反映了各個因素對響應值的影響程度，系數的正負直接反映了對響應面影響的方向。

2.3.2 BP神經網絡結果

利用MATLAB R2016a軟件中的BP神經網絡具箱進行神經網絡模型的構建，最終確定神經網絡的結構為：輸入層為木瓜蛋白酶處理時間、木瓜蛋白酶質量分數、NaOH濃度、NaOH處理時間4個神經元，隱含層有10個神經元，輸出層為綜合感官評分1個神經元。首先用響應面實驗數據進行訓練，執行迭代擬合操作，從圖7中可以看出，BP神經網絡預測模型訓練穩定且收斂迅速，豬大腸的感官評分在迭代6次時，神經網絡預測模型達到最佳性能。

圖7 綜合感官評分的BP模型訓練過程Fig.7 BP model training process of comprehensive sensory score注：在第六步達到最優驗證性能，相應誤差為0.034 4

圖8反映了預測模型訓練測試時，豬大腸嫩化處理后樣品綜合感官評分的預測值與真實值的回歸分析。圖8中可以看出該BP神經網絡模型的訓練、驗證、測試與總體的系數分別為0.999 0、0.993 6、0.989 4 和0.980 8(相關系數R均大于0.95)，說明該神經網絡模型不存在欠擬合狀態，有較好的逼近能力，所構建的BP神經網絡預測模型準確性高[24]。

將本試驗測試的所有參數輸入到已經擬合好的BP神經網絡預測模型與響應面預測的回歸方程中，得到感官評分在設定參數下的值，與實際值對比，計算相對誤差，如表4所示。通過對比BP神經網絡預測模型與響應面預測模型的相對誤差值，得出在29組試驗中，BP神經網絡模型預測的感官評分精準度有21組高于響應面預測模型?？偠灾?，在本試驗中BP神經網絡預測模型優于響應面預測模型。

表4 RSM和ANN預測值及相對誤差值對比Table 4 The comparison of predicted and relative error values between RSM and ANN

2.4 ANN最佳工藝參數確定及優化結果驗證

BP神經網絡結合遺傳算法優化得到最佳工藝參數為NaOH質量濃度為1.40 g/L，NaOH處理時間為26 min，木瓜蛋白酶質量分數為2.0%左右，木瓜蛋白酶處理時間在55 min左右時，豬大腸的感官評分為9.125，高于響應面預測模型的感官評分。表明GA-BP神經網絡預測模型可有效運用到豬大腸酶-堿聯合嫩化工藝研究中。

為進一步驗證BP神經網絡優化結果的準確性，根據實際操作對最優條件進行調整，在NaOH濃度為1.3 g/L，NaOH處理時間為25 min，木瓜蛋白酶質量分數為1.9%、木瓜蛋白酶處理時間在50 min的條件下進行3次驗證實驗，得到嫩化后的豬大腸感官評分為7.949 6，與BP神經網絡預測值相對誤差為4.18%。說明，BP神經網絡預測模型具有較高的準確性。

3 結論

本文首先研究不同嫩化工藝對豬大腸嫩化效果，研究結果表明酶-堿聯合工藝對豬大腸嫩化效果最明顯。在單因素基礎上，根據響應面試驗設計原理，獲取BP神經網絡訓練模型所需要的訓練、測試和驗證數據。并采用遺傳算法進行優化，得到酶-堿聯合嫩化最佳工藝條件為：NaOH質量濃度為1.40 g/L，NaOH處理時間為26 min，木瓜蛋白酶質量分數為2.0%，木瓜蛋白酶處理時間為55 min，在此基礎上進行驗證實驗得到嫩化后的豬大腸感官評分為7.949 6，與模型所預測值相近。表明GA-BP神經網絡預測模型可有效運用到豬大腸酶-堿聯合嫩化工藝研究中,可以為豬大腸的精深加工提供參考。