碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌對頭孢他啶/阿維巴坦的耐藥率及耐藥機制研究

張琦，劉亞婕，閆文娟，荊楠，袁有華，王山梅，李軼*

1 河南省人民醫院檢驗科， 鄭州大學人民醫院檢驗科，河南大學人民醫院檢驗科，鄭州 450003；2平頂山市婦幼保健院檢驗科，平頂山 467000

近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的臨床應用范圍和使用量的不斷增加，碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌（carbapenem～resistantEnterobacterales，CRE）已成為影響全球公共健康的重大問題。美國疾病控制與預防中心將CRE定義為滿足以下任意1個條件的腸桿菌目細菌：①對亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南等任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者；天然對亞胺培南敏感性低的細菌（如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等），需參考除亞胺培南外其他碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏結果。②產生碳青霉烯酶者[1]。據全國細菌耐藥監測網（China Antimicrobial Resistance Surveillance System，CARSS）數據顯示，全國1371所醫院臨床分離的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的平均耐藥率從2013年的4.9%上升至2020年的10.9%[2]。其中，河南省的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem～resistantKlebsiella pneumoniae，CR～KP）檢出率從2014年的9.4%迅速升至2020年的30.2%[2]，且連續多年位居榜首。由于CRE菌株通常合并多種耐藥機制，僅對多黏菌素、替加環素等極少數藥物敏感，且臨床上治療藥物有限，導致CRE感染病死率高、患者經濟負擔大。2019年，新型β～內酰胺類抗菌藥物/β～內酰胺酶抑制劑復合物——頭孢他啶/阿維巴坦（ceftazidime/avibactam，CAZ/AVI）在我國上市，用于治療復雜性腹腔感染、醫院獲得性肺炎（包括呼吸機相關肺炎）和CAZ/AVI敏感、治療方案有限的多重耐藥革蘭陰性菌（包括CRE）引起的感染。本研究通過檢測本院臨床分離的CRE菌株對CAZ/AVI的藥敏情況，分析相關耐藥表型和基因型，初步探討CRE菌株對CAZ/AVI的耐藥機制，以期為臨床精準、合理用藥和耐藥細菌監測提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

收集2020年1月～2021年6月本院臨床分離的CRE菌株[亞胺培南和/或美羅培南耐藥，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）≥4μg/ml]為研究對象，并剔除同一患者相同部位分離的重復菌株，最終納入1692株。

1.2 質控菌株

質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，購于國家衛生健康委臨床檢驗中心。

1.3 試劑

哥倫比亞血平板（安圖生物科技有限公司，批號：20210525B）；MH瓊脂平板（安圖生物科技有限公司，批號：20210414B）；CZA/AVI藥敏紙片（英國Mast公司，批號：472416）；2×Taq PCR Master Mix（上海萊楓生物科技有限公司，批號PT102～02）；PCR引物[生工生物工程（上海）股份有限公司，批號：260098225]；GoldView核酸染色劑（大連美侖生物技術有限公司，批號：Mar～29D）；D2000 DNA Marker（大連美侖生物技術有限公司，批號：MA0179）； 緩沖液（碳青霉烯酶）[珠海迪爾生物工程股份有限公司，批號：20200527，包括3～氨基苯硼酸（phenylboronic acid，PBA）溶液和乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液]；NG TestCARBA 5檢測試劑盒（法國NG Biotech公司，批號：W2012021）。

1.4 儀器

Phoenix～100 全自動細菌鑒定藥敏系統（美國BD公司）；IVD MALDI Biotyper基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜 （MALDI～TOF MS）質譜儀（德國布魯克公司）；T100型PCR儀（美國Bio～Rad 公司） 。

1.5 菌株鑒定

采用 MALDI～TOF MS 和 Phoenix～100 全自動細菌鑒定藥敏系統對菌株進行菌種鑒定。

1.6 藥物敏感性試驗

采用Phoenix～100全自動細菌鑒定藥敏系統檢測22種抗菌藥物（氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、復方磺胺甲唑、環丙沙星、左氧氟沙星、四環素、氯霉素、多黏菌素B、替加環素）的MIC；采用微量肉湯稀釋法進行CAZ/AVI的藥敏試驗。按照美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的M100文件[3]標準對藥敏折點進行判斷， 其 中 CAZ/AVI的 MIC≤8μg/ml為 敏 感，MIC≥16μg/ml為耐藥。

1.7 耐藥表型檢測

采用碳青霉烯酶抑制劑增強試驗測定CRE菌株的耐藥表型。將0.5MCF的CRE菌懸液均勻涂布于MH 瓊脂平板上，每個平板上貼4張亞胺培南紙片，其中1張紙片不滴加任何液體，1張紙片滴加10μl PBA溶液，1張紙片滴加10μl0.1mol/L的EDTA溶液，1張紙片同時滴加PBA和EDTA溶液各10μl。將MH 瓊脂平板置于35℃條件下孵育16～18h，并測定抑菌圈直徑。結果判讀標準：若滴加PBA溶液使抑菌圈直徑擴大5mm以上，判斷為產A類碳青霉烯酶；若滴加EDTA溶液使抑菌圈直徑擴大5mm以上，判斷為產B類碳青霉烯酶；若同時滴加PBA和EDTA溶液使抑菌圈直徑擴大5mm以上，則判斷為同時產A類和B類碳青霉烯酶[1]。

1.8 碳青霉烯酶耐藥基因檢測

采用酶免疫層析技術快速檢測肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiellapneumoniaecarbapenemase，KPC）、新德里金屬β～內酰胺酶（New Delhi metallo～β～lactamse，NDM）、 維 羅 納 整 合子編碼的金屬β內酰胺酶（Verona integron～encoded metallo～β～lactamase，VIM）、 亞 胺 培南酶型金屬β～內酰胺酶（imipenemase～type metallo～β～lactamase，IMP）和苯唑西林酶 ～48（oxacillinases～48，OXA～48）5種碳青霉烯酶，按照NG TestCARBA 5檢測試劑盒產品說明書操作。采 用 PCR 方 法 檢 測blaKPC，blaNDM，blaIMP，blaVIM，blaOXA～48～like5種最常見的碳青霉烯酶耐藥基因，引物設計參考文獻方法[4]，并由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 反應體系為20μl，包括2×Taq PCR Master Mix 10μl，上游引物及下游引物各 1μl，DNA 模板 2μl，ddH2O6μl。PCR 反應條件：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共30個循環；72℃延伸4min。PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）有限公司測序，序列經BLAST數據庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行比對分析。

1.9 blaKPC-2基因表達水平檢測

以5株CAZ/AVI耐藥、僅攜帶blaKPC～2基因的CR～KP菌株為實驗組（MIC≥16mg/L）。采用隨機數字表法，隨機選取6株CAZ/AVI敏感、僅攜帶blaKPC～2基因的CR～KP菌株為對照組（MIC≤0.5mg/L），采用實時熒光定量PCR（real～time quantitative PCR，RT～qPCR）檢測兩組blaKPC～2基因表達水平。熒光反應體系：cDNA 1μl，Primer F 0.5μl，Primer R 0.5μl，SYBR Green Master 12.5μl，RNase～free water 10.5μl。PCR反應條件：95℃預變性10min；95℃變性10s，60℃退火 40s，共 40個循環；95℃ 15s；60℃ 1min；95℃ 30s；60℃ 15s。管家基因pgi作為內部參照基因，采用Δ ΔCT相對定量模型，每個細菌的RNA均提取3次，cDNA檢測時重復3孔。

1.10 統計學方法

基因的相對表達量采用雙尾成組t檢驗，并進行Welch校正。P＜0.05為具有統計學差異。采用GraphPad Prism V 9.3.1對數據進行統計分析及制圖。

2 結果

2.1 CRE菌株對CAZ/AVI的耐藥性

2020年1月～2021年6月期間本院共收集1692株CRE菌株，CAZ/AVI耐藥菌株共101株，總體耐藥率為6.0%。其中，CR～KP的耐藥率僅為2.9%；大腸埃希菌的耐藥率為30.1%；雷氏普羅威登斯菌和弗勞地枸櫞酸桿菌的耐藥率均高于40%。在CAZ/AVI耐藥的CRE菌株中，CR～KP（29株，28.7%）居首位，大腸埃希菌（25株，24.8%）、陰溝腸桿菌（19株，18.8%）次之。見表1。

表1 CAZ/AVI耐藥的CRE菌株種類分布和數量

2.2 CAZ/AVI耐藥的CRE菌株藥敏情況

101株CAZ/AVI耐藥的CRE菌株對青霉素類、頭孢類抗菌藥物全部耐藥；對氨曲南、亞胺培南、美羅培南和多黏菌素的耐藥率分別為73.3%、99.0%、100%和3.2%；對替加環素全部敏感。詳見表2。

表2 101株CAZ/AVI耐藥的CRE菌株的藥敏試驗結果

對保留的32株CAZ/AVI耐藥的CRE菌株進行測定，其CAZ/AVI的MIC分布范圍是16～128μg/ml，MIC50為＞128μg/ml，MIC90為 ＞128μg/ml。見表3。

2.3 CAZ/AVI耐藥的CRE菌株耐藥表型和基因型

對32株CAZ/AVI耐藥的CRE菌株進行碳青霉烯酶抑制劑增強試驗，結果提示單產金屬酶19株（59.4%），絲氨酸酶聯合金屬酶7株（21.9%），單產絲氨酸酶5株（15.6%），酶型陰性1株（3.1%）。進一步通過酶免疫層析法、PCR及測序發現，32株CRE菌株攜帶的碳青霉烯酶基因分別為：blaNDM～1（12 株，37.5 %）、blaNDM～5（7 株，21.9%）、blaKPC～2聯合blaNDM～1（5 株，15.6%）、blaKPC～2聯合blaNDM～5（2 株，6.3%）、blaKPC～2（5 株，15.6%）以及blaKPC～33（1株，3.1%）。單產金屬酶的CRE菌株中，12株攜帶blaNDM～1基因，以CR～KP和陰溝腸桿菌為主；7株攜帶blaNDM～5基因，以大腸埃希菌為主。同時產絲氨酸酶和金屬酶的CRE菌株均為CR～KP，以攜帶blaKPC～2、blaNDM～1基因為主。單產絲氨酸酶的CRE菌株均為攜帶野生型blaKPC～2基因的CR～KP；酶型陰性的1株為CR～KP，同時酶

免疫層析法檢測也為陰性，經PCR和測序證實為攜帶blaKPC～33基因。提高AVI濃度至 8μg/ml后，6株單產KPC酶的CR～KP對CAZ/AVI的MIC均下降至敏感水平，其中攜帶blaKPC～2基因的CR～KP菌株 MIC 下降至 0.25～1μg/ml，攜帶blaKPC～33基因的CR～KP菌株MIC下降至8μg/ml；單產金屬酶以及產金屬酶聯合絲氨酸酶的CRE菌株中，僅有4株菌株的MIC有所下降，但仍表現為耐藥。見表3。

表3 32株CAZ/AVI耐藥的CRE菌株對CAZ/AVI的藥敏試驗結果及耐藥表型和基因型特征

續表

2.4 CAZ/AVI耐藥、單產KPC-2酶的CR-KP菌株blaKPC-2基因表達情況

以5株CAZ/AVI耐藥（MIC≥16μg/ml）且單產野生型KPC～2酶的CR～KP菌株作為實驗組，隨機選取6株CAZ/AVI敏感（MIC≤0.5μg/ml）且單產野生型KPC～2酶的CR～KP菌株作為對照組，采用RT～qPCR方法檢測兩組blaKPC～2基因的表達水平。結果表明實驗組blaKPC～2基因相對表達量（17.48±9.94）高于對照組（4.12±3.44，P=0.0368）。見圖1。

圖1 CAZ/AVI實驗組和對照組blaKPC-2基因表達水平比較

3 討論

3.1 CRE菌株對CAZ/AVI的耐藥性分析

CAZ/AVI是第三代頭孢菌素和新型非β～內酰胺酶類的β～內酰胺酶抑制劑相結合的復合物，2015年由美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市，2019年5月由我國國家藥品監督管理局批準上市。AVI與經典β～內酰胺酶抑制劑（克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦）不同，其結構不含β～內酰胺環，?；磻赡?，可開環后再環合，進而顯著增強頭孢他啶的抗菌活性，對產A類酶（KPC等）、C類酶（AmpC）和部分D類酶（OXA～48）等絲氨酸酶的菌株具有高度抗菌活性，但對產B類酶（金屬酶）的菌株無抗菌活性[1]。

CAZ/AVI對腸桿菌目細菌等革蘭陰性桿菌顯示出較好的抗菌活性。國外多項研究報道表明腸桿菌目細菌對CAZ/AVI的耐藥率為0%～1.8%[5]。來自美國、歐洲和拉丁美洲的研究數據表明產超廣譜β～內酰胺酶（extended spectrum～β～lactamases，ESBLs）的腸桿菌目細菌耐藥率為0%～0.1%，CHINET CRE細菌耐藥率為 0%～18%[6～9]。我國 2017 年 CHINET 中國細菌耐藥監測網數據顯示，1774株腸桿菌目細菌對CAZ/AVI的耐藥率為5.4%，372株CRE菌株的耐藥率為24.7%[10]。本研究中，1672株CRE菌株對CAZ/AVI的整體耐藥率為6.0%，低于CHINET數據（24.7%），與美國和意大利的研究結果相近，均低于 10.0%[11～12]。CRE 菌株中，CR～KP 占比最高（1000株，59.1%），對CAZ/AVI的耐藥率為2.9%，與 Zhang 等[13]和 Galani等[14]的研究結果類似，低于CHINET數據（15%）[10]。CRE菌株中的大腸埃希菌、陰溝腸桿菌和產酸克雷伯菌對CAZ/AVI的耐藥率相當（P＞0.05），與Zhou等[15]報道的南京市CRE菌株對CAZ/AVI的耐藥率（21.6%）較為接近。

3.2 CRE菌株對CAZ/AVI的耐藥機制

3.2.1 產金屬酶

AVI是一種基于二氮雜二環辛烷（diazabicyclooctane，DBO）的絲氨酸酶抑制劑，可抑制A類酶、C類酶和部分D類酶等絲氨酸酶的表達，但是對金屬酶無抑制作用或僅表現為微弱的結合作用[16～17]。鋅離子依賴的金屬酶與絲氨酸酶結構不同，不具有親核絲氨酸殘基[18]。B1亞類（NDM～1，SPM～1，BcII，VIM～1，VIM～2 和VIM～4等）、B2亞類（CphA等）和B3亞類（L1，FEZ～1等）的金屬酶都可以催化AVI發生水解，從而表現為對 CAZ/AVI耐藥[17，19]。

本研究中CRE菌株對CAZ/AVI產生耐藥性的最主要原因是產金屬酶（26株，81.3%），包括單產金屬酶菌株（19株，59.4%）和產金屬酶聯合絲氨酸酶菌株（7株，21.9%）。26株產金屬酶的CRE菌株均為NDM型，且以NDM～1（17株，65.4%）為主，NDM～5（9株，34.6 %）次之。大腸埃希菌以單產NDM～5酶為主，陰溝腸桿菌以單產NDM～1酶為主，肺炎克雷伯菌以產KPC～2酶聯合NDM～1酶為主，耐藥基因在不同細菌種類的分布與CHINET數據一致[10]。產NDM～1酶和NDM～5酶的CRE菌株對CAZ/AVI的MIC均表現為高水平耐藥，即使將AVI濃度提高到8μg/ml，仍不能有效降低MIC，提示NDM～1酶和NDM～5酶對AVI都具有高度水解作用。

3.2.2 blaKPC-2基因高表達

盡管CAZ/AVI對KPC酶有強抑制作用，但有研究發現某些CR～KP菌株中blaKPC基因的高表達也會導致菌株對 CAZ/AVI耐藥[13，20]。Zhang 等[13]研究發現，32株CAZ/AVI耐藥的CR～KP菌株中，有12株（37.5%）僅攜帶blaKPC～2基因、不產金屬酶，與CAZ/AVI敏感的CR～KP菌株相比，blaKPC～2基因的相對拷貝數和相對表達量分別升高2.5倍和2.7倍。Humphries等[20]報道了1例未使用CAZ/AVI治療的患者，其血液中分離出攜帶blaKPC～3基因的CR～KP菌株，且對CAZ/AVI呈現低水平耐藥（MIC為32μg/ml），與自身分離的CAZ/AVI敏感CR～KP菌株相比，blaKPC～3基因的相對表達量升高（3.8±0.2）倍。Shen等[21]研究發現，在24株CR～KP菌株中，與2個對照組（MIC為1～2μg/ml 和 MIC≤0.5μg/ml）相比，CAZ/AVI的 MIC 升高組（4～8μg/ml）的blaKPC～2基因相對表達水平分別升高4.2倍和4.8倍（P＜0.05）。本研究的18株CAZ/AVI耐藥CR～KP菌株中，66.7%的菌株單產金屬酶或產金屬酶聯合絲氨酸酶，表現為對CAZ/AVI的高水平耐藥（MIC≥64μg/ml）；33.3%的CR～KP菌株單產野生型KPC～2酶，表現為對CAZ/AVI的低水平耐藥（MIC為16μg/ml），其blaKPC～2基因表達水平比CAZ/AVI敏感株升高4.24倍；提高AVI濃度（8μg/ml）后，可降低CAZ/AVI對菌株的MIC，使其恢復到敏感水平。該結果提示，本研究所分離的CR～KP菌株中，單產或合并產金屬酶可能是其對CAZ/AVI耐藥的主要原因，此外部分CR～KP菌株由于blaKPC～2基因高表達導致低水平耐藥，與國內外研究較一致[13，20]。

3.2.3 blaKPC基因突變形成不同亞型

自CAZ/AVI上市以來，國內外已有研究發現少數患者應用治療一段時間后，體內CR～KP菌株的KPC酶Ω環發生氨基酸的替換等變化，對CAZ的水解能力顯著增強，且不被AVI抑制，從而由CAZ/AVI敏感的野生型KPC酶，變為CAZ/AVI耐藥的KPC亞型[5，22]。其中，最常見的是Ω環上179位點出現酪氨酸對天冬氨酸的替換（D179Y），形成新的KPC酶亞型，即KPC～33。 Gaibani等[23]報道了1例意大利患者使用CAZ/AVI治療17天后，攜帶blaKPC～3基因的CR～KP菌株發生了D179Y突變，對CAZ/AVI從敏感變為耐藥。Giddins等[24]報道了1例美國患者接受CAZ/AVI治療12天后，攜帶blaKPC～2基因的 ST307型 CR～KP 菌株發生D179Y和532G→T突變，CAZ/AVI的MIC由3μg/ml升高為256μg/ml。我國上海、河南和北京也先后報道了肺炎克雷伯菌經過CAZ/AVI暴露后，blaKPC～2基因發生D179Y突變，野生型KPC～2酶變成KPC～33亞型，表現為對CAZ/AVI耐藥，但是對碳青霉烯類抗菌藥物敏感[25～27]。本研究中，有1株CR～KP菌株攜帶blaKPC～33基因，對CAZ/AVI高水平耐藥（MIC為64μg/ml），對亞胺培南敏感（MIC為1μg/ml），該菌株的基因型和藥敏特征與國內外研究相符[23～27]。同時，攜帶blaKPC～33基因的CR～KP菌株在碳青霉烯酶抑制劑增強試驗和酶免疫層析法檢測中都表現為陰性，僅可通過PCR和測序的方法得以鑒別。該結果提示在臨床工作中，如果遇到表型試驗和藥敏結果不相符的情況，需進一步通過PCR或測序等方法確證。

除D179Y突變外，目前已有報道表明多種不同blaKPC基因突變導致的KPC酶亞型出現，例如KPC～3發生A172T突變成為KPC～39[28]；KPC～3的276和277位之間插入3個氨基酸谷氨酸～丙氨酸 ～ 纈氨酸（Glu～Ala～Val）變為 KPC～50[29]；KPC～2發生D179N、Y241H、H274N突變成為KPC～51；KPC～2發生 D179Y突變和262位插入纈氨酸變為 KPC～52[30]；KPC～2的 267和 268位之間插入脯氨酸～天冬酰胺～天冬酰胺～精氨酸～丙氨酸（Pro～Asn～Asn～Arg～Ala）5個氨基酸變為KPC～93[31]等。這些新的KPC亞型通常在患者使用CAZ/AVI治療后出現，極少數在未接受CAZ/AVI治療的患者中出現。但KPC發生天然突變的概率較低，且目前關于KPC亞型的研究多為個例報道，尚有待進一步觀察。

4 小結

本研究尚具有一定局限性。首先，本研究為單中心研究，且樣本數量較少，不能代表河南省的整體情況；其次，本研究檢測了CRE菌株的常見碳青霉烯酶基因，但是對ESBLs、膜孔蛋白和外排泵的情況未做進一步檢測，不能全面闡釋耐藥機制；最后，對耐藥菌株的分型和質粒特征未進行檢測，不能分析其流行和傳播情況。

綜上所述，本研究通過檢測本院CRE菌株對CAZ/AVI的藥物敏感性，表明CRE菌株對CAZ/AVI的整體耐藥率較低，且低于我國平均水平。進一步的表型試驗及耐藥基因檢測結果提示，CRE菌株對CAZ/AVI耐藥的最主要原因是產生NDM型金屬酶，部分CR～KP菌株可能由于blaKPC～2基因高表達或者KPC酶Ω環發生突變成為KPC～33等不同亞型而對CAZ/AVI耐藥。