急性肺損傷炎癥反應失控所致的系統代謝紊亂及其發生機制

劉洋洋，姚杰然，林佳穎，丁瑩瑩，范 羽，倉 靜，冒海蕾

復旦大學附屬中山醫院麻醉重癥醫學科，上海 200032

急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是由嚴重感染、創傷等非心源性疾病誘發，以肺部炎癥和通透性增強為主要表現的臨床綜合征。肺組織通透性增強導致彌漫性肺間質及肺泡水腫，如不糾正就會導致急性缺氧性呼吸衰竭，即急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome, ARDS） 的發生［1-2］。ALI 進展為ARDS 是連續進行性的快速病理過程，臨床常難以分清。ALI 是全身炎性反應綜 合 征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）的肺部表現。SIRS 本質是機體遭遇嚴重損傷時的自我防御反應，如果炎癥反應失控，就可能影響重要臟器的功能。SIRS 失控通常首先打擊肺，導致ALI，甚至ARDS，促發器官序貫損傷且難以逆轉［3］。ALI 的發生與SIRS 的惡性進展密切相關。

機體受到外界強烈損傷因素打擊后，進入高度應激狀態，分泌大量激素與炎癥介質，進而誘發代謝改變。此外，組織器官灌注、患者活動狀態和營養支持等也影響機體代謝，患者可表現為高分解代謝紊亂，進一步加重器官功能障礙［3］。危重患者的代謝改變涉及糖、蛋白質、脂類物質合成與分解的多種途徑，引起細胞、器官功能的改變。因此，對炎癥反應失控進展過程中代謝物的變化進行動態、定量監測，有助于闡明ALI 發生發展中代謝模式的變化規律和分子機制。

NMR 代謝組學能實現對體液樣品快速、非破壞性、重復的定量分析，對危重病的早期診斷具有明顯優勢［4-8］。本課題組前期研究［6］證實，通過血清NMR 譜能區分臨床危重病患者早期和后期的代謝紊亂狀態。然而，目前有關ALI/ARDS 患者代謝物研究［9-10］中的對照組各異，結果不一致，且均未涉及炎癥反應早期患者的SIRS 狀態。

因此，本研究以外傷致SIRS 及ALI/ARDS 患者為研究對象，采用基于NMR 的代謝組學技術，通過其血清高分辨1H-NMR 譜圖，結合多種模式識別方法，量化分析SIRS 患者炎癥失控至ALI/ARDS 過程中整體代謝組變化，從而尋找疾病進程中主要代謝物改變及關鍵調控網絡，為闡明導致肺損傷代謝紊亂發生的分子機制提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2012 年9 月至2017 年9 月就診于復旦大學附屬中山醫院的創傷危重患者，均為男性，均因車禍、工傷、燒傷等原因入院。SIRS 診斷依據美國胸科學會（ATS）標準。ALI/ARDS 診斷依據歐洲呼吸與美國胸科學會（ERS/ATS）標準：（1）急性起??；（2）氧合指數降低（ALI：≤300 mmHg，ARDS：≤200 mmHg）；（3）X 線示雙肺浸潤影；（4）肺動脈楔壓≤18 mmHg 或無左房高壓的臨床證據。排除標準：（1）惡性腫瘤；（2）內分泌疾病，如糖尿病、甲亢；（3）病理性肥胖（體質量大于正常20%）；（4）既往有慢性器官功能障礙。選擇性別、年齡匹配且在2 周內未患任何疾病的體檢健康者作為對照。研究獲本院倫理委員會批準（B2012-56R）；研究對象均簽署知情同意書。

1.2 血液樣本采集 研究對象均禁食或停止腸內/腸外營養 8 h 后清晨采血。SIRS 組、ALI/ARDS 組在確診3 d 后采集。所采血液于室溫下自然凝固，離心后收集上層血清，－80 °C 保存備用。

1.31H-NMR 譜測定 血清解凍，離心后吸取500 μL上清，移入 5 mm NMR 專用試管中，加入 50 μL 重水，在振蕩器上混勻。在 Varian Unity INOVA 600 MHz 核磁共振譜儀上，用CPMG （Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列采集1H-NMR 譜。采用預飽和法壓制水峰，298 K 實驗溫度，1.64 s 采樣時間，4 s 弛豫延遲時間。每幅 NMR 譜采集 128 個自由感應衰減信號（free induction decay，FID），每個 FID 收集 32 000 個數據點，充零到 64 000 個數據點。指數窗函數采用0.3 Hz 的線寬進行傅立葉變換。相位和基線校正后，參照乳酸的甲基共振峰（δ1.33），對譜圖的化學位移進行定標。

1.4 NMR 譜數據處理1H-NMR 譜（δ 0.2～10）以0.04/106為單位劃分為245 個等寬區域，對各區域進行分段積分。再對各積分數據進行歸一化，以消除樣品濃度、pH、離子強度等的影響。為了消除飽和水峰引起的譜線差異，以及與溶劑交換質子后部分飽和轉移所致的尿素信號差異，將δ 4.5～6.0 設為 0 積分段。

1.5 模式識別分析 模式識別分析采用SIMCAP 12（Umetrics AB，瑞典）軟件。設置 245 個分段積分值為自變量、疾病類別為反應變量，分別進行無監督的主成分分析（principal component analysis, PCA）、有監督的偏最小二乘法-判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）［11］。

1.6 代謝物指認和代謝通路分析 導出所建PLSDA 模型對應的變量重要性（variable importance in projection, VIP）與回歸系數（centered and scaled coefficients, CoeffCS），篩選出與疾病分類相關的NMR 積分區段，再結合原始譜圖，指認肺損傷發生相關的代謝物。以VIP＞1 為標準（一般采用VIP＞0.7），增加統計學可信度和縮小主要NMR積分區段范圍，便于代謝物的指認。

熱圖的繪制主要通過R 語言程序包（MetaboAnalyst 5.0）中聚類函數完成。將NMR積分區段數據導入程序，Distance measure 設置為Euclidean，Clustering options 選擇對列數據進行聚類（Cluster column），聚類方法選擇Complete，Scale method 選擇標準化（Normalized）［12］。

采 用 MetaboAnalyst 5.0 軟 件， 將 NMR 積 分區段數據導入網站通路分析模塊。先對數據進行縮放變換，再選擇Global test 算法進行代謝通路富集分析。通過代謝通路富集分析計算代謝物參與每個特定通路的P 值，P 值越小，代謝通路價值越有統計學意義［13］。并進行通路拓撲分析，以獲得代謝物對通路影響程度的大小，即通路影響因子（Impact），其值越大代表代謝物所在通路的重要性越大。

1.7 統計學處理 采用SPSS 25.0 進行統計分析。數據以x±s 表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。所有檢驗均為雙側，檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 臨床及血生化指標 共入組41 例男性患者，其中創傷致SIRS 患者19 例，平均年齡（59.89±20.33）歲；創傷致ALI/ARDS 22 例，平均年齡（62.14 歲±12.72）歲。結果（表1）顯示：SIRS 患者APACHE Ⅱ評分及生化指標改變程度較??；與SIRS 患者相比，ALI/ARDS 患者血乳酸、血糖、降鈣素原、C 反應蛋白更高（P＜0.01）。

2.2 基于NMR 的代謝組學技術對肺損傷發生的判別分析 結果（圖1）顯示：PCA 法及PLS-DA法分析示，創傷致ALI/ARDS 患者血清NMR 譜明顯不同于健康人。PCA 分析無法區分創傷致ALI/ARDS 與 SIRS 患者血清 NMR 譜；PLS-DA 法分析可區分SIRS 患者發生ALI 甚至ARDS 后的代謝模式遷移改變，說明肺損傷導致機體發生缺氧相關代謝改變。

2.3 肺損傷發生相關的代謝物及代謝通路

2.3.1 熱圖展示患者1H-NMR 譜 熱圖（圖2）顯示患者總體血清氫譜的聚類差別，其中SIRS 患者以左上區域的NMR 信號增強為主，ALI 與ARDS患者以右下方信號增強為主，提示兩組患者血清代謝物存在差異。

2.3.2 主要NMR 積分區段及對應的代謝物指認 結果（表2、表3、圖3A）顯示：根據PLSDA 模型對應的變量 VIP 及 CoeffCS，SIRS 組患者血清NMR 氫譜積分區段為 δ7.18～7.22 和 δ1.90～1.94，主要為酪氨酸、賴氨酸等生酮氨基酸的譜 峰；ALI/ARDS 組 積 分 區 段 為δ1.02～2.50 和δ3.02～4.14，主要代謝物為乳酸、纈氨酸、精氨酸、谷氨酸等多種生糖氨基酸，以及丙酮酸、肌酸、脂質的脂肪酸、甘油等譜峰。SIRS 患者以生酮氨基酸升高為主，提示炎癥反應促使脂肪氧化代謝加速；肺損傷發生時，生糖氨基酸升高更顯著，說明缺氧促進糖異生/糖酵解以快速為生物體供能。

表3 影響ALI/ARDS 與SIRS 分類的主要NMR 區段及對應代謝物

2.3.3 代謝通路富集分析 根據上述指認的ALI/ARDS 相關代謝物（圖3A），進行代謝通路富集分析，共篩選出11 個代謝通路，其中氨酰tRNA合成、氰基氨基酸代謝、氮代謝、卟啉葉綠素代謝、谷胱甘肽代謝及半乳糖代謝的影響強度值均約為0，說明其對疾病發生的影響??；糖酵解、糖異生、丙酮酸代謝、甘油酯代謝、精氨酸代謝、初級膽汁酸合成等通路的激活參與肺損傷發生（圖3B）。

3 討 論

ALI/ARDS 是ICU 患者死亡的重要原因，是嚴重創傷等因素誘發全身炎癥反應的肺部表現。本研究從整體代謝組入手，對創傷致SIRS 與ALI/ARDS 患者的血清NMR 氫譜進行PLS-DA 模式識別分析，監測到炎癥反應失控導致肺損傷時的系統代謝改變。如果炎癥反應失控影響肺泡上皮及其表面活性物質，則會引起肺損傷，導致呼吸功能障礙，機體缺氧。此時無氧糖酵解產生的ATP 成為主要熱量來源，以提供呼吸肌及應激反應所需的能量；丙酮酸為糖酵解終產物，缺氧時在細胞漿中還原成乳酸供能。丙酮酸的來源除了糖酵解，還可由丙氨酸通過轉氨基作用生成。同時，丙酮酸、乳酸、氨基酸、甘油等非糖物質可通過糖異生轉變為糖原或葡萄糖，為糖酵解提供物質來源。此外，纈氨酸水平增加可能與肺損傷時肺泡表面活性蛋白C 的水解有關［14］。脂質可通過PI3K/AKT/NF-κB 通路參與機體氧化應激，為ARDS 發生的獨立標志物之一［15-16］。本研究表明，糖酵解、糖異生、丙酮酸代謝、甘油酯代謝作為主要的代謝通路，協同推進肺損傷進程。這些代謝改變與臨床上肺損傷患者血糖與乳酸升高、氧合指數降低符合，而肺損傷時缺氧所致的二氧化碳潴留及乳酸的積聚可共同促使機體酸中毒［17］。

肺損傷時，精氨酸代謝活化與尿素、肌酸及NO 的產生有關。蛋白質分解產生的氨基酸增多，相應升高的血氨則須通過精氨酸介導的鳥氨酸循環生成尿素后排出。同時，精氨酸和脯氨酸為應激壓力物質，皆為生糖氨基酸，在炎癥進展中為機體能量的來源之一［18］。谷氨酸除參與精氨酸代謝外，還與T 細胞介導的免疫調節相關。谷氨酸水平升高與ARDS 患者的代謝功能障礙相關［19］。缺氧導致呼吸困難，呼吸肌過度運動又促進肌酸產生，肌酸最終轉變為肌酐。NO 作為應激活性物質，通過精氨酸-NO 通路在ALI/ARDS 中發揮重要的調節作用［20］。這些代謝紊亂與ALI/ARDS 患者尿素氮、肌酐指標的升高有關。

初級膽汁酸在肝臟中由膽固醇轉化而來，可能與脂肪動員甘油酯分解產生的脂肪酸增多及丙酮酸生成增加有關。同時，隨著炎癥反應進展，肝臟還需要將更多的葡萄糖轉化為脂肪酸和脂質。這些代謝過程都會加重肝臟負擔，導致肝內膽汁淤積，甚至肝功能障礙，從而使肺損傷患者出現總膽汁酸、轉氨酶、膽紅素等臨床指標的升高。

根據鑒定到的代謝物及代謝通路，結合臨床指標，本研究推測肺損傷發生的代謝紊亂機制為：在創傷等因素打擊下，機體處于高度應激狀態，炎癥細胞和炎癥因子網絡共同推動炎癥反應進展，引發體內一系列代謝改變。早期階段，糖原和骨骼肌蛋白質分解，導致血液中糖和氨基酸升高；隨著炎癥反應進展，儲存的脂肪動員并氧化為主要熱量來源，以代替消耗性糖原和蛋白質，作為血液中脂肪分解終產物的游離脂肪酸和甘油隨之增加?？傊?，全身炎癥反應導致機體發生以高分解代謝為特征的代謝紊亂（圖4）。

圖4 SIRS 患者肺損傷發生時可能的代謝紊亂機制

綜上所述，本研究提示，創傷等應激因素打擊下，體內炎癥細胞與炎癥因子網絡被激發導致全身炎癥反應，誘發糖、蛋白質、脂類物質高分解代謝；一旦炎癥反應影響肺泡，導致肺泡上皮和表面活性物質改變，就會引起呼吸功能障礙，導致機體缺氧、二氧化碳潴留，繼而引發以糖酵解、糖異生、丙酮酸代謝、甘油酯代謝、精氨酸代謝、初級膽汁酸合成等通路激活為特征的系統代謝紊亂。本研究表明通過血清1H-NMR 譜能識別創傷致SIRS 至發生ALI/ARDS 后患者的代謝改變情況。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。