普通硅肥與納米硅肥對烤煙內生真菌種群結構的影響

穆耀輝，婁慧敏，程亞倩，王軍霞，鄧金華，鄭 璽，葉愛萍，黃金輝，艾綏龍，王平平，張立新

(1. 陜西省煙草公司商洛市公司，陜西 商洛 726000；2. 西北農林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌 712100；3. 陜西省龍草坪林業局，陜西 楊凌 712100；4. 陜西省煙草科學研究所，陜西 西安 710000)

0 引言

硅是存在于地殼中的元素，其含量高達31%，是僅次于氧的第二大元素[1～2]。在自然界中，硅在不同地區土壤中含量不同，在不同種屬間也不同。在孫德權等人的研究中，納米硅可以被植物的根部吸收，進入到細胞內部后，再被轉運到各個細胞器，組成細胞組分或調節植物的生長發育等，還可通過共質體或質外體途徑遷移，并在植物不同組織中進行積累[3]。孫夢夢等的研究中，硅元素具有許多調控作用，如調控植物抗逆性、光合作用以及對植株中鎘的化學形態和分布的調控[4]。此外，硅肥能為作物提供硅營養、調節土壤中的氮磷鉀等養分供給、增加作物抗非生物脅迫以及生物脅迫的能力，促進植物生長，改善作物的品質[5]。在逆境脅迫下，硅對植物生長的影響廣泛，如抗旱[6]、抗鹽[7]、抗病[8]、抗重金屬[9]、抗蟲[10]等。

植物內生真菌是指生活在植物組織中的微生物，包括細菌和真菌，他們并不會明顯損害植物[11]。經過多年的進化歷程，植物內生真菌與植物形成互利共生的關系，內生真菌通過刺激植物產生某些植物激素，從而使其能夠抵御某些蟲害、病害、非生物脅迫等[12]。一些內生真菌存在于植物組織的全部或部分生命周期，并可能保護植物宿主免受病原體、昆蟲食草動物甚至非生物脅迫的危害，如干旱、熱、鹽度等[13～15]。

據估計，在大約30萬種陸地植物物種中，分布著超過100萬種植物內生真菌[16]。某些內生真菌能夠產生與其植物宿主相同或相似的活性物質，這為這類活性物質的提取提供了巨大的便利；也使得植物內生真菌在尋找新藥方面得到廣泛應用，作為抗菌劑應用于市場[11,17]。目前，關于烤煙內生真菌對其化學成分及香氣物質等品質的影響的研究較多，而對其內生真菌群落結構的影響及其影響機制的研究較少。因此，筆者以煙草為研究材料，對其葉片內生真菌進行提取及高通量測序，從不同水平分析對煙葉內生真菌群落組成及結構的影響，利用RDA分析烤煙煙葉化學成分及致香物質與群落組成的相關性，以期明確施硅對煙草內生真菌種群結構的影響，進一步為相關研究提供研究材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地

烤煙由陜西省煙草科學研究所提供，品種為云煙99，種植于陜西省商洛市洛南縣永豐鎮。其土壤類型為黃棕壤土，基本性質:pH=5.43，有機質含量11.35 g/kg，速效氮、磷、鉀含量分別為52.76 g/kg，26.08 g/kg，126.00 g/kg。普通硅肥采用寶來化肥有限公司(煙臺)，主要成分為硅酸鈉，硅含量15%。納米硅采用山東優索化工科技有限公司，顆粒直徑范圍為8～15 nm，主要成分為SiO2,硅含量為30%。

1.2 試驗設計與樣品處理

田間試驗采用隨機區組設計，肥料施用按當地標準進行，施用量為2 250 kg/hm2處理設置分別為CK(噴施清水)、T5(0.17 kg/hm2普通硅)、T8(0.32 kg/hm2納米硅)。每個處理重復三次，小區面積91.2 m2，植煙160 株，分別于旺長期、現蕾期、圓頂期噴施。在成熟期采集煙株樣品，每個處理選取三片具有代表性的中部煙葉(從下向上數第十片葉)，放入冷鏈箱中，用于后續煙葉內生真菌高通量測序。

1.3 DNA提取與高通量測序

樣品送往美吉生物公司進行內生真菌的高通量測序。測序前用流動水多次進行沖洗，確保干凈，無污物。隨后對其表面進行消毒，使用75%乙醇浸泡1 min，1%次氯酸鈉3 min，消毒期間不斷搖晃，使消毒試劑與煙葉充分接觸，后用無菌水洗滌3 次，用第三次清洗水進行平板涂布，確認消毒徹底后進行DNA的提取和高通量測序。

1.4 數據分析

數據分析參考謝紅煉等人的方法[18]。數據優化使用Flash(Vertion1.2.11)、Qiime(Vertion1.9.1)、Fastp(Vertion0.19.6)進行分析。OTU序列聚類、統計、注釋使用Uparse(Vertion7.0.1090)、Usearch(Vertion7)、RDP Classifier(Vertion2.11)進行分析。隨后，再將分類好的OTU序列與真菌ITS數據庫UNITE(Vertion8)進行比對，統計各樣本在不同分類水平(Domain(域)，Kingdom(界)，Phylum(門)，Class(綱)，Order(目)，Family(科)，Genus(屬)，Species(種))上的物種組成。樣品Alpha多樣性分析使用分析軟件Mothur(Vertion1.30.2)進行。通過Student’s t檢驗(Student’s t test)來檢驗指數組間差異。NMDS分析利用軟件Qiime(Version1.9.1)對數據進行分析。最后，用VIF方差膨脹因子分析篩選去掉無用的環境因子(VIF值大于10)后，對數據進行RDA分析(R語言vegan包中RDA分析和作圖)。

2 結果與分析

2.1 硅及納米硅對烤煙煙葉內生真菌群落多樣性的影響

由圖1可知，隨著樣品序列的增多，曲線呈先增高后逐漸趨于穩定的狀態?？梢娫诒驹囼炛?，測序序列數目選用較合理，再增加序列數目，OTU數目的變化并不是很大。在內生真菌OTU稀釋曲線中，CK噴施清水、T5噴施硅、T8噴施納米硅，可看出噴施硅和納米硅后，內生真菌數目逐漸下降，多樣性降低。

圖1 不同處理烤煙葉片內生真菌OTU稀釋曲線

對烤煙內生真菌的9 個樣本進行高通量測序后，其原始序列數目及有效序列數目分別如表1所示。將表中有效序列進行97%一致性聚類分析后，發現其OTUs在123-326之間；進行α多樣性指數比對分析后，發現其Chao指數沒有顯著性差異，在124.88-195之間，相較于CK組來說，群落豐富度降低，但不顯著。通過Shannon指數來看，差異較顯著，說明噴施納米硅使群落中物種多樣性顯著高于硅。通過比較simpson指數，發現噴施硅及納米硅后，其數值降低，但差異不顯著?？傮w來看，在一定程度上，噴施硅及納米硅使烤煙內生真菌的豐富度降低，多樣性增加。

表1 測序數據及α多樣性指數的統計

2.2 硅及納米硅對烤煙煙葉內生真菌群落組成的影響

將OTU序列與真菌ITS庫進行比對后，分別統計門、綱、目、科、屬、種水平群落組成。在門水平上，結果如圖2所示，相對豐度較高的是子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)。且相較于CK來說，子囊菌門占總序列的比例有所下降，擔子菌門的有所升高。

對其進行綱水平的分析，結果如圖3，發現7 類真菌，最優勢菌綱為座囊菌綱(Dothideomycetes)，相對豐度分別是45.64%、42.24%、62.60%，可見噴施硅和納米硅后，其優勢菌種類不變，但相對豐度改變。

對目水平進行分析后，結果如圖4，各處理優勢菌種類基本不變，但相對豐度改變。格孢腔菌目(Pleosporales)均占比較高，分別為36.81%、33.57%、32.62%，且格孢腔菌目是CK、T8的最優勢菌。

圖2 不同處理烤煙葉片內生真菌門水平上的群落組成

圖3 不同處理烤煙葉片內生真菌綱水平上的群落組成

圖4 不同處理烤煙葉片內生真菌目水平上的群落組成

對科水平進行分析后，得到heatmap圖(如圖5)，可見不同處理間科水平真菌群落組成分布存在差異，豐度較CK組低的有Debaryomycetaceae、Trimorphomycetaceae、Hypocreales_fam_Incertae_sedis、Helotiaceae柔膜菌科、Cystobasidiaceae囊擔菌科、科水平未分類的銀耳目unclassified_o__Tremellales、目水平未分類的糞殼菌綱unclassified_c__Sordariomycetes、Nectriaceae叢赤殼科、Mortierellaceae被孢霉科、Xylariales_fam_Incertae_sedis、Torulaceae、Trichosporonaceae；較CK組高的有Erysiphaceae白粉菌科、Periconiaceae、科水平未分類的煤炱目unclassified_o__Capnodiales、Chaetomiaceae毛殼菌科、Halosphaeriaceae海殼菌科。說明噴施硅及納米硅后，其科水平群落組成改變。

圖5 不同處理烤煙葉片內生真菌科水平上的群落組成

2.3 硅及納米硅對烤煙煙葉內生真菌群落結構的影響

由圖6可知，CK處理烤煙煙葉的優勢屬(豐度≥1%)為Cladosporium枝孢屬(23%)、Filobasidium線黑粉酵母屬(2.05%)、Alternaria鏈格孢屬(12.23%)、Sporobolomyces擲孢酵母屬(6.16%)、Epicoccum附球霉屬(1%)、Paraphoma異莖點霉屬(5.11%)、Septoria殼針孢屬(1.19%)。

T5處理烤煙煙葉的優勢屬為Cladosporium枝孢屬(6.57%)、Filobasidium線黑粉酵母屬(4.37%)、Alternaria鏈格孢屬(12.67%)、Paraphoma異莖點霉屬(5.26%)、Epicoccum附球霉屬(3.01%)、Dioszegia(2.85%)、Septoria殼針孢屬(1.02%)、Sporobolomyces擲孢酵母屬(7.34%)、Hannaella漢納酵母屬(1.79%)。

T8處理烤煙煙葉的優勢屬為Cladosporium枝孢屬(10.36%)、Alternaria鏈格孢屬(12.22%)、Sampaiozyma(3.78%)、Septoria殼針孢屬(1.14%)、Vishniacozyma維希尼克氏酵母屬(1.6%)、Sporobolomyces擲孢酵母屬(4.89%)、Meyerozyma畢赤酵母屬(1.69%)、Filobasidium線黑粉酵母屬(10.6%)、Rhodotorula紅酵母屬(1.09%)、Saitozyma(1.14%)。

總體來看，與CK相比，T5、T8處理屬的種類及豐度均有不同程度的改變，其中T5、T8減少了Cladosporium枝孢屬的豐度，分別降低到了6.57%、10.36%；增加了Filobasidium線黑粉酵母屬豐度，分別增加到4.37%、10.6%。此外，T5優勢屬增加了Dioszegia(2.85%)、Hannaella漢納酵母屬(1.79%)，T8處理優勢屬增加了Sampaiozyma(3.78%)、Meyerozyma畢赤酵母屬(1.69%)、Vishniacozyma維希尼克氏酵母屬(1.6%)、Rhodotorula紅酵母屬(1.09%)、Saitozyma(1.14%)，減少了Paraphoma異莖點霉屬、Epicoccum附球霉屬?？梢?，通過施加硅和納米硅可以改變內生真菌的豐富度和多樣性，從而改變其種群結構。

在種水平，如圖7，CK附生真菌群落中的占比≥1%種為枝孢屬Cladosporium_delicatulum(22.98%)、異莖點霉屬Paraphoma_chrysanthemicola(4.99%)、線黑粉酵母屬Filobasidium_magnum(2.05%)、附球菌屬Epicoccum_nigrum(1%)、擲孢酵母屬Sporobolomyces_oryzicola(5.89%)。

圖6 不同處理烤煙葉片內生真菌屬水平上的群落組成

T5處理的占比≥1%種為枝孢屬Cladosporium_delicatulum(6.55%)、附球菌屬Epicoccum_nigrum(3.01%)、擲孢酵母屬Sporobolomyces_oryzicola(6.74%)、異莖點霉屬Paraphoma_chrysanthemicola(5.16%)、線黑粉酵母屬VFilobasidium_magnum(4.34%)、Dioszegia_zsoltii_var._yunnanensis(1.85%)。

T8處理的占比≥1%種為枝孢屬Cladosporium_delicatulum(10.27%)、擲孢酵母屬Sporobolomyces_oryzicola(4.58%)、Saitozyma_podzolica(1.14%)、桑帕約氏酵母Sampaiozyma vanillica(3.78%)、維希尼克氏酵母屬vishniacozyma-carnescens(1.28%)、線黑粉酵母屬Filobasidium_magnum(10.53%)、季也蒙畢赤酵母meyerozyma-guilliermondii(1.69%)。

種水平的變化結果與屬水平相似。結果表明，噴施硅及納米硅后枝孢屬Cladosporium_delicatulum含量下降，種水平未分類的鏈格孢屬unclassified_g_alternaria含量穩定，線黑粉酵母屬Filobasidium_magnum含量增加。此外，噴施硅后附球菌屬Epicoccum_nigrum含量增加2.01%，Dioszegia_zsoltii_var._yunnanensis含量增加1.6%。噴施納米硅后烤煙煙葉異莖點霉屬Paraphoma_chrysanthemicola、附球菌屬Epicoccum_nigrumV含量下降，較CK下降3.23%、0.08%。新出現季也蒙畢赤酵母meyerozyma-guilliermondii(1.69%)、Saitozyma_podzolica(1.14%)優勢種。優勢菌種改變，可見噴施硅及納米硅使得煙葉的種群結構發生改變。

圖7 不同處理烤煙葉片內生真菌種水平上的群落組成

對不同處理烤煙煙葉片進行分析，做出Venn圖，其描繪了每個樣本唯一的或在多個樣本之間共享的物種數目，并直觀地顯示了樣本之間的物種數重疊。與CK相比，T5特有物種有67種；T8有130種。隨后，對不同處理進行NMDS分析，如圖8(c)發現噴施硅及納米硅后，物種的群落組成受到影響。

圖8 不同處理烤煙葉片內生真菌群落韋恩

2.4 內生真菌群落組成與煙葉化學成分及香氣物質之間的相關性

對烤煙化學成分與內生真菌進行相關性分析，結果如圖9，可見煙堿及可溶性蛋白與各處理顯著相關；而鉀、淀粉、可溶性糖與其相關性未達到顯著水平。因此，推測噴施硅及納米硅后，其內生真菌群落水平的變化可能與其化學成分的改變有關。

在楊沫等的研究中，小芒森干白葡萄酒釀造過程中，微生物群落豐度及多樣性對醇酯類等香氣物質的含量具有影響。其香氣物質總含量呈增加趨勢，且酯類物質的含量增加最為明顯[19]。在Shen Yan等人的研究中，對土壤微生物與煙草香氣成分進行了RDA分析，檢測了40種關鍵系統類型微生物，發現其中11種與煙草香氣呈顯著相關[20]。于是，在本研究中，為了評估烤煙煙葉內生真菌與香氣物質之間的相關性，我們也對其進行了RDA分析，結果如圖10所示，可以看出，總香氣物質與各處理具有顯著相關性；美拉德反應產物及類西柏烷類降解產物與各處理間具有相關性，但未達到顯著水平。因此，推測香氣物質的含量變化可能與烤煙煙葉內生真菌種群結構的變化有關。

圖9 煙葉化學成分與烤煙煙葉內生真菌目水平

圖10 不同處理烤煙煙葉內生真菌目水平群落組成與

3 討論

3.1 施用硅及納米硅對烤煙煙葉內生真菌的影響

硅在地球上的含量僅次于氧。在不同的土壤中，其含量差別較大，在不同植物種屬中的含量也不同。納米硅以其分子較小，而能夠通過質外體途徑進入到植株內。在孫德權等對納米硅材料的研究中，發現其本身對植物沒有毒性，在一定程度上，能夠促進植物種子萌發，也能提高植物對非生物脅迫的抵抗能力，增加抗重金屬的能力[3]。但納米硅的累積效應也使得對其的使用存有爭議。例如，在植物的下一代中能夠檢測到納米硅的存在[21]。

在本研究中，T8處理的物種組成差異較CK與T5的較大，表明納米硅噴施后煙葉內生真菌豐度改變，同時其種群結構也改變，這與周家喜等人的研究結果是一致的[22]。隨后又利用生物學軟件對烤煙煙葉內生真菌不同水平進行分析，發現在不同水平上其優勢菌群的豐富度不同，且種類也有變化。如T5與T8處理中，內生真菌枝孢屬Cladosporium的豐度下降，線黑粉酵母屬Filobasidium豐度增加。在Venkateswarulu N等人的研究中，枝孢屬可以產生白花丹醌，而后者具有抗菌和抗病毒作用[23]。在韓龍等人的研究中，線黑粉酵母屬可以產生淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、果膠酶、幾丁質酶，而這些酶可以被分泌到胞外并降解煙葉內的大分子有機化合物，產生香氣物質[24]。此外，T5優勢屬增加了Dioszegia(2.85%)、Hannaella漢納酵母屬(1.79%)，T8處理優勢屬增加了Sampaiozyma(3.78%)、Meyerozyma畢赤酵母屬(1.69%)、Vishniacozyma維希尼克氏酵母屬(1.6%)、Rhodotorula紅酵母屬(1.09%)、Saitozyma(1.14%)，減少了Paraphoma異莖點霉屬、Epicoccum附球霉屬。而異莖點霉屬 Paraphoma_chrysanthemicola 可以提高植株對重金屬和黃瓜枯萎病的抗性[25]。附球霉屬 Epicoccum 菌株可以產生抗真菌化合物，防治真菌病害[26]。

通過筆者研究也可以明確不同條件下其優勢菌群的變化，為進一步提高煙草的生長發育創造更加有利的環境，對提高煙草產量和質量及煙草中的某些化學成分提取具有某些重要意義。但對其具體的影響機制還不清楚，以后還有待在這方面進行更加深入的研究。

3.2 內生真菌群落組成與煙葉化學成分及香氣物質之間的相關性

在楊永鋒等人的研究中，高碳基肥料和綠色木霉配施處理后，西柏烷類香氣物質茄酮的含量達到60.50±2.60 ug/g，與對照及單一處理相比含量升高明顯，具有顯著性差異[27]。在龍丹等的研究中，微生物制劑對茶葉香氣具有提升作用，如包括β-葡萄糖苷酶、β-櫻草糖苷酶、半乳糖苷酶等在內的微生物酶制劑和包括霉菌、細菌、酵母菌在內的微生物發酵劑[28]。說明在一定程度上，微生物對烤煙香氣物質的含量是有影響的，這與本研究的結果一致。在筆者研究中，內生真菌的群落組成與總香氣物質的含量具有顯著相關性。此外，在鄭堅強等人的研究中，對烤煙煙葉香氣物質生成相關的微生物進行了分離與鑒定，獲得了降解β-胡蘿卜素生成香氣物質的微生物，最終對分離得到的3個菌株鑒定為絲狀酵母屬菌株[29]?？梢?，在一定程度上，植物內生真菌對烤煙香氣物質是具有影響的。