MAP3K3基因過表達通過多條信號通路激活CREB促進人肺腺癌細胞增殖及上皮-間質轉化*

郭振輝, 茆文莉, 陳文雅, 梁嬌, 侯聰艷, 張韌, 何彥麗

廣州中醫藥大學基礎醫學院(廣東廣州 510006)

有絲分裂原活化蛋白激酶激酶激酶3(MAP3K3)又稱MEKK3，其編碼的絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶3屬于蛋白激酶超家族、MAP3K亞家族，在不同物種間相似性較高。近年來MAP3K3與腫瘤的關系越來越被人們所關注，有文獻報道稱MAP3K3 參與調節多個信號通路，與腫瘤的增殖、分化、細胞存活和耐藥相關[1-3]。前期研究中，通過生物信息學分析及101例肺腺癌臨床樣本的免疫組織化學檢測，我們發現體內MAP3K3表達與肺腺癌患者預后密切相關[4]，體內實驗中MAP3K3基因與肺癌預后發展關系正負相關均有報道，預后的差異是否僅由于MAP3K3表達變化所引起尚有爭議。體外實驗可以控制單一因素從而研究基因的功能，為此，我們在前期研究基礎上，于2019年6月至2020年12月期間，通過對人源肺腺癌H1299、A549細胞株干預MAP3K3基因表達，檢測了其對細胞增殖、遷移、侵襲及EMT表型分子的影響，同時初步探討了其調控的下游信號通路網絡，期待此研究能為開發肺腺癌靶向治療藥物提供部分實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株 A549、H1299細胞購自中國科學院上海細胞庫。本研究經廣州中醫藥大學動物實驗倫理審查通過。

1.2 主要試劑 MAP3K3過表達慢病毒購自上海吉凱生物技術有限公司；shRNA GLPZ MAP3K3 慢病毒包裝顆粒(Lentiviral shRNA Viral Particle Starter Kit, viral particle set)購自Thermo Scientific Dharmacon公司； RPMI1640培養基(批號：8118107)、0.25%Trypsin-EDTA(批號：1939066)、FBS胎牛血清(批號：1795588)購自美國Gibco公司；Western blot單克隆抗體：鈣黏蛋白E(E-cadherin)、鈣黏蛋白N(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、MAP3K3、AKT、mTOR、ERK1/2、JNK1/2、CREB及相關的磷酸化抗體，均購自美國Cell Signaling Technology 公司；HRP羊抗兔IgG二抗(AS014)購自中國ABclonal公司；BCA法蛋白定量試劑盒(FD2001)和RIPA蛋白裂解液(FD008)購自杭州弗德生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MAP3K3過表達及shRNA敲低穩轉株構建 在病毒感染前1 d對處于對數生長期的細胞進行計數，按每孔3 000個細胞接種至96孔板，按1、5、10、50、100 MOI梯度加入病毒，感染6 h后去除含病毒培養基，換用含10%FBS培養基，培養72 h并觀察熒光，選取熒光強度最大且細胞存活較多的MOI梯度作為最佳轉染濃度；于12孔板中接種每孔1×104個細胞，培養至細胞貼壁后換用無血清培養基，加入病毒溶液至最佳濃度，感染6 h后去除含病毒培養基，換用含10%FBS培養基繼續培養72 h；感染過程定時觀察細胞形態，觀察到熒光時開始用嘌呤霉素對轉染細胞進行篩選，每2 d換液，持續14 d，細胞生長穩定后通過Western blot實驗檢測過表達是否成功，設置分組為未轉染組(Ctrl組)、過表達MAP3K3轉染組(OE組)；在shRNA轉染前1 d對處于對數生長期的細胞進行計數，在12孔板中接種每孔3×104個細胞，待細胞貼壁后換用無血清培養基，加入配制好的含shRNA轉染體系，37℃培養24 h后換用含10%FBS培養基繼續培養24 h得到MAP3K3基因敲低細胞株。

1.3.2 克隆形成實驗 在六孔板中接種每孔1 000個對數生長期細胞，加入含10%FBS培養基，每2 d換液，持續10 d，肉眼觀察見細胞集落形成后吸去培養基，用PBS洗滌后每孔加入1 mL的4%多聚甲醛溶液固定20 min后吸去，加入1%結晶紫染色20 min后吸去結晶紫，晾干后拍照并統計細胞集落數量。

1.3.3 劃痕實驗 在6孔板中接種每孔3×105個對數生長期細胞，待細胞貼壁且長滿6孔板時，用200 μL吸頭劃直線痕，每孔橫豎各劃3條，用PBS輕洗3次去除漂浮細胞，加入無血清培養基，每孔隨機選取5個視野并標記，分別在0 h和24 h用顯微鏡拍照記錄。

1.3.4 Transwell實驗 細胞培養至對數生長期，換用無血清培養基饑餓培養24 h，用0.25% Trypsin-EDTA消化并收集細胞，用無血清培養基重懸細胞，調整細胞懸液濃度為1×106個/mL，將含基質膠的transwell小室置于24孔板中，下室加入600 μL含15%FBS培養基，上室加入200 μL細胞懸液，37℃培養24 h；取出transwell小室吸去孔板中的培養基，用棉簽小心擦去上室上部的細胞，使用PBS輕洗3次，在下室加入600 μL的4%多聚甲醛溶液后將transwell小室放回浸泡固定20 min；吸去4%多聚甲醛溶液后加入1%結晶紫染色液染色20 min，置通風處晾干；在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野拍照記錄，并使用ImageJ V1.8.0軟件進行細胞計數。

1.3.5 Western blot實驗 根據文獻報道，EMT與AKT/mTOR信號通路密切相關[5]。環磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)與細胞的增殖、分化、凋亡等密切相關，而且能被AKT、ERK激活[6-9]。使用Western blot實驗檢測MAP3K3對AKT/mTOR信號通路的影響。將經過處理的細胞用胰酶消化并制成細胞懸液，離心吸去上清液后加入含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，4℃裂解30 min后收集于1.5 mL離心管，4℃ 12 000轉離心10 min后取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒進行定量。每個泳道上樣20 μg蛋白，10% SDS-PAGE凝膠電泳(120 V，90 min)分離，轉印(300 mA，90 min)到 PVDF膜上，5% BSA溶液室溫封閉2 h，分別加入對應第一抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次5 min；HRP標記的二抗孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min；ECL化學發光法顯影，全自動化學發光圖像分析系統采集拍照。以GAPDH為內參對照，每組實驗獨立重復3次。

2 結果

2.1 慢病毒轉染構建MAP3K3過表達人肺腺癌細胞株 使用Western blot實驗檢測過表達轉染MAP3K3基因的人肺腺癌細胞，結果見圖1，過表達MAP3K3基因后，MAP3K3蛋白表達量顯著上升，說明成功過表達轉染。

圖1 Western blot檢測過表達MAP3K3基因結果

2.2 過表達MAP3K3對人肺腺癌細胞增殖能力的影響 使用平板克隆實驗檢測過表達MAP3K3基因后人肺腺癌細胞的增殖能力變化，見圖2。與Ctrl組相比，過表達轉染MAP3K3基因后，肺腺癌細胞形成克隆面積顯著增大，細胞集落數量顯著增多，表明細胞增殖活性更強，過表達MAP3K3基因可促進人肺腺癌細胞的增殖。

圖2 過表達MAP3K3基因對人肺腺癌細胞增殖的影響(1%結晶紫染色)

2.3 過表達MAP3K3對人肺腺癌細胞遷移及侵襲能力的影響 劃痕實驗結果表明，與Ctrl組相比，過表達MAP3K3基因細胞的劃痕愈合率顯著上升且組間差異有統計學意義(P<0.05)。Transwell實驗結果表明，與Ctrl組相比，過表達MAP3K3基因后細胞穿膜數量增多且組間差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表1～2。

圖3 過表達MAP3K3基因對人肺腺癌細胞遷移及侵襲能力的影響(×100，1%結晶紫染色)

表1 兩組劃痕愈合面積百分比的比較

表2 兩組侵襲細胞數量百分比的比較

2.4 過表達MAP3K3對腫瘤細胞轉移侵襲相關蛋白的影響 Western blot實驗結果顯示，與Ctrl組相比，過表達MAP3K3基因的A549和H1299細胞上皮表型標志物E-Cadherin蛋白表達顯著下調，間質表型標志物N-Cadherin和Vimentin蛋白表達上調(圖4、表3)，說明過表達MAP3K3基因能促進人肺腺癌細胞的EMT。

圖4 Western blot檢測過表達MAP3K3基因后對人肺腺癌細胞EMT相關蛋白影響

表3 用Ctrl校正的EMT相關蛋白相對定量結果

2.5 過表達MAP3K3對多個信號通路的影響 過表達MAP3K3基因后人肺腺癌細胞的磷酸化AKT和磷酸化mTOR表達上調，未磷酸化蛋白表達無顯著差異。對ERK(p-ERK)和JNK(p-JNK)蛋白表達水平進行檢測，結果顯示了與AKT(p-AKT)和mTOR(p-mTOR)相同的變化趨勢(圖5、表4)。

圖5 Western blot檢測過表達MAP3K3基因對相關信號通路蛋白的影響

表4 用Ctrl校正的相關信號通路蛋白相對定量結果

2.6 過表達與敲低MAP3K3對CREB的影響 對H1299細胞敲低MAP3K3基因，Western blot實驗結果顯示3組shRNA中shRNA-1699敲低成功，同時p-CREB的蛋白水平顯著下調(圖6-A)；對H1299細胞過表達MAP3K3基因，Western blot實驗結果顯示p-CREB的蛋白表達水平上調(圖6-B)；結果灰度分析見表5。

注：A:敲低MAP3K3基因；B:過表達MAP3K3基因

表5 用NTC或Ctrl校正的p-CREB蛋白相對定量結果

3 討論

肺腺癌患者約占所有肺癌患者數量的40%～50%，由于腫瘤細胞的轉移形成繼發性腫瘤，患者病情短時間內惡化，是治療肺腺癌需要面臨的主要問題[10]。EMT是上皮細胞失去緊密連接，脫離基底膜向流動性強的間充質細胞轉變的過程，與腫瘤遠端轉移密切相關，因此靶向EMT過程是治療腫瘤的一個重要方法[11]。

MAP3K3作為MAPK家族重要的一個蛋白激酶，是蛋白激酶信號轉導級聯的組成部分，涉及細胞各種功能，近年來MAP3K3信號通路與腫瘤的關系日益受到關注。MAP3K3處于信號級聯反應的上游端，對許多磷酸化相關蛋白及其信號通路具有調控作用，影響腫瘤細胞增殖、分化和存活，其中ERK信號通路最為典型。MAP3K3可將ERK1/2信號通路中的MEK磷酸化，磷酸化的MEK將ERK磷酸化而激活其核轉錄因子活性[12]。MAP3K3亦可以通過與MEK5結合形成活化的二聚體激活ERK5，從而調控細胞生長發育過程[13]。近來文獻報道MAP3K3與腫瘤藥物耐受、患者預后間也存有一定關系，Samanta 等[14]發現約63%卵巢癌細胞過表達MAP3K3，且伴有較高的IκB激酶β(IKKβ激酶)和核轉錄因子-κB(NF-kB)活性，采用siRNA使該基因表達沉默后，可增加腫瘤細胞對化療藥物(紫杉醇)的敏感度。Hasan等[15]報道MAP3K3(MEKK3)基因過表達是食管癌發生的早期事件，與患者不良預后有關。Fan等[3]研究報道，8%～20%的乳腺癌檢測有MAP3K3基因擴增，將存有MAP3K3基因擴增的乳腺癌MCF-7和MDA-MB-361細胞株 MAP3K3基因沉默后，可增加乳腺癌細胞對TNF和TRAIL因子以及阿霉素、VP-16等化療藥物誘導的凋亡敏感度, 且可有效抑制乳腺癌細胞增生和克隆形成。

CREB是調節細胞增殖和存活非常重要的轉錄因子之一，在人類的多種腫瘤中過度表達，如腦膠質瘤[16]和非小細胞肺癌[17]。它可以被許多激酶(包括 AKT和ERK)磷酸化而激活[6-9]，CREB除了可影響癌細胞的增殖外，還參與調節EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin和Fibronectin[18]的表達，有研究發現電離輻射可通過激活EGFR-p38/ERK-CREB-1/STAT3-EMT 途徑誘導癌細胞遷移侵襲[7]。

MAP3K3基因與肺腺癌侵襲、轉移的關系尚不明確，是否參與肺腺癌細胞EMT轉化亦鮮見報道。我們通過前期研究發現臨床肺腺癌組織中MAP3K3表達水平與間質淋巴細胞浸潤程度相關，故猜測可影響機體免疫功能，而在體外敲除MAP3K3可降低腫瘤細胞的增殖能力[4]。本研究使用慢病毒感染人肺腺癌細胞H1299和A549，在體外構建MAP3K3穩定過表達細胞株。通過克隆形成實驗、劃痕實驗、Transwell實驗以及EMT相關蛋白的檢測，我們發現過表達MAP3K3基因可增強人肺腺癌細胞增殖能力，并促進遷移、侵襲及EMT。為進一步探明其作用機制，我們檢測了過表達MAP3K3基因的人肺腺癌細胞中多個具有功能活性的磷酸化信號分子：p-AKT、p-mTOR、p-ERK1/2和p-JNK1/2，發現表達均有上調，已有文獻報道AKT/mTOR[5]、ERK1/2[19]以及JNK[20]信號通路激活與EMT關系密切，因此，我們推測MAP3K3可通過調節這些關鍵分子，參與人肺腺癌細胞的增殖、遷移及EMT過程；我們在實驗中進一步發現過表達MAP3K3基因的人肺腺癌細胞中，具有功能活性的p-CREB蛋白表達水平表達上調，而敲低MAP3K3基因使得p-CREB蛋白表達水平顯著下調，說明MAP3K3基因可能通過調控多個信號通路分子的磷酸化水平，調控核轉錄因子CREB的磷酸化水平，從而調節其功能。

綜上所述，我們推測MAP3K3通過AKT/mTOR-ERK1/2-JNK/CREB信號通路網絡，參與肺腺癌細胞增殖、遷移及EMT過程。該實驗結果希望為基于MAP3K3信號通路開發新型靶向治療肺腺癌的藥物提供實驗參考。

利益相關聲明：所有作者聲明沒有利益沖突。

作者貢獻說明：何彥麗和張韌設計了實驗研究，茆文莉和郭振輝完成了實驗操作，陳文雅收集并整理了數據，梁嬌和侯聰艷作數據分析，郭振輝和茆文莉共同完成了論文寫作，所有作者閱讀審核了論文并同意投稿。