β地中海貧血患者1 331例出生年份及基因突變類型分析*

何圓圓, 李平萍, 李瑤蕓, 曾麗紅, 吳國波, 周雪花, 唐卒卒, 肖彬, 周天紅, 王麗, 張新華△

中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二三醫院 1血液科， 2檢驗科， 3兒科， 4輸血科(廣西南寧 530021)

廣西是地中海貧血(以下簡稱地貧)高發區[1-2]，長期以來廣西地貧胎兒出生率高，地貧患者生存狀況差[3-4]。2010年廣西政府啟動了“廣西地貧防治計劃”，目的是降低重型地貧胎兒的出生率、改善已出生患者生存狀況，2018年廣西政府提出了“重癥地貧零出生目標”。在地貧防控流程中，找出地貧高危孕婦是關鍵，即胎兒可能是重型地貧的孕婦，在孕婦都檢出地貧基因型后就可以達到目的。然而，α地貧很容易通過檢出的基因型區分重型(--/--)和中間型(--/-α或--/αTα)[1]，而β地貧卻很難區分，過去常認為β0/β0基因型為重型β地貧(TM)，β+/β+基因型為中間型β地貧(TI)，而β0/β+基因型既可以是TM也可以是TI[1]，但是大量的研究表明臨床結局常常與此不相符[5-9]。2013年國際地貧聯合會(TF)將地貧分類為輸血依賴型地貧(TDT)和非輸血依賴型地貧(NTDT)，并分別編輯出版了相應的診療指南[10-11]，按指南標準過去以基因型判斷的中間型α地貧和TI中的部分患者是TDT，但出生前是無法確定的，而未來地貧防控關注的重點除了孕中晚期或出生后即死亡的重型α地貧外就是TDT。另外，部分TDT患者盡管臨床可診斷地貧但常規基因分析無法明確基因診斷，而他們的父母均有一方沒查出地貧基因而進入地貧防控的盲區。通過回顧性分析我院就診的1 331例廣西籍β地貧患者出生年份及基因突變類型特點，探討地貧防控策略的效果及走向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年1月至2020年12月期間在我院就診資料完整的廣西籍β地貧患者1 331例，其中男781例，女550例，年齡1～65歲，中位年齡12歲。本研究已通過中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二三醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 以血常規、血紅蛋白電泳及地貧基因分析結果進行診斷，診斷標準參照《血液病診斷及療效標準》[12]。以身份證或戶口本確定出生地和出生年份。地貧基因型結果以三甲及以上醫院或第三方檢驗平臺做的地貧基因分析報告單為依據，均以國家衛生計生委婦幼司、國衛婦幼出防便函[2014]106號和國家衛健委婦幼健康司、國衛辦婦幼函[2018]683號批準的地貧試劑盒檢測，地貧試劑盒不能檢出的基因突變類型采納第三方檢測平臺測序結果(不同年代所用測序方式不同，從一代測序到三代測序)。臨床、血常規和電泳結果提示為TM或TI，但常規試劑盒檢測僅診斷為β地貧雜合子的，經骨髓細胞學分析確定為溶血性貧血骨髓像的均作為有“罕見基因突變類型”。常規試劑盒僅能檢出23種基因型，包括：3種常見缺失型α地貧基因：--SEA、-α3.7和-α4.2；3種常見突變型α地貧基因：αCS、αQS和αWS及17種常見β地貧基因：CD41-42(-TCTT)，IVS-Ⅱ-654(C→T)，-28(A →G)，CD71-72(+A)，CD17(A→T)，βE(CD26G→A)，CD31(-C)，CD43(G→T)，-32(C→A)，CD27-28(+C)，-29(A→G)，-30(T→C)，CD14-15(+G)，CAP+40-+43(-AAAC)，Int(ATG→AGG)，IVS-Ⅰ-1(G→T)和 IVS-Ⅰ-5(G→C)。

2 結果

2.1 出生年份 1 331例患者中1987年出生的為10例，此前均為個位數，此后逐年增加，2009年達到頂峰為103例，2010年開始下降，2018年降至18例，2020年降至2例。見圖1。

圖1 1 331例β地貧患者出生年份分布

2.2 基因突變類型 1 293例(97.15%)通過常規基因分析明確基因型，檢出12種基因突變類型，常見基因突變類型的分布頻率見表1。38例(2.85%)罕見基因突變類型患者26例通過測序明確基因型，12例未能明確基因型(按當時測序結果，沒有進行新的測序)，檢出8種β地貧基因突類型和2種α三聯體，見表2。1 293例常見基因突變類型β地貧中最常見的4種基因型是CD41-42/CD17(205例，15.9%)、CD41-42/CD41-42(197例，15.2%)、CD41-42/-28(96例，7.4%)和CD17/CD17(92例，7.1%)。1 293例患者中β0/β0純合子344例(26.6%)，β0/β0雙重雜合子380例(29.4%)，β0/β+雙重雜合子370例(28.6%)，β+/β+純合子22例(1.7%，其中14例-28/-28，8例IVS-Ⅱ-654/IVS-Ⅱ-654)，β+/β+雙重雜合子31例(2.4%，其中25例IVS-Ⅱ-654/-28，4例29/-28，2例IVS-Ⅱ-654/-29)，β/HbE 146例(11.3%)。有176例患者復合了α地貧(13.6%)。

表1 1 293例患者常見β地貧基因突變類型的分布頻率

表2 通過測序檢出的8種β-地貧罕見基因突變類型和2種α三聯體

3 討論

β地貧致病的核心機制是α/β珠蛋白鏈的不平衡[1，13]。由于α/β珠蛋白鏈比例失衡，過多的α珠蛋白在紅細胞前體中積聚并沉淀形成四聚體，沉積在紅細胞膜上，引發血色素分解和游離Fe3+釋放，后者可催化活性氧反應并降低還原型谷胱苷肽，導致膜蛋白氧化，引發膜損傷，加上四聚體沉積所引發的自體免疫清除機制，促使成熟紅細胞形成脆性增加和可塑性降低的“地貧樣紅細胞”，此類細胞易于在微循環中破裂而產生溶血[13]。此外，雖然造血旺盛，但重型和中間型β地貧患者的紅系祖細胞大多數在髓內死亡，導致無效造血[13]。無效造血反而促進骨髓造血的代償性增加，造血腔擴大，出現骨骼畸形，骨質疏松，形成地貧面容，嚴重者出現病理性骨折，還引起脾臟增大，相應的脾臟破壞紅細胞增加，加重貧血[10-11，13]。無效造血時還將促使機體增加鐵吸收，導致鐵過載，過量的鐵沉積于肝臟、心臟、胰腺、甲狀腺、性腺等部位，導致肝功能不全、心功能不全、糖尿病、生長發育遲緩、第二性征推遲等并發癥[10-11]。β地貧的治療主要是規范輸血和足量除鐵，造血干細胞移植是目前唯一根治的手段，而血源緊張和治療費高昂是地貧患者生存的障礙，做好地貧防控，減少重癥地貧胎兒出生是關鍵。

1 331例β地貧患者的出生年份分布顯示過去廣西地貧患者生存狀況差，大多在幼兒時期死亡[3]，而隨著經濟條件和醫療條件的改善，地貧患者生存狀況得到改善[4]，特別是2010年“廣西地貧防治計劃”實施后地貧患者生存狀況進一步改善[14]，同時由于防控工作成效顯著，重癥地貧胎兒出生率大幅度下降[15]。2018年廣西政府提出了“重癥地貧零出生目標”，零出生指標是：重型地貧胎兒診斷率≥98%，重型地貧胎兒醫學干預率≥98%，重型地貧患兒出生率<0.3/萬。按廣西地貧流調結果以每年70萬孕婦估算廣西每年出生的TM和TI胎兒約為724 例(95%CI： 603～897)[2]，從圖1可見2009年當年全廣西出生的TM和TI患者中約有1/7(103例)來過我院就診，而2009年就是最高值，從2010年起快速減少，2018年是18例，2020年僅2例。從桂婦兒健康服務信息管理系統獲悉2020年廣西助產機構活胎產數為57.49萬例，按重型地貧零出生目標計算當年TM患兒出生例數應<17例，而當年出生的TM患兒中有2例到我院就診，如果按廣西1/7的TM和TI患者會到我院就診估算是達標了，但需要注意是廣西各地醫院在實施地貧防治計劃后高度重視地貧防治工作，地貧診療水平顯著提高，來我院就診的TM和TI患者也相應減少，我院就診患者量已難以準確反映廣西TM和TI患者的實際出生人數。

1 331例β地貧患者中1 293例患者明確基因型，最常見的4個基因型是CD41-42/CD17、CD41-42/CD41-42、CD41-42/-28和CD17/CD17，與流調結果一致。38例(2.85%)臨床診斷TM或TI的患者中通過常規基因分析沒有明確基因診斷的，通過測序有26例明確了基因型，測序檢出8種β地貧基因突類型和2種α三聯體，可見地貧防控精準度有必要進一步提高。38例患者中多數是父母做地貧篩查時一方沒檢出地貧基因而漏診。目前國家衛生計生委婦幼司、國家衛婦幼出防便函[2014]106號和國家衛健委婦幼健康司、國衛辦婦幼函[2018]683號批準的地貧試劑盒只檢測我國最常見的23種基因型，而在中國人群中已發現129種β珠蛋白基因點突變(含異常血紅蛋白)和16種β地貧缺失突變[13]。

有研究通過高通量測序(二代基因測序，NGS)對10 111對夫婦進行地貧分子篩選分析中，共檢測到4 180對攜帶4 840個突變等位基因的個體，并確定了186對有可能影響后代的夫婦，發現與傳統篩查比較，可以將高風險夫婦的陽性檢出率提高23.2%[16]。而NGS技術也有不能明確的罕見基因，NGS技術在實際應用中也存在缺陷，如讀長較短，無法跨越基因上串聯重復區域，導致其在檢測串聯重復區域時存在明顯不足[17]。與NGS技術相比，地貧等位基因綜合分析(CATSA)的三代測序(TGS)方法用于識別α和β地貧遺傳攜帶者狀態有更大的優勢，針對此項技術的全國多中心研究結果已有報道[18]，其發現TGS結合遠程聚合酶鏈式反應(PCR)的技術對于地貧等位基因的覆蓋率、可靠性和準確性，提供了一種全面的方法，有可能為地貧基因攜帶者篩查提供一種通用的解決方案，實現對地貧基因攜帶者的精準診斷，避免在地貧產前診斷及臨床診斷方面出現漏診。本研究3例α三聯體為TGS技術檢出。

“廣西地貧防治計劃”更多關注的是重型地貧的醫學干預，β0/β0胎兒是TM需要在知情同意前提下終止妊娠，β0/β+患者可以是TM也可以是TI[1，19-20]，無法判斷出生后是TM還是TI，也需要在知情同意前提下終止妊娠，而認為β+/β+胎兒是TI[1，19-20]，所以無需進行醫學干預，另外理論上β地貧復合α地貧的患者貧血會有所減輕[1，19-20]，會認為復合α地貧的β0/β+是TI，無需進行醫學干預。然而大量的研究證明，由于存在著基因修飾因子的修飾作用，臨床上基因型與表型可能不一致，例如BCL11A、HBSIL、MYB、KLF1[5-9]等修飾基因都可能會影響到β地貧的表型。本研究患者中5例是β0/β+復合東南亞缺失，卻仍然是TDT。另外，本研究患者中β+/β+純合子有53例(4.1%)，此類胎兒如何處置有必要達成共識，如果還按現在的防控策略讓β+/β+地貧胎兒繼續妊娠(或β+/β+孕婦無需產前診斷)會有產生一部分TDT患者。

目前的地貧防控策略非常明細，需要各個環節的醫務人員認真落實，早孕建卡檢測是防控的最后一環，如果確定孕婦夫婦一方攜帶地貧基因，產科醫生務必結合血常規中的平均紅細胞體積、血紅蛋白電泳中的HbA2和地貧基因檢測3個結果一起分析，三者不相符時務必進行認真分析，必要時送測序，避免漏診。隨著二代或三代測序技術水平的提高和檢測試劑盒成本的降低，二代或三代測序技術進入地貧防控策略是必然的，這將會顯著降低漏診率，顯著提高工作效率。

利益相關聲明：不存在競爭經濟利益。

作者貢獻說明：李平萍、李瑤蕓、曾麗紅、吳國波、周雪花、唐卒卒、肖彬、周天紅、王麗負責資料收集、分類管理、數據整理；何圓圓、張新華負責方案設計、數椐分析統計和論文撰寫。