褐飛虱自噬相關基因NlATG13的表達與功能分析

吳建艮, 矯啟啟, 俞飛飛, 鄭園園, 陳桐桐, 郝培應, 俞曉平

(中國計量大學生命科學學院, 浙江省生物計量及檢驗檢疫技術重點實驗室, 杭州310018)

細胞自噬是細胞內一種受到高度調控的降解過程(van der Vaartetal., 2008)。細胞自噬通過溶酶體清除多余或受傷的蛋白質、細胞器和入侵病原體等維持細胞的生理穩態與生存(van der Vaartetal., 2008; Jing and Lim, 2012; Zhanetal., 2018)，在細胞內物質轉運、細胞生長、發育、抗衰老、細胞死亡、細胞免疫等過程中發揮作用(Mizushima, 2005; Maruzsetal., 2019)。ATG13是自噬通路的一個重要組成部分，自噬發生時，ATG13去磷酸化，并通過其中間區域與ATG1和ATG17相互作用，形成起始復合物，促進自噬(Chang and Neufeld, 2009; Suttangkakuletal., 2011; Chewetal., 2015)。在昆蟲中，自噬參與細胞結構重建(Komatsuetal., 2006; Bartolomeoetal., 2010; Kimetal., 2013)、蛻皮(Papinski and Kraft, 2016)、饑餓(Periyasamy-Thandavanetal., 2009; Mari and Reggiori, 2007)和抑制病原體感染(Yamamotoetal., 2012; Wildetal., 2014; Baderetal., 2015; Yinetal., 2016)等多個過程。ATG13通過與ATG1形成復合物，促進自噬的啟動，整合并傳遞自噬通路上游至下游的信號。在家蠶Bombyxmori、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和斜紋夜蛾Spodopteralitura中，ATG13與其他自噬相關蛋白相互作用并增強自噬降解，對ATG13基因的RNA干擾導致自噬水平降低(Chang and Neufeld, 2009; Xiaoetal., 2019)。

雖然自噬以及ATG13基因在完全變態昆蟲研究較多，但有關不完全變態昆蟲的自噬及ATG13基因卻鮮有報道。褐飛虱Nilaparvatalugens是一種不完全變態昆蟲，它與完全變態昆蟲在取食方式、器官重建(比如消化器官)等方面存在較大差異，其細胞自噬行為與完全變態昆蟲是否存在差異尚不清楚。因此，有必要探明褐飛虱細胞自噬行為以及自噬相關基因ATG13等的功能。本研究旨在分析NlATG13在褐飛虱不同發育階段和若蟲不同組織中的表達情況，揭示NlATG13基因在褐飛虱中的時空表達規律，并通過RNA干擾技術分析其在褐飛虱中的作用，評估NlATG13基因作為褐飛虱防治靶標的潛力。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試褐飛虱是本課題組在水稻品種TN1(不含抗褐飛虱基因)上飼養了10年以上的群體。培養溫度為26±2℃，相對濕度為75%±5%，光周期為16L∶8D。本研究試蟲均為短翅型褐飛虱成蟲及其后代。

1.2 褐飛虱總RNA提取與cDNA的合成

根據試劑盒的說明書，使用TRIzol Total RNA Isolation Kit(TaKaRa, Kyoto, 日本)從褐飛虱的不同發育階段(1-5齡若蟲各20～50頭以及羽化后1, 3, 5, 7和9 d的雌成蟲和雄成蟲各15頭)和不同組織(30頭5齡若蟲的頭、胸、中腸和脂肪體及30頭剛羽化雌蟲的卵巢)的樣本中提取總RNA。用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, 美國)檢測RNA質量和濃度。按照PrimeScript RT Reagent Kit和gDNA Eraser(TaKaRa, Tokyo, 日本)說明書用1 μg總RNA合成cDNA第1鏈，保存在-20℃備用。

1.3 NlATG13的克隆

根據本課題組前期獲得的褐飛虱轉錄組數據，獲得自噬相關基因NlATG13的部分核心序列，通過Primer Premier 5.0軟件設計該核心序列的引物NlATG13-F/-R(表1)，使用1.2節反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR擴增，對NlATG13核心序列信息進行驗證，PCR反應體系(50 μL): Premix Taq 25 μL, ddH2O 19 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各2 μL, cDNA模板2 μL。PCR反應程序: 94℃ 4 min; 94℃ 30 s，57℃ 30 s, 72℃ 3 min, 34 次循環; 72℃ 10 min, 4℃保存。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增片段大小。目的條帶割膠回收后送至桑尼生物科技有限公司(上海)測序，測序結果利用DNAMAN軟件和原序列對比驗證。

根據NlATG13基因的核心序列，通過Primer Premier 5.0設計RACE外圍引物與內圍引物(表1)，以1 μg總RNA合成RACE模板，采用巢式PCR對褐飛虱NlATG13基因的3′端和5′端進行擴增。具體操作按照RACE試劑盒說明書步驟進行。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，將目的片段連到 pMD18-T Vector載體上，挑選5管陽性單克隆菌液送至公司測序。應用DNAMAN軟件將NlATG13 基因的核心片段、3′RACE序列和5′RACE序列進行拼接，得到NlATG13基因的全長序列。

表1 引物信息

1.4 NlATG13的序列分析與進化樹構建

克隆NlATG13基因的全長cDNA后，使用開放閱讀框(ORF)查找工具ORF Finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測其開放閱讀框及蛋白質翻譯情況。通過NCBI的BLASTX搜索，查詢不同物種氨基酸序列以進行同源性比對。使用ExPASy(http:∥web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質的分子量和理論等電點，通過在線工具SignalP 4.1 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對信號肽進行預測。在PROSITE數據庫(http:∥prosite.expasy.org/)中預測蛋白質含有的結構域。通過MEGA 6.0.6中的鄰接法(neighbor-joining, NJ)，構建褐飛虱和其他物種的氨基酸序列的系統進化樹，重復數為1 000，在進化樹的每個節點上均顯示大于50的百分比值。

1.5 NlATG13表達譜分析

根據1.3節克隆的NlATG13的全長cDNA序列信息，運用Primer Premier 5.0軟件設計RT-qPCR特異性引物(表1)，NlRPS11作為內參基因。以1.2節合成的不同發育階段和組織的RNA為模板，采用RT-qPCR檢測NlATG13基因在褐飛虱不同發育階段和組織中的表達量。PCR反應體系(10 μL): SYBR 5 μL, ddH2O 3.4 μL, ROX 0.2 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各 0.2 μL, cDNA模板 1 μL。PCR反應程序: 94℃ 45 s; 94℃ 5 s, 57℃ 34 s, 72℃ 30 s, 共40個循環。1-2齡若蟲的中的基因表達量作為不同發育階段的基因表達量參照，以頭中的基因表達量作為不同組織中的基因表達量參照，每個樣本設置3個生物學重復和3個技術重復。不同發育階段和組織取樣每個生物學重復樣本量：若蟲5～15頭，成蟲3～5頭，頭10頭，胸10頭，中腸30頭，卵巢30頭，脂肪體20頭。

1.6 RNAi敲減NlATG13的表達

根據褐飛虱NlATG13的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0設計引物dsNlATG13-F/-R(表1)合成NlATG13的dsRNA片段。根據綠色熒光蛋白基因GFP(GenBank登錄號: MF169984.1)的序列信息，設計引物dsGFP-F/-R(表1)。參照課題組前期引物設計方法在5′端添加保護堿基(GGATCC)以及T7啟動子(TAATACGACTCACTATA)。NlATG13和GFP的dsRNA片段不包含RT-qPCR所需的片段，以避免干擾目的基因的轉錄水平檢測。NlATG13和GFP的dsRNA片段轉化到pMD18-T載體上，轉入JM109測序，確定正確性。測序后選擇無突變菌液提取質粒，進行普通PCR并割膠回收，膠回收產物則為dsRNA合成的模板。根據MEGAscript?T7 High Yield Transcription Kit(Ambion, Austin, TX, 美國)試劑盒說明書合成NlATG13和GFP的dsRNA，-80℃保存備用。

將dsRNA加入拉針儀(Narishige, Tokyo, 日本)拉制的毛細管中，選擇齡期相對一致的褐飛虱3齡若蟲進行顯微注射，注射部位位于中足和后足之間，以注射等量dsGFP為對照，dsRNA終濃度為5 μg/μL，每頭褐飛虱大約注射50 nL的dsRNA，注射完后將褐飛虱放入裝有水稻苗的杯中，待褐飛虱恢復后進行分組。

1.7 RNAi后中腸細胞的透射電鏡觀察

在普通顯微鏡下解剖1.6節RNAi處理4 d的褐飛虱，拉出中腸后用2.5%戊二醛過夜固定，PBS洗滌3次后用1%的OsO4固定1 h，PBS洗滌3次后用一系列濃度的乙醇(30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%和100%)對其進行脫水。包埋后使用Leica EM UC7超薄切片機進行切片，切片經檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液染色，最后在Hitachi H-7650透射電鏡中對中腸上皮細胞自噬及糖原進行觀察，dsGFP和dsNlATG13處理各觀察5個重復樣本。

1.8 RNAi后ATP含量的測定

為探明RNA干擾NlATG13導致的糖原積累及葡糖糖供應會不會影響ATP合成，檢測RNA干擾NlATG13對ATP含量的影響。按照ATP檢測試劑盒說明，取20 mg經1.6節dsNlATG13和dsGFP處理4 d的褐飛虱樣品(整個蟲體)，加入150 μL裂解液，用電動組織研磨器研磨，后在12 000 r/min 4℃下離心5 min。吸取上清液20 μL，用96孔黑色板在酶標儀上檢測樣品的ATP含量。同時，使用BCA蛋白質檢測試劑盒蛋白質濃度，用以計算ATP最終含量。每個樣品3個技術重復。

1.9 RNAi后褐飛虱的干擾效率、糖原合成與代謝途徑相關基因檢測和存活率統計

待1.6節RNAi處理褐飛虱在顯微鏡燈光下放置5 min使其蘇醒后放入4-5葉期TN1水稻幼苗杯中，每只杯子放入20頭褐飛虱，每個處理設置3個重復。每天觀察和統計成蟲數量，計算存活率；采集褐飛虱死亡標本，在立體顯微鏡下觀察褐飛虱死亡特征。同時，設置3個平行組，每組30頭褐飛虱進行取樣，在RNAi處理后第2, 4, 6和8天進行取樣，檢測NlATG13的表達量，以檢測RNA干擾效果；為研究RNA干擾NlATG13對糖原合成與代謝通路相關基因糖原合成及代謝通路相關基因的影響，對dsNlATG13處理4 d褐飛虱3齡若蟲的糖原合成酶基因NlGS、糖原合成激酶基因NlGSK3、糖原磷酸化酶基因NlGP的相對表達量進行了分析，采用RT-qPCR進行檢測(方法同1.5節)。

1.10 數據分析

所有基因表達量數據均以3個技術重復的平均值±標準差表示，采用相對定量2-ΔΔCt法計算(Livak and Schmittgen, 2001)，采用Student氏t檢驗進行分析。采用SPSS 22.0軟件和GraphPad Prism 8.0軟件對實驗數據進行分析并繪制圖表。所有數據均表示為至少3個獨立生物學重復的平均值。采用t檢驗比較兩組樣本的差異，采用單因素方差分析檢驗處理3組或3組以上樣本影響的顯著性，存在顯著影響時，采用Tukey檢驗比較平均值差異。

2 結果

2.1 褐飛虱NlATG13的全長cDNA克隆和序列特征

克隆獲得1 194 bp的NlATG13核心序列，經RACE獲得NlATG13的1 325 bp的cDNA全長序列。通過ORF Finder預測，NlATG13包含一個1 203 bp的ORF(GenBank登錄號: MF805752)，編碼一個含400個氨基酸的蛋白質(GenBank登錄號: AWW05678.1)，分子量為46.3 kD，等電點為5.39，沒有信號肽，符合其在細胞質發揮作用的特征。

蛋白序列分析發現，NlATG13包含一個ATG13蛋白特征結構域(PF10033)，位于第76-194位氨基酸。選擇同源性較近的2種昆蟲茶翅蝽Halyomorphahalys與溫帶臭蟲Cimexlectularius的ATG13蛋白與褐飛虱NlATG13蛋白進行多重氨基酸序列比對。雖然，ATG13蛋白結構與上述2種昆蟲的ATG13蛋白存在部分差異，但3條序列均具有一個與自噬相關的ATG13蛋白結構域并且位置相近(圖1)。通過對其結構的分析，推測ATG13蛋白在不同種類昆蟲中的生理功能相似。

圖1 ATG13蛋白的多重序列比對

2.2 褐飛虱NlATG13的系統發育

進化分析表明，在納入分析的物種中褐飛虱的NlATG13蛋白與半翅目昆蟲溫帶臭蟲和茶翅蝽的ATG13蛋白進化關系較為接近(圖2)。

圖2 鄰接法構建的基于氨基酸序列的褐飛虱及其他物種ATG13蛋白的系統進化樹(1 000次重復)

2.3 NlATG13的時空表達規律

RT-qPCR結果表明，NlATG13在褐飛虱的不同發育階段均有表達，與1-2齡若蟲相比，3和5齡若蟲中的表達量高(P=0.003)，4齡若蟲、雌成蟲和雄成蟲中的表達量無顯著性差異(P值分別為0.082, 0.258和0.725)(圖3: A)。NlATG13在褐飛虱的不同組織中均有表達，與頭中的表達量相比，胸、中腸、卵巢和脂肪體中的表達量均較低(P值分別為0.020, 0.015, 0.010和0.044)，胸中的表達量最低(P=0.020)(圖3: B)。

圖3 NlATG13在褐飛虱不同發育階段(A)和不同組織(5齡若蟲頭、胸、中腸和脂肪體以及剛羽化雌蟲的卵巢)(B)中的相對表達量

2.4 NlATG13的RNAi效果

RT-qPCR結果顯示，顯微注射dsNlATG13進行干擾2, 4, 6和8 d后，目標基因NlATG13的表達水平較顯微注射dsGFP的對照組顯著降低(P值分別為0.007, 0.003, 0.024和0.009)，分別下降到25.1%, 16.9%, 35.1%和26.7%(圖4)?？梢?，RNA干擾有效降低了靶標基因的表達量。

圖4 顯微注射dsRNA至褐飛虱3齡若蟲對NlATG13相對表達量的影響

2.5 RNA干擾NlATG13對褐飛虱中腸細胞自噬及糖原的影響

透射電鏡結果顯示，RNA干擾NlATG13后中腸上皮細胞自噬被明顯抑制，細胞中僅有少量自噬泡，且伴有不同程度的糖原顆粒積累，有的細胞中糖原顆粒聚集在自噬泡的附近只被部分降解(圖5: A)，有的細胞有大量糖原顆粒積累，但只有極少量自噬泡參與降解(圖5: B)。在顯微注射dsGFP的對照組中褐飛虱中腸上皮細胞存在基本自噬，可以看到適量的自噬泡，但幾乎沒有糖原顆粒積累(圖5: C, D)。上述結果表明，RNA干擾NlATG13抑制了褐飛虱中腸細胞自噬，影響了細胞正常的生理過程，并導致葡萄糖利用率下降和糖原的積累。

圖5 顯微注射dsRNA至褐飛虱3齡若蟲4 d對中腸上皮細胞自噬及糖原的影響

2.6 RNA干擾NlATG13對糖原合成與代謝相關基因表達的影響

結果發現RNA干擾NlATG13對NlGS,NlGSK3和NlGP的表達量均無顯著性影響(P值分別為0.377, 0.319和0.473)(圖6: A)。據此推測，糖原積累可能主要由于RNA干擾NlATG13導致的糖原自噬受阻，而受糖原合成與代謝通路相關基因表達的影響較小。

2.7 RNA干擾NlATG13對機體細胞ATP含量的影響

結果表明，dsNlATG13處理組的ATP水平較dsGFP顯微注射組(對照)顯著降低(P=0.003)，為0.24 nmol/L·μg，而對照ATP含量較高，為1.35 nmol/L·μg(圖6: B)。

2.8 RNA干擾NlATG13對褐飛虱存活率的影響

在進行NlATG13 dsRNA顯微注射后，褐飛虱的存活率從第2天開始較對照組明顯下降(P<0.01)；在第10天，dsNlATG13處理組的存活率下降到41.4%(P<0.01)，而對照組的存活率保持在85.6%的較高水平(圖6: C)。因此，RNA干擾NlATG13對褐飛虱存活率有顯著性影響。

圖6 顯微注射dsRNA至褐飛虱3齡若蟲4 d對糖原合成與代謝相關基因表達量(A)、ATP含量(B)和褐飛虱存活率(C)的影響

收集RNA干擾NlATG13后死亡的褐飛虱，在顯微鏡下觀察形態，發現有部分死亡的褐飛虱蛻皮障礙，而對照組蛻皮順利(圖7)。

圖7 RNA干擾NlATG13后褐飛虱死亡時的形態

3 討論

本研究首次克隆了褐飛虱自噬相關基因NlATG13的全長cDNA，對其核酸序列及氨基酸序列進行了生物信息學分析，揭示了NlATG13在褐飛虱中的時空表達規律，明確了NlATG13參與褐飛虱中腸細胞自噬，在褐飛虱正常生理過程中發揮作用。目前，對昆蟲自噬的研究主要集中在完全變態的昆蟲，并且大多在昆蟲的細胞水平上進行，側重于自噬的調控機制闡釋，很少探討自噬對個體生存情況的影響(Leeetal., 2002; Scottetal., 2007; Casatietal., 2012; Liuetal., 2013; Zhanetal., 2018)。因此，本研究的發現豐富了褐飛虱等不完全變態昆蟲的細胞自噬信息。同時，本研究還提供了一個新的褐飛虱防治的潛在靶標NlATG13，為后續研發基于RNA干擾的害蟲防治技術提供了新的線索。

研究表明自噬在昆蟲生長發育中的作用具有時空差異性，自噬相關基因在不同發育階段，對不同組織器官有不同的影響(Wenetal., 2017; Nagyetal., 2018)。在本研究中，我們也發現，NlATG13在褐飛虱各發育階段均有表達，3和5齡若蟲的表達量顯著高于1-2齡若蟲、雌成蟲和雄成蟲的?？梢?，NlATG13在褐飛虱各發育階段均發揮作用，對3-5齡若蟲尤為重要(圖3)。由于1-5齡若蟲期褐飛虱的體長和體重均呈指數增長，從3齡開始其體長和體重均有較快增加(鄒運鼎, 1984)，因此，3和5齡若蟲NlATG13表達量的增高可能與機體快速發育對物質和能量的需求增加有關。此外，本研究還發現，NlATG13被RNA干擾的若蟲死亡時會出現蛻皮障礙，提示NlATG13可能參與蛻皮過程，而進入成蟲期后，褐飛虱不再蛻皮，NlATG13與蛻皮相關的功能減退，其表達量也隨著降低。NlATG13參與蛻皮過程，可能與舊皮成分回收和新皮合成有關，但具體機制有待進一步探明。

基因表達模式分析還表明，NlATG13在褐飛虱不同組織中的表達量也有差異，其中在頭中的表達量最高，脂肪體、中腸和卵巢中的處于中等水平，胸部的表達量最低(圖3)。頭部是神經比較豐富的部位，而自噬在神經元細胞的功能維持中具有重要作用。自噬能夠幫助清理神經元細胞中的蛋白質沉積物，比如在神經變性疾病發生過程中出現的蛋白質等，自噬也可以影響Ca2+的釋放，進而影響神經遞質的釋放和神經沖動(Haraetal., 2006; Juhászetal., 2007; Simonsenetal., 2008; Kuijpersetal., 2021)。NlATG13在褐飛虱脂肪體的表達量也較高(圖3： B)，脂肪體富含脂類成分，而自噬在脂類物質的動員過程發揮作用(Rustenetal., 2004; Scottetal., 2004);NlATG13在褐飛虱卵巢中表達量較高(圖3： B)，可能參與卵子發育過程的營養物質吸收，以及卵黃蛋白原等的分解利用(Brennandetal., 2015);NlATG13在褐飛虱胸部的表達量最低(圖3： B)，可能的原因在于，胸部是昆蟲翅和足著生的部位，與昆蟲的運動密切相關。由于本研究選擇的褐飛虱為實驗室飼養種群，飼料苗養分充足，褐飛虱可以長時間在相對固定的地方取食，無需太多的運動(如跳躍、遷飛等)，因此胸部肌肉活動量小，肌肉線粒體的損傷相對較少，線粒體等細胞器的自噬水平相應較低。

本研究重點考察了中腸相關的自噬，發現RNA干擾NlATG13會抑制中腸細胞自噬，自噬泡明顯減少，糖原在中腸積累，且有少量自噬泡參與糖原降解；而RNA干擾GFP的對照組有較多自噬泡，部分自噬泡含有線粒體，但未見明顯的糖原顆粒積累(圖5)。我們認為可以從以下幾方面進行解釋：首先，自噬降解的細胞成分或細胞器種類會因細胞生理或病理狀態不同而不同，因此，就會出現線粒體自噬、糖原自噬、核糖體自噬、內質網自噬等不同現象。在細胞正常生理狀態下，比如本研究顯微注射dsGFP情況下，中腸細胞基本不受RNA干擾的影響，細胞的吸收和分泌等功能正常進行(圖5)，由于這些生理過程需要不斷消耗ATP，線粒體也因為不停地進行電子傳遞和ATP合成，很容易損傷，在這種情況下，細胞發生線粒體自噬為正?，F象(Lipov?eketal., 2019; Kuijpersetal., 2021)。而自噬到后期，自噬泡就表現為空泡(圖5: C, D)。其次，在細胞處于dsATG13處理情況下，細胞自噬受到干擾，細胞正常的生理過程因此受到影響，其中包括損傷的線粒體不能及時清除、細胞機能發生障礙，葡萄糖的利用率下降等，這時就會出現線粒體自噬減少，但糖原積累的現象(圖5: A, B)。糖原的積累可以通過合成加快或分解受阻實現，本研究關于糖原合成與分解的研究表明，RNA干擾NlATG13對NlGS,NlGSK3和NlGP的表達量均無顯著性影響(圖6: A)。據此推測，由于糖原合成與代謝相關基因或酶的表達變化導致糖原積累的可能性較小，而自噬障礙導致的細胞機能下降及葡萄糖的利用率降低，即糖原合成的底物葡萄糖含量上升，可能是導致糖原積累的主要原因。

綜上，本研究通過對NlATG13進行RNA干擾，明確了NlATG13在細胞自噬中的作用，并考察了糖原降解及褐飛虱存活等指標，初步探明了該基因在褐飛虱中的部分功能。今后，有必要進一步研究RNA干擾NlATG13對褐飛虱生長發育和繁殖力等的影響，進一步探明RNA干擾NlATG13影響褐飛虱生長發育、生存和繁殖能力的機制，全面評價其在褐飛虱防治中的潛力。