液體活檢在乳腺癌精準治療中的應用進展及展望

張 羽，劉 強

中山大學孫逸仙紀念醫院乳腺腫瘤中心，廣東 廣州 510000

在全世界范圍內，乳腺癌是最常見的惡性腫瘤，約占女性惡性腫瘤的30%，死亡率與發病率之比為15%［1］。自從乳腺癌的分子特征，包括免疫組織化學標志物，如雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和Ki-67增殖指數；基因組標志物，如BRCA1、BRCA2和PIK3CA；以及免疫學標志物，如腫瘤浸潤淋巴細胞和程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1），被廣泛描述以來，人們看待乳腺癌的方式已經發生了巨大的變化［2］。近年來，隨著分子生物學技術以及“組學”知識體系的迅速擴大，惡性腫瘤的分子多樣性和復雜性正在被逐漸揭示［3］，治療方式也從以腫瘤類型為導向轉向以基因為導向，即根據生物標志物分析為患者進行個體化治療［4］，尤其是對于具有極其復雜且個體獨特基因改變的轉移性癌癥［3，5］，以基因為導向的精準治療更是給患者帶來了新的希望。從患者獲得的腫瘤分子圖譜可以優化癌癥個性化治療方案的選擇，以及顯著改善對治療反應、耐藥及腫瘤復發的監測［6］，惡性腫瘤的治療已經進入精準醫學時代。

液體活檢即通過對體液中腫瘤衍生材料所包含的基因組、蛋白質組等數據進行分析，可以獲得并縱向實時監測關于個體患者腫瘤特征的詳細信息，如腫瘤基因突變、表觀遺傳學改變等，為基于精準醫學的治療開辟新思路。本文將簡要介紹液體活檢中研究較為廣泛的兩種腫瘤衍生材料——循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）和循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），就近年來CTC及ctDNA在乳腺癌精準治療中的應用研究進展進行綜述，并對未來的發展趨勢予以展望。

1 液體活檢概述

液體活檢，即從患者的血液、尿液、唾液、糞便、腦脊液等體液中分離獲得腫瘤DNA、RNA、腫瘤細胞或細胞外囊泡等腫瘤衍生材料的過程［7］，通過進一步分析可以獲得腫瘤基因突變、關鍵基因的拷貝數改變、蛋白質組學、表觀遺傳學改變等信息。相較于傳統活檢，液體活檢在克服腫瘤異質性、克隆變異，以及連續采樣等方面具有顯著優勢，使得在整個治療過程中實時反映腫瘤分子圖譜、縱向監測腫瘤反應和復發等變得可行。既往研究顯示，液體活檢在乳腺癌早期分子診斷、制訂個性化治療方案、評估治療效果、預測預后等方面均可能發揮作用［8］。

1.1 液體活檢中的循環腫瘤細胞

CTC是主動或被動從原發和（或）轉移部位腫瘤中脫落進入人體循環的腫瘤細胞［6］。它們在血液中的數量相當少，每百萬個白細胞中幾乎僅有一個CTC［9］，且在外周血中的半衰期非常短（1.0～ 2.4 h）［10］，這決定了CTC分離技術的高難度及高挑戰性。

許多技術已經被開發用于從液體標本中檢測存活的CTC，以獲得關于腫瘤的信息。這些技術主要基于以下幾種原理：

①基于免疫磁珠的C T C 分離技術。如EPISPOT，使用針對存在于腫瘤細胞上的上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的膜結合抗體，并隨后在體外或體內條件下進行擴增；CellSearch，使用抗體標記的磁珠富集具有上皮細胞系標志物（如EpCAM）的CTC，但其局限性在于并不是所有的CTC都帶有EpCAM［11］；AdnaTest，在CellSearch的基礎上還包括聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）步驟來檢測腫瘤細胞的mRNA；CTC CHIP，它包含數千個標記抗體的小微柱，已經被用來從血液樣本中捕獲攜帶特定腫瘤抗原的CTC［12］。② 基于負耗盡的CTC分離技術：其原理為利用針對除CTC外細胞（如白細胞、紅細胞、血小板等）的反染色標志物，將它們從液體活檢樣本中耗盡，從而CTC得以從血液樣本中濃縮，如EasySep Depletion Kit、RosetteSep，其局限性在于其他血液成分與CTC之間可能存在交叉，在大量白細胞下拉中有CTC丟失的風險［13］。③基于細胞大小的CTC分離技術：其中尺寸放大技術通過使用標記有抗EpCAM抗體的微珠來人為增加CTC的尺寸，克服由于CTC的大小幾乎與白細胞相同所致CTC損失的限制，從而提高細胞回收率和純度；CELE系統則可以同時利用尺寸及變形性差異（CTC比白細胞更容易變形）來分離和分析CTC，相較于CellSearch系統有更高的靈敏度。④ 基于表面電荷及極化率差異的CTC分離技術：ApoStreamTM，相較于CellSearch系統同樣被證明可以提高CTC的檢測和回收［14］。

1.2 液體活檢中的循環腫瘤DNA

ctDNA只占循環中細胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）的0.1%～ 10.0%，而cfDNA正常血漿水平僅為10～ 100 ng/mL［15］，因此ctDNA在癌癥患者外周血中的含量也是相當低的。此外，ctDNA片段相較于cfDNA更短，為20～ 50個堿基對［16］。血漿中的ctDNA水平隨腫瘤負荷、分期和治療反應而變化［17］，與CTC不同，ctDNA被認為是指示腫瘤負荷的生物標志物［18-19］。除了定量外，ctDNA在精準醫學中的臨床應用還體現在可以分析血漿中的ctDNA變異。

與分離和分析極低水平的ctDNA相關的限制在很大程度上已經被不斷發展的技術應用所減少［20-21］，但樣品處理、ctDNA分離和分析方法尚未完全標準化。ctDNA的分析主要包括以下兩類方法：①靶向方法：專注于特定基因組區域中的特定基因重排或基因突變，而這些基因重排或基因突變是該類型腫瘤中常見的變異（如乳腺癌中的TP53、PI3KCA、GAB2、IRS2等）。包括基于PCR的液滴數字聚合酶鏈式反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）、光束法（BEAMing）、個性化重排末端分析（personalized analysis of rearranged ends，PARE）等，以及基于二代測序（next generation sequencing，NGS）的標記擴增深度測序（tagged-amplicon deep sequencing，Tam-Seq）等方法。這些方法在多種腫瘤中顯示出很高的靈敏度和特異度［22-25］。② 非靶向方法：與靶向方法不同，非靶向方法對血漿ctDNA進行全基因組圖譜分析，因此獲得的腫瘤基因組信息相對更全面。如大規模平行測序、高通量IlluminationsMiseq等。血漿ctDNA全基因組分析在多種腫瘤中被證實可以獲得關于腫瘤基因突變、拷貝數改變，以及染色體重排等信息［26-27］。

2 液體活檢在乳腺癌精準治療中的應用研究進展

液體活檢在乳腺癌精準治療中的研究包括預測生存預后、檢測微小殘留疾?。╩inimal residual disease，MRD）、監測治療效果，以及指導治療方案的選擇等，以下將從該4個方面對近年來的研究進展簡要敘述。

2.1 預測生存預后

對于早期乳腺癌，一項前瞻性研究發現在接受手術及輔助化療前具有1個或更多CTC的Ⅰ～ Ⅲ期乳腺癌患者的無進展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）顯著縮短［28］。2016年的一項meta分析也提示在原發性乳腺癌患者中，CTC的存在是無病生存期（disease-free survival，DFS）、OS、乳腺癌特異性生存期（breast cancer-specific survival，BCSS）和遠處無病生存期（distant disease-free survival，DDFS）的一個獨立預測因子［29］。除了CTC數目，CTC中表觀遺傳學改變也可以預測預后，在Chimonidou等［30］從乳腺癌患者血液分離的EpCAM+CTC中，腫瘤/轉移抑制基因（如SOX17、BRMS1和CST6）啟動子區的表觀遺傳學改變，如DNA甲基化，與腫瘤轉移增強和預后不良相關。另外，在影像學的基礎上，血液中的CTC水平還能提供額外的預后信息［31］。既往研究顯示，ctDNA的檢測同樣與轉移復發風險的增加相關，本團隊的一項研究發現新輔助化療開始前基線ctDNA陽性與較短的DFS和OS相關，特別是在激素受體陰性患者中［32］。PEARLYⅢ期臨床試驗納入465例Ⅱ～ Ⅲ期TNBC患者，中位隨訪16.8個月，在新輔助化療之前進行ctDNA拷貝數變異（copy number aberration，CNA）負荷檢測，并分析其預后價值。發現新輔助化療前基線ctDNA能夠預測Ⅱ～ Ⅲ期TNBC患者的復發風險，并且ctDNAⅠ-score獨立于病理學完全緩解（pathological complete response，pCR）狀態顯示出預后價值，這提示基線ctDNA可作為TNBC患者升級或降級（新）輔助治療策略的有效臨床決定因素［33］。其他類似研究顯示，新輔助治療1個周期后ctDNA陽性與較短的DFS和OS相關［34］。Magbanua等［35］發現對于高危早期乳腺癌患者，新輔助治療期間或結束后ctDNA未清除是反應不佳和遠處復發的重要預測因素，而ctDNA清除［即使未達到病理學完全緩解（nonpathological complete response，non-pCR）］則與較好的生存率相關，新輔助治療期間對ctDNA進行個性化監測可能有助于實時評估治療反應，并有助于調整pCR作為生存的替代終點。2022年的一項meta分析報道基線及新輔助治療結束后ctDNA的存在與較差的無復發生存（recurrencefree survival，RFS）及OS相關［36］。除此之外，術后ctDNA監測同樣能夠準確區分有遠處復發和無遠處復發的患者（靈敏度為93%，特異度為100%）［36］，并且比臨床診斷疾病復發平均早數月［37-38］。

對于晚期乳腺癌，現有研究已證實在接受全身治療前外周血中CTC的數量是轉移性乳腺癌PFS和OS的獨立預測因子［39］，基線CTC水平高與較差的PFS及OS相關［40-41］，并且在全身治療期間任何時候CTC數量增加（≥5vs＜5）與轉移性乳腺癌患者較差的PFS和OS相關［42］。與CTC相似，ctDNA水平與進展期乳腺癌生存結果密切相關［40，43］。除了ctDNA水平，ctDNA中遺傳改變的數量(＜2vs≥2)也被發現對PFS和OS有影響［40］。除此之外，CTC及ctDNA在治療前后的動態變化與生存結果顯著相關，既往研究顯示，在轉移性乳腺癌患者中，治療后CTC計數的增加與PFS和OS縮短相關，當添加至完整的臨床病理學預測模型中時，CTC計數還可以提高對轉移性乳腺癌預后的預測價值［41］。O’Leary等［44］發現，哌柏西利聯合氟維司群治療15 d后，PIK3CA突變ctDNA水平的相對變化對PFS有很強的預測作用，CDR15［治療第15天ctDNA突變豐度（突變拷貝數/mL）相對于基線的比率］中位數水平以下患者的PFS顯著延長。因此，可以預見，液體活檢有可能發展成為預測乳腺癌患者生存的早期替代終點。

2.2 檢測MRD

在完成治愈性治療的早期癌癥患者中，相當一部分體內仍存在MRD，這些病灶在最初局部和全身治療后持續存在，成為遠處轉移復發的潛在來源，尤其是激素受體陽性的乳腺癌，這是與晚期復發有關的典型癌癥［45］。相較于出現臨床復發后給予解救治療，及時發現MRD可以極大地幫助預防復發和增加這些患者的治愈機會，這可能是由于微轉移患者腫瘤負荷低，且MRD可能會隨著時間的推移而出現克隆演變導致腫瘤內部高度異質性［46］。MRD檢測已廣泛用于血液系統惡性腫瘤患者［47-48］，但對于實體腫瘤患者，治愈性治療后患者體內ctDNA和CTC遠低于已確診轉移的患者，因此需要使用超靈敏檢測技術，受上述因素的限制，MRD檢測仍然具有挑戰性。然而，近年來隨著液體活檢技術尤其是ctDNA的發展，實體腫瘤MRD檢測變得可行并在許多實體腫瘤中被報道［49-52］。

ctDNA和CTC在外周血中的典型轉運時間在數小時范圍內［53］，因此，在治愈性治療數月或數年后檢測到ctDNA和（或）CTC表明MRD的持續存在。既往研究顯示，高危乳腺癌患者化療結束后2年CTC陽性狀態預示著較短的DFS和OS［54］。2018年，Sparano等［55］發現在確診后至5年內出現CTC可以預測可手術的激素受體陽性HER2-乳腺癌患者的晚期復發，在激素受體陽性的353例患者中，CTC陽性組的年復發率為21.4%，而CTC陰性組僅為2.0%，并且在多因素分析中，CTC檢測結果陽性將使復發風險增加13.1倍。多項小型研究表明，手術或完成標準全身系統治療后ctDNA-MRD（基于ctDNA的微小殘留疾?。╆栃曰颊哳A后差，是復發的高風險群體。Olsson等［24］發現新輔助治療和術后ctDNA監測可用于評估MRD及復發風險，其靈敏度和特異度分別達到93%、100%，在86%的患者中，基于ctDNA的檢測先于臨床檢測轉移，平均提前時間為11個月。Garcia-Murillas等［37］也發現，在完成治愈性治療后檢測血漿中的ctDNA可以高度準確地預測轉移復發，而序列樣本中的突變跟蹤可以增加預測復發的靈敏度，相較于臨床復發中位提前時間為7.9個月。2019年Garcia-Murillas等［56］前瞻性使用個性化的腫瘤特異性PCR，監測接受手術及全身系統治療后患者外周血中的ctDNA，在隨訪的第一年每 3個月采集1次，隨后每6個月采集1次，發現與臨床復發相比，ctDNA檢測到復發的中位時間提前10.7個月（95% CI：8.1～ 19.1 個月），并且與所有乳腺癌亞型相關。此外，一項基于83例確診5年以上臨床明確無復發的高危激素受體陽性/HER2-乳腺癌患者的前瞻性研究，中位隨訪8.4年，所有發生遠處轉移的6例患者均可在外周血中檢測到ctDNA，且相較于臨床復發中位時間提前達1年［57］。另外一項研究對納入156例乳腺癌患者的1 141個術后監測血液樣本進行了回顧性分析，結果發現ctDNA檢測陽性的患者手術后RFS較差（HR=47.50；95% CI：18.5～ 161.4；P＜0.001），且術后連續監測ctDNA可相較于臨床顯著提前預測轉移性復發（中位10個月，范圍：0～ 39個月），其中激素受體陽性/HER2-亞型提前預測復發中位數為15個月（范圍：2～ 39個月）、TNBC亞型為9個月（范圍：0～ 20個月）、激素受體陽性/HER2+亞型為8個月（范圍：5～ 14個月）、HR-/HER2+亞型為6個月（范圍：0.5～ 12個月）［58］。因此，外周血ctDNA與早期乳腺癌未來復發高風險相關，更重要的是，早期發現轉移性復發為治療干預提供了可能的窗口期，但仍需要前瞻性研究來評估分子復發檢測指導輔助治療的潛力。

2.3 監測治療效果

液體活檢作為一種相對無創的活檢方法，在治療期間易于獲得連續的血液樣本，尤其是當腫瘤轉移至傳統活檢難以取樣的部位（如肺或腦等），更加體現出液體活檢的優勢。既往研究報道，無論是早期乳腺癌的新輔助治療、輔助治療，還是轉移性乳腺癌的解救治療，液體活檢都可以用于縱向監測治療效果，進而指導臨床決策。

2.3.1 新輔助治療

本團隊使用覆蓋1 021個基因的大型面板，縱向監測接受新輔助治療的早期乳腺癌患者外周血中的ctDNA，發現在新輔助治療2個周期及新輔助治療結束后ctDNA的水平與腫瘤應答顯著相關，并且新輔助治療2個周期后ctDNA水平的變化預測局部腫瘤對治療的反應比超聲檢查更好［32］。2021年Magbanua等［35］使用包含16個左右突變基因的個性化面板，監測新輔助治療期間患者外周血ctDNA的動態變化，發現ctDNA的清除與腫瘤對治療的反應相關，早期（1個周期后）清除相較于早期未清除患者的pCR率高，而越后期未清除對non-pCR的陽性預測值越高。另外一項研究納入了ABCSG-34試驗招募的187例患者（其中127例為激素受體陽性，57例為TNBC），回顧性分析了患者新輔助系統治療（neoadjuvant systemic treatment，NST）期間381例血液樣本，發現在NST中期檢測和持續存在ctDNA有可能負面預測對NST的反應，并識別無法達到pCR或將被歸類為殘留腫瘤負荷（residual cancer burden，RCB）Ⅱ/Ⅲ的患者，提示pCR或RCB的無創鑒定在未來可能有助于臨床決策，進一步提高患者獲益［59］。除此之外，甲基化RASSF1同樣與新輔助治療反應（降低vs不降低）及預測復發相關（隨訪3～ 33個月）；而甲基化基因清除與pCR顯著相關［60］。因此，在新輔助治療期間監測ctDNA可能有助于實時評估治療反應及療效。

2.3.2 輔助及解救治療

在HER2陰性的早期乳腺癌患者中，手術和（新）輔助化療后使用曲妥珠單抗治療并不會降低CTC檢出率［61］，而既往的一項大型隨機試驗恰好顯示與在該患者群體中曲妥珠單抗療效為陰性結果［62］。在接受化療或內分泌治療的轉移性乳腺癌患者中，CTC計數與影像學疾病進展之間存在強相關性，并且這種相關性適用于成像時（優勢比OR=6.3）、成像前3～ 5周（OR=3.1）和成像前7～ 9周（OR=4.9）的CTC結果，這表明CTC可用于實時監測治療反應，并在必要時迅速改變治療方案［63］。而Dawson等［64］研究發現，在接受全身治療的晚期乳腺癌患者中，與CA153或CTC相比，ctDNA水平顯示出更大的動態范圍，以及與腫瘤負荷變化更顯著的相關性。并且19例患者中的10例（53%）在影像學確定疾病進展前平均5個月，ctDNA水平在一個或多個連續時間點增加，這提示ctDNA可能是監測治療反應更敏感的生物標志物。

2.4 指導治療方案的選擇

通過采集患者的外周血進行CTC和（或）ctDNA分析，可能檢測出具有遺傳和（或）表觀遺傳學變異的患者群體，這些變異可能是特定藥物的治療或耐藥靶點；另外，液體活檢有助于以“實時”方式檢測腫瘤相關基因的不斷演變，這有助于選擇并及時更換更有效的治療方案。尤其是對于轉移性乳腺癌的患者，每個患有轉移性癌癥的患者都有一組復雜的、往往是獨特的基因組異常［3，5］，因此，為了精確地靶向惡性腫瘤，治療更加需要個性化。

利用CellSearch系統針對ER、B細胞淋巴瘤/白血病-2基因（B cell lymphoma/leukemia-2gene，BCL2）、人表皮生長因子受體2（epidermal growth factor receptor 2，EGFR2）和Ki-67增殖指數等標志物分離的CTC所開發的新型CTC內分泌治療指數，是預測乳腺癌患者內分泌治療反應的重要參數［65］。既往有研究顯示，芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitor，AI）可能誘導ESR1基因突變［66-67］，ctDNA中ESR1突變陽性的晚期乳腺癌患者對依西美坦的反應不佳，與內分泌耐藥及疾病進展相關［66］，而在將藥物方案從依西美坦改為氟維司群（ER下調劑）或在依西美坦中加入依維莫司（mTOR抑制劑）后，PFS有所改善［68］。另外，CTC中ESR1甲基化改變則與對依維莫司/依西美坦方案無反應有關［69］。除此之外，ctDNA中的ESR1突變可以在臨床進展前的6、7個月被檢測到，這為早期治療干預提供了充足的機會［70］。O’Leary等［44］研究發現，在接受哌柏西利與氟維司群聯合治療的激素受體陽性晚期乳腺癌患者中，當在血漿中跟蹤PIK3CA主干突變時，PIK3CA突變ctDNA水平的早期相對變化預測長期生存結果的時間遠遠早于腫瘤大小的變化，在治療第15天通過檢測ctDNA突變豐度即可對治療反應進行個體化早期評估，這為臨床治療方案的選擇和更換提供指導。Arpino等［71］發現結合ctDNA和胸苷激酶1活性（thymidine kinase 1 activity，TKa）兩種生物標志物的早期動態評估可能會改善RIB+LET（瑞博西尼+來曲唑）聯合治療的療效預測，在治療無效患者中，高度呈現出ctDNA+/TKa+。且僅需兩周的時間，即可以區分對治療有效和無效的患者。這種通過極小創傷、不需要組織穿刺來早期預測內分泌治療效果的方法具有良好的應用前景。乳腺癌患者液體活檢分析的關鍵研究見表1。

表1 乳腺癌患者液體活檢分析的關鍵研究Tab.1 Key studies of liquid biopsy analyses in patients with breast cancer

3 總結及未來展望

在過去的5年里，隨著NGS、ddPCR等技術的發展，液體活檢在臨床上的潛在應用得到了廣泛的研究，在乳腺癌的精準治療中顯示出巨大的潛力。它可以監測對不同治療方案的反應，并且是比影像學更敏感的生物標志物，CTC和ctDNA能夠在影像學改變出現之前的幾個月預測疾病進展，可以幫助臨床醫師在必要時及時改變治療方案，防止疾病復發或進展。液體活檢還可以用于檢測完成手術和（新）輔助治療后體內是否有微小殘留疾病，及時發現MRD可以極大地幫助預防復發和增加這些患者的治愈機會。此外，ctDNA的分子圖

譜比原發腫瘤更能反映復發/轉移疾病，因此ctDNA測序也可以為后續治療提供更好的指導。

對于使用內分泌治療的乳腺癌患者，ctDNA檢測有助于識別對AI等療法產生耐藥的突變和（或）表觀遺傳學改變，這有助于在疾病進展之前盡早改變治療方案。

雖然液體活檢在乳腺癌精準治療方面的研究取得了令人矚目的進展，但是仍存在一些問題。譬如多數患者隊列相當?。ㄓ绕涫莄tDNA分析，很多研究中評估的患者數量＜50例），需要在更大的前瞻性臨床試驗中進一步驗證這些發現；此外，在分離和分析血液中腫瘤衍生物方面，還需要更多的工作來進一步改進技術，并在目前眾多的技術和檢測程序中，確定最優的檢測策略，為其在臨床上的使用建立標準化方案。

相信隨著時間的推移，液體活檢將在乳腺癌臨床實踐中發揮更大的作用。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。