納米銀避孕泡沫及各組分對精子活力影響的研究

葉如憲 陳大可

1.浙江中醫藥大學(浙江 杭州 310000);2.溫州市人民醫院(浙江 溫州 325000)

前 言

目前,納米材料廣泛應用于各個領域,包括工程、化學、醫學等[1]。 其中,納米銀制品由于其具有良好的殺菌效果,被廣泛加入到各種材料中。 如一些食物保鮮材料就是利用納米銀制成,從而達到食物保鮮的效果[2]。 同時其也被用于一些婦女保健產品中,周玉海[3]等研究表明納米銀治療萎縮性陰道炎效果顯著。而納米銀避孕泡沫是利用納米銀研制的新型避孕產品,其主要成分為納米銀顆粒、辛苯聚醇(ON-9)以及賦形劑(聚乙烯醇材料等)。 是一種具有避孕、抗菌、潤滑三效合一的避孕產品[4]。 相關研究表明其避孕效果顯著,200 對育齡夫婦的避孕成功率為98.5%,效果受到受試者的認可,大部分人愿意繼續使用[5]。 但是現階段的研究僅局限于對納米銀避孕泡沫整體產品的避孕原理研究,而缺乏對其各組分的避孕作用的研究。 本研究擬通過探究納米銀避孕泡沫各組分及制劑對精子活力的影響,以深入了解其避孕機制,并為其功能效果的改善及相關避孕產品的研制提供基礎和新思路。

材料與方法

一、實驗材料

(一)供試品

20ppm 納米銀溶液(上海滬正納米科技有限公司提供);1.2 辛苯醇醚(ON-9)原液(上海市西寶生物科技有限公司提供)、納米銀避孕泡沫劑原液(廣東同德藥業有限公司提供);賦形劑(上海市西寶生物科技有限公司提供);500ml 生理鹽水(江蘇四環生物制藥有限公司提供)

(二)試劑耗材

1.人精液標本:9 份,選取有生育能力、禁欲7 天的男性精液,精子活動率≥70%,前向運動精子≥25%,畸形≤20%。

2.大鼠精液標本:美國斯潑累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠,3 只,雄性,250 ～300g,由上海市西普爾-比凱實驗動物有限公司提供,生產許可證號:SCXK(滬)2013-0016。 取SD 雄性大鼠雙側附睪置于無菌小燒杯中,NS 沖洗后加Tyrode 液4ml,用解剖剪在附睪尾劃一十字形切口后,置37℃水浴箱孵育10 分鐘后,取一滴于玻片上,低倍鏡下(10×10)檢查精子活率,要求活動率≥60%;符合條件后吸取0.1ml 加入裝有1.9ml精子稀釋液的小試管中,混勻,靜置3min,取一滴于計數板中,高倍鏡(10×40)下計數(方法:4 小格精子數×4×稀釋倍數(20 倍)×104),根據計數所測得的密度,加Tyrode液將精液稀釋到107/ml,置37℃水浴中待用。

3.精子稀釋液:取NaHCO33g,,甲醛1ml,加蒸餾水100ml 配制而成。

4. 精子營養液(Tyrode 液):稱取NaCl 4. 0g,KCl 0.10g,CaCl20. 10g,MgCl2·6H2O 0. 05g,NaH2PO4·2H2O 0.025g,NaHCO30.50g,Glucose 0.50g,用雙蒸水分次溶解,配至1000ml,溶液配好后密閉,置4℃冰箱保存,實驗前1 天配好。

(三)實驗儀器

電子天平、生物顯微鏡、恒溫水浴箱、渦旋振蕩器,三通道計時器

二、實驗方法(精子失活實驗)

(一)預實驗:將配制好的不同濃度的納米銀溶液、ON-9、納米銀泡沫劑、賦形劑、生理鹽水和陽性對照組NP-9 分裝于Eppendorf 管并置37℃水浴中保溫待用。分別對大鼠及人精液進行體外抑精試驗。 參照Sander-Cramer 法,以全部精子失活為終點,測出藥物在20s ～3min 內的有效抑精濃度,根據預實驗結果,確定正式試驗劑量和分組。

(二)正式試驗:根據預實驗結果,我們確定了正式試驗受試品濃度。 具體將配制好的不同濃度的納米銀溶液(20ppm、10ppm、5ppm、2. 5ppm)、ON-9(250ppm、125ppm、62.5ppm)、納米銀泡沫劑(1 ∶8 稀釋、1 ∶32 稀釋、1 ∶64 稀釋、1 ∶128 稀釋、1 ∶256 稀釋)、賦形劑(原液、1 ∶2 稀釋、1 ∶4 稀釋、1 ∶8 稀釋)、生理鹽水和陽性對照組NP-9 分裝于Eppendorf 管并置37℃水浴中保溫待用。 對大鼠精液及人體精液進行體外精子失活試驗。

(三)選擇納米銀、ON-9 和賦形劑20 秒完全抑制精子的濃度及以下2 個濃度,共3 個濃度,分別觀察并計算1min 時納米銀、ON-9 和賦形劑抑制對大鼠精子活力的抑制率(%)。

(四)參考上述納米銀避孕泡沫各組分有效抑精濃度和作用時間點,將配制好的20s 不能完全抑制大鼠及人精子活力的納米銀溶液10ppm、ON-9 125ppm 和1 ∶8 稀釋比賦形劑按1 ∶1 ∶1 混合后與大鼠精液作用,觀察其在20s ～3min 內是否能完全抑制精子活力及作用時間點。

三、統計方法

實驗結果利用SPSS 進行統計,數據描述采用均數±標準差的形式表示。

實驗結果

一、納米銀避孕泡沫各組分精子體外抑精藥效學研究

(一)納米銀避孕泡沫各組分對大鼠精子體外抑精藥效學研究

納米銀20ppm 體外20 秒內可以將大鼠精子全部抑制失活,10ppm 在2min 時可以將大鼠精子全部抑制失活,5ppm 則在3min 中內可以將大鼠精子全部抑制失活;ON-9 250ppm 體外20s 內可以將大鼠精子全部抑制失活,125ppm 在2min 時可以將大鼠精子全部抑制失活,62.5ppm則在3min 中內可以將大鼠精子全部抑制失活,賦形劑原液、1 ∶2 稀釋及1 ∶4 稀釋劑量體外20 秒內可以將大鼠精子全部抑制失活,1 ∶8 稀釋劑量則在2min 內可以將大鼠精子全部抑制失活。 具體見表1。

表1 納米銀避孕泡沫各組分對大鼠精子的體外有效抑精濃度和時效關系

表1 納米銀避孕泡沫各組分對大鼠及人精子的體外有效抑精濃度和時效關系

(二)納米銀避孕泡沫各組分對人精子體外抑精藥效學研究

納米銀20ppm 體外20s 內可以將人精子全部抑制失活,10ppm 在1min 時可以將人精子全部抑制失活,5ppm 則在3min 中內可以將人精子全部抑制失活;ON-9 250ppm 體外20s 內可以將人精子全部抑制失活,125ppm 在1min 時可以將人精子全部抑制失活,62.5ppm則在3min 中內可以將人精子全部抑制失活,賦形劑原液、1 ∶2 稀釋及1 ∶4 稀釋劑量體外20s 內可以將人精子全部抑制失活,1 ∶8 稀釋劑量則在2min 內可以將人精子全部抑制失活。 這一結果與大鼠抑精活性結果類似。結果見表2。

表2 納米銀避孕泡沫各組分對人精子的體外有效抑精濃度和時效關系(續前頁)

表2 納米銀避孕泡沫各組分對人精子的體外有效抑精濃度和時效關系

二、納米銀、ON-9 和賦形劑對大鼠精子抑制率

參考前面納米銀避孕泡沫各組分抑精有效濃度,我們選擇20 秒能完全抑制精子的有效濃度及以下2個濃度(倍比稀釋),共3 個濃度,進行了加藥1min 時納米銀、ON-9和賦形劑抑制對大鼠精子活力的抑制率(%)實驗,結果納米銀20ppm、ON-9 250ppm 和賦形劑1 ∶4 稀釋在20s 內對精子活力的抑制率均為100%,三者各自濃度以下倍比稀釋劑量對大鼠精子活力抑制率相應呈遞減趨勢,有明顯的劑量-反應關系。 詳細結果見表3。

表3 納米銀避孕泡沫各組分不同濃度精子活力抑制率(%)

三、納米銀避孕泡沫各組分混合后對精子作用的失活實驗

(一)納米銀避孕泡沫各組分混合后對大鼠精子作用的失活實驗

納米銀溶液10ppm、ON-9 125ppm 和1 ∶8 稀釋比賦形劑按1 ∶1 ∶1 等比例混合并與大鼠精液作用后,可在20s 內將大鼠精子全部失活,具體見表4。

表4 納米銀避孕泡沫各組分復方對大鼠精子的體外有效抑精濃度和時效關系

(二)納米銀避孕泡沫各組分混合后對人精子作用的失活實驗

納米銀溶液10ppm、ON-9 125ppm 和1 ∶8 稀釋比賦形劑按1 ∶1 ∶1 三者等比例混合并與人精液作用后,可在20s 內將人精子全部失活,具體見表5。

表5 納米銀避孕泡沫各組分復方對人精子的體外有效抑精濃度和時效關系

討 論

當前避孕方法種類多樣,例如口服避孕藥、宮內節育器及避孕套等。 但不可否認的是這些避孕方法都有各自的缺陷。 以宮內節育器為例,性生活體位不正或是患有盆腔炎的婦女,很可能會引發性交痛,少數婦女還會出現經期延長和經血增多的情況[6]。 納米銀是一種陰道內的新型避孕藥具,以乳白色的膨脹泡沫附著于陰道粘膜和子宮穹窿的方式來進行避孕[7]。 但是目前對于該款避孕泡沫的避孕機制的研究還比較少,本研究擬對納米銀避孕泡沫進行組分分解,利用各組分及其聯合作用對大鼠及人精子活力的影響以探究其深層的避孕機制,為未來產品改良或其他避孕產品的開發提供一定的思路。

我們的研究結果提示,不管是作用于大鼠精子還是人精子,納米銀避孕泡沫及其各組分對精子具有滅活作用。 而且由我們的實驗結果提示各組分對精子的殺傷作用隨著各組分濃度的升高而增強,這與之前的相關研究結果類似,Yoisungnern[8]等發現納米銀可以明顯抑制小鼠精子的生活力,且呈劑量應關系。 其可以誘發細胞凋亡、壞死、DNA 鏈斷裂等[9]。 壬苯醇醚也對兔、狗、猴及人精子均有殺傷作用[10]。 在我們的實驗中,賦形劑對體外精子也有一定的殺傷作用,這是在之前的研究中未曾涉及的。 而且上述三種組分在1 ∶1 ∶1的配比下,對精子殺傷具有協同相加作用,這為未來如何調整避孕泡沫的成分配比以加強其避孕效果提供了新的思路與方向。

本次實驗以藥效學為主,在納米銀避孕泡沫避孕機制方面,我們從以下幾點進行研究。 納米銀主要通過抑制精子頂體酶活性,降低精子活力和穿透能力,改變精子形態來發揮殺精避孕的作用。 納米銀避孕泡沫各組分單獨應用對人精子頂體蛋白酶活性,影響精子尾部膨脹率等(精子膜完整性指標)均有抑制作用,尤其對精子頂體蛋白酶的活性影響更為明顯。 頂體蛋白酶位于精子的頭部,它是一種絲氨酸蛋白溶解酶,當精子與卵子的透明帶結合時,頂體酶將活化為二者的結合提供能量,而納米銀則可以抑制頂體蛋白酶的活性,從而阻止精子與透明帶的結合,達到避孕的效果。 通過進一步的研究,將納米銀泡沫各組分混合應用后則可以起到協同的作用,更好的抑制人精子頂體蛋白酶活性,影響精子尾部膨脹率等,從而達到更高效、更安全的避孕效果;然而,作為精子能量代謝重要物質的乳酸脫氫酶,納米銀各組分及混合應用后對人精子乳酸脫氫酶活性則未見明顯抑制作用。 納米銀避孕泡沫成分復雜,在未來可以探索其可能涉及的其他避孕機制,豐富人們對其認識,從而正確開發、對待與使用避孕產品。

結 論

納米銀避孕泡沫各組分(納米銀、ON-9 和賦形劑)單獨使用均具有明顯抑精活性,且三種成分混合具有協同相加作用。