徐貴穎,張連波,王英麗,尚立華,熊蔚蔚,張 陽*
(1.吉林省腫瘤醫院 乳腺外二科,吉林 長春130012;2.吉林省腫瘤防治研究所;3.吉林省前衛醫院)
乳腺癌的發生和發展是一個涉及多基因和多信號通路的過程,Wnt/β-catenin經典通路與乳腺癌的關系是近年來的研究熱點,該通路的活化可能導致乳腺癌的發生。昆布屬于褐藻門藻類,主要含有礦物質、多糖類、多酚類等多種化合物,藥典記載其具有抗炎,抗氧化,抗病毒,抗腫瘤等作用[1],其中昆布多糖類和多酚類對肝癌、結腸癌、膀胱癌、大腸癌、鼻咽癌、卵巢癌、三陰乳腺癌的抑制作用皆有研究報道[2-7]。本研究探討昆布多酚通過調控Wnt/β-catenin信號通路對MCF-7乳腺癌細胞增殖侵襲的抑制作用。
1.1 細胞株人乳腺癌細胞株MCF-7(吉林省腫瘤防治研究所細胞庫提供)。
1.2 主要試劑與儀器干燥昆布(藥材購于吉林省長春市福百草大藥房,由長春中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室張景龍教授鑒定為翅藻科植物昆布Ecklonia kurome Okam的干燥葉狀體),IMDM培養基,Gibco產品;MTT(噻唑藍),Sigma產品;胎牛血清,天津灝洋生物制品科技有限責任公司;DMSO(二甲基亞砜),Sigma產品;低溫離心機,SORVALL RTT USA;全自動酶標儀,labsystems Dragon;電泳儀,上海天能;兔抗β-catenin 抗體(一抗)、兔抗β肌動蛋白(β-actin) 抗體,Abcam 公司;辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(二抗),北京西化儀科技有限公司;TUNEL試劑盒,德國Merk-Calbiochem 公司;Transwell小室,美國Corning公司。
1.3 方法
1.3.1藥品制備 取干燥昆布4 kg,用高速粉碎機粉碎后過30目篩后,液料比40∶1,30%乙醇浸泡2 min,微波450 W,100 s,水浴70℃,30 min,重復3次提取,合并提取液,離心5 000 r/min,15 min,上清真空抽濾,抽提液4℃冰箱靜置12 h,取上清1∶10醇沉,4℃放置24 h,重復醇沉4次,再次離心濃縮醇沉,即得到昆布多酚提取物,冷凍干燥為粉末,即得到純化后的昆布多酚類化合物[8-9]。用沒食子酸標定昆布多酚。用無血清IMDM培養液配制不同劑量組。昆布多酚高劑量組(100 μg/mL)、中劑量組(50 μg/mL)、低劑量組(25 μg/mL)。
1.3.2細胞培養 將人乳腺癌細胞株MCF-7常規培養于含10%胎牛血清的IMDM培養基中,37℃,5%CO2培養。接種對數期生長細胞至96孔培養板,1×105/孔,分為5組,包括陰性對照組(PBS),陽性對照組(阿霉素5 μmol/L),昆布多酚高劑量組(100 μg/mL),中劑量組(50 μg/mL),低劑量組(25 μg/mL),共培養48 h。
1.3.3細胞增殖能力檢測 人乳腺癌細胞株MCF-7培養24 h、48 h后,每孔加入濃度為5 g/L的 MTT溶液20 μl,繼續培養4 h,棄上清加200 μl DMSO,避光震蕩10 min,490 nm酶標儀檢測OD值,計算細胞增殖抑制率。
1.3.4Transwell 法檢測MCF-7細胞侵襲能力 藥物共培養48 h后,取細胞懸液1×105/mL,200 μl接種上室中,底部基質膠上加500 μl 含胎牛血清的IMDM培養基。放入二氧化碳細胞培養箱中培養24 h,棄去上室中的基底膠和MCF-7細胞,放入4%多聚甲醇溶液中固定,附著在上室中的MCF-7細胞進行吉姆薩染色,拍照計數。
1.3.5劃痕愈合實驗檢測MCF-7細胞遷移能力 藥物作用48 h后,將細胞接種于6孔培養板中常規培養至細胞鋪滿板內80%空間,用加樣槍頭對細胞劃線,PBS緩沖液清洗掉落的細胞殘渣,繼續培養24 h,鏡下拍照。細胞遷移率=(1-培養48 h后細胞間距/起始劃痕間距)×100%。
1.3.6TUNEL法檢測MCF-7細胞凋亡情況 分別用不同濃度昆布多酚處理MCF-7細胞,4%多聚甲醛固定,按試劑盒說明進行DAB顯色后,封片,光學顯微鏡下選取5個視野觀察細胞凋亡情況,計算細胞凋亡率。細胞凋亡率(%)=陽性細胞數/細胞總數×100%。
1.3.7Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達量 不同濃度昆布多酚處理細胞48 h后,裂解細胞提取總蛋白和核蛋白,80 μg/30 μL每孔上樣,電泳后濕法轉膜,封閉4 h。按試劑盒說明書操作,加一抗(1∶1000)、二抗(1∶1000),內參為β-actin蛋白,計算相對表達量。
2.1經藥品制備后得到昆布多酚提取物3 280 mg,昆布多酚得率為4.1 mg/5 g。
2.2 昆布多酚對MCF-7細胞增殖抑制率的影響
與陰性對照組相比,昆布多酚提取物可顯著升高對MCF-7的增殖抑制率(P<0.05),且表現為時間劑量依賴性。結果見表1。
表1 昆布多酚對MCF-7細胞增殖抑制率的影響
2.3 昆布多酚對MCF-7侵襲能力的影響
昆布多酚提取物各組與陰性對照組相比,顯著降低Transwell小室上室底部細胞數(P<0.05),表現為劑量依賴性,結果見圖1A和1B。
圖1A 昆布多酚對MCF-7侵襲能力的影響(×100)
圖1B 昆布多酚對MCF-7侵襲能力的影響
2.4 昆布多酚對MCF-7遷移能力的影響
劃痕實驗結果顯示,昆布多酚各劑量組與陰性對照組相比,顯著降低MCF-7細胞遷移能力(P<0.05),表現為劑量依賴性,結果見圖2A和2B。
圖2A 昆布多酚對MCF-7遷移能力的影響(×100)
圖2B 昆布多酚對MCF-7遷移能力的影響
2.5 昆布多酚對MCF-7細胞凋亡的影響
與陰性對照組比較,昆布多酚顯著升高MCF-7的凋亡率(P<0.05),且呈現劑量依賴性。結果見圖3A和3B。
圖3A 昆布多酚對MCF-7細胞凋亡的影響 (×100)
圖3B 昆布多酚對MCF-7細胞凋亡的影響
2.6 昆布多酚對凋亡相關蛋白β-catenin表達量的影響
昆布多酚不同濃度組,總蛋白β-catenin表達都不受影響(P>0.05),而細胞核中β-catenin表達隨著劑量的增加逐漸減少(P<0.05)。結果見圖4。
圖4 昆布多酚處理MCF-7細胞后總蛋白、核蛋白β-catenin表達情況
復發轉移和腫瘤耐藥是威脅乳腺癌患者預后的主要原因,因此探索新藥物及機制對于治療乳腺癌有著重要意義。昆布是藥食同源的多年生海藻植物,歐盟在2017年批準腔昆布褐藻多酚(Ecklonia cava phlorotannins)為新資源食品,并允許其作為膳食補充劑[10],昆布屬于褐藻門藻類,其中含有昆布多糖、昆布多酚等多種成分,各組分抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用均有相關報道[2-7,11-12]。
本研究采用昆布多酚提取物處理人乳腺癌細胞株MCF-7,陽性對照藥采用療效確切的阿霉素,發現昆布多酚提取物能夠抑制MCF-7細胞增殖,降低腫瘤細胞侵襲和遷移能力,與現有研究結果一致[13-14]。本研究結果表明昆布多酚以濃度依賴的方式抑制 MCF-7人乳腺癌細胞株增殖能力,并促進 MCF-7細胞的凋亡。此外,昆布多酚提取物可降低MCF-7細胞核中β-catenin表達,β-catenin在癌細胞核中的累加表達,與腫瘤的轉移相關[15-16]。提示昆布多酚可能通過抑制經典的 Wnt 信號轉導對癌細胞發揮抑制作用。Aravindan等[17]研究提出海藻多酚通過干擾正常信號傳導,抑制腫瘤細胞增殖。Wnt/β-catenin信號通路參與維持胚胎發育和組織器官穩態[18]。但人體中缺乏Wnt配體時,β-catenin在胞漿中呈游離狀態存在,并被多種蛋白組成的降解復合物所招募,通過一系列的激酶串聯反應,從而促進降解,而當Wnt配體存在時,與細胞膜上相關蛋白結合,破壞降解復合物,無法有效降解β-catenin,其在胞漿中大量積累,移位至細胞核,啟動下游靶基因,促進細胞增殖和轉移。研究表明[19-20],乳腺癌中Wnt信號通路過度活化,通過靶向作用于Wnt信號通路,抑制乳腺癌的發生與進展[21-22]。本研究發現,昆布多酚通過調控Wnt/β-catenin經典通路抑制人乳腺癌細胞株MCF-7增殖、侵襲、遷移,促進細胞凋亡,并呈現劑量依賴性。提示昆布多酚可能對乳腺癌復發轉移有一定的抑制作用。