鄭州地區屠宰場牛羊肉中污染沙門菌的鑒定、毒力基因及耐藥性檢測

馬麗卿，張一鳴

(河南牧業經濟學院，河南 鄭州 450046)

沙門菌具有廣泛的宿主，可以引起多種動物和人的敗血癥、胃炎、流產等，是臨床中重要的人獸共患病原菌之一。該菌是畜產品污染中常見的食源性致病菌，可通過食物鏈傳染給人，對人和動物的危害較大。沙門菌廣泛分布于肉、蛋、奶、菜等食品中，肉類食品是沙門菌主要的傳播和暴發的載體。相關研究表明，屠宰場中屠宰的肉品、內臟及胴體是污染沙氏菌的重要來源之一，該菌可以通過運輸中的動物和未煮熟的動物食品進行傳播，該菌危及人類公共安全問題。近幾年來關于肉類在屠宰加工過程中沙門菌污染報道逐漸增多，因而屠宰加工過程檢測沙門菌具有很重要意義。沙門菌攜帶毒力島、鞭毛、菌毛、質粒和脂多糖等多種毒力基因，攜帶毒力基因在其致病過程中起著重要作用，且與致病性具有一定相關性?？咕幬锸桥R床中控制沙門菌感染有效的手段，由于抗生素的不合理使用導致多重耐藥性沙門菌菌株產生及食品殘留等問題，且對人們的健康存在潛在危害。

本試驗從鄭州地區屠宰場采集肉品樣品、胴體拭子、沖洗液等245份，采用《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》方法進行沙門菌鑒定分析其污染情況，檢測沙門菌的毒力基因分布情況及耐藥情況，為進一步流行病學調查與防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2019年1月-2020年6月，從鄭州地區屠宰場采集牛羊肉樣品89份、胴體拭子94、沖洗廢水62份，共計245 份。

1.1.2 主要試劑 四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)、緩沖蛋白胨水(BPW)、藥敏紙片，購自廣東環凱微生物科技有限公司；沙門菌顯色培養基，購自青島海博生物技術有限公司；沙門菌生化鑒定試紙條，購自北京天壇藥物生物技術開發公司；DL2000 Maker、2×Master Mix，購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 分離與培養 采用《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》的方法，將樣品處理后，接種于TTB增菌液中，220 r/min 37 ℃培養8 h，劃線接種于沙門菌顯色培養基，37 ℃培養12 h，挑取單菌落接種于普通營養肉湯中純化培養，革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 細菌生化鑒定 按說明書對疑似沙門菌菌株進行生化特性鑒定。

1.2.3 細菌PCR鑒定 參考文獻，根據GenBank中沙門菌的基因序列，設計鑒定引物invA：5'-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3'，5'-TCTCGCACCGTCAAAGGAACC-3'，引物片段大小為249 bp。采用細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，用鑒定引物invA進行PCR鑒定，將PCR產物送上海生工生物技術有限公司測序，測序結果與GenBank中登錄的參考株進行同源性比對。

1.2.4 毒力基因PCR檢測 參照文獻[10]，設計沙門菌14種基因，主要包括毒力質?；?、、、、)，毒力島基因(、、、、)，其他毒力基因(、、、)，引物由上海生工生物技術有限公司合成，以1.2.3制備的菌株基因組DNA為模板，用梯度PCR法進行毒力基因檢測。

1.2.5 藥敏試驗 參照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準K-B紙片法進行藥敏試驗，按照CLSI的標準判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進行結果判斷，分析耐藥性。

2 結果與分析

2.1 分離培養結果

疑似沙門菌的菌株在沙門菌顯色培養基上長出大小一致、邊緣整齊的紫色菌落，革蘭染色鏡可見無莢膜、兩端鈍圓的陰性短桿菌；分離菌株用沙門菌生化鑒定試紙條鑒定，經統計94株被鑒定為沙門菌。與《伯杰細菌鑒定手冊》報道的沙門菌培養特性、形態學生基本一致。

2.2 細菌PCR鑒定結果

對生化試驗初步鑒定為沙門菌的菌株用引物invA對進行PCR鑒定，結果顯示94株分離菌株均擴增出大約為251 bp的目的條帶，與預期相符(圖1)，分菌株的PCR產物測序結果與GenBank中登錄的沙門菌的參考株同源性為97.9%～98.9%，說明分離的94株菌株從分子生物學方面鑒定為沙門菌。

圖1 分離菌株的PCR鑒定結果

2.3 毒力基因檢測結果

用PCR法對分離的94株沙門菌分離株進行14種毒力基因檢測，結果顯示，分離的94株沙門菌分離株攜帶12種毒力基因，其中毒力基因、、、、、檢出率在45.7%～94.7%之間，毒力基因、、、、、檢出率在12.8%～43.6%之間，毒力基因、未檢出(表1)。

表1 毒力基因檢測結果

2.4 耐藥性分析結果

用K-B藥敏紙片法對分離的94株沙門菌株進行藥敏試驗，結果顯示，分離的94株沙門菌株對青霉素、阿莫西林、新霉素、慶大霉素、氟苯尼考、磺胺間甲氧嘧啶、強力霉素、多粘菌素、林可霉素、大觀霉素11種抗生素耐藥率在50%～97.9%之間，對頭孢曲松、頭孢噻呋、阿米卡星、恩諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星7種抗生素的耐藥率在14.9%～30.9%之間(表2)。

表2 藥敏試驗結果(陽性)

3 討 論

沙門菌是臨床中主要的食源性病原菌，該菌主要存在肉類食品中，尤其在屠宰加工過程中容易感染沙門菌，通過食物傳播，可導致人的急性食物中毒、腸炎、腹瀉等，嚴重可以導致死亡，該菌已經危害到公共衛生安全問題。近幾年來關于屠宰場及生產鏈中的沙門菌污染情況的報道越來越多。劉鮮鮮等報道從南寧市不同地區生豬屠宰場采集的300份樣品中分離的得到98株沙門菌。孫璐等報道山東雞肉屠宰環節中采集的樣品中分離得到239株沙門菌。劉英玉等報道在新疆地區定點屠宰場、農貿市場采集牛羊胴體拭子、肉樣、加工用具拭子樣品 841 份中分離得到47株沙門菌。本試驗研究表明，從鄭州地區屠宰場采集肉品樣品、胴體拭子、沖洗廢水等245 份中分離得到94株沙門菌。說明沙門菌在屠宰場中廣泛流行，應該引起重視，加強肉類衛生檢疫制度。

沙門菌編碼基因的中攜帶多種毒力島和毒力基因，且致病性的沙門菌攜帶多種基因及毒力島呈現正相關，該菌主要定居于宿主的腸道內，侵入宿主腸道的上皮組織細胞內引起腸道病變，與該菌攜帶的毒力質粒有關，沙門菌Ⅲ型分泌系統在其致病性起著關鍵作用。因此，沙門菌所攜帶的毒力基因在其致病過程起著重要作用。本試驗研究表明，分離的94株沙門菌分離株攜帶12種毒力基因，毒力基因、、、、、檢出率在45.7%～94.7%之間，其他毒力基因檢出率在12.8%～43.6%之間。說明分離的沙門菌攜帶多種毒力基因，分布比較廣泛，孫璐等、崔苗苗等報到的屠宰過程分離的沙門菌攜帶多種毒力基因一致。其作用機理有待進一步研究。

國內許多研究表明沙門菌產生很強的耐藥性，其耐藥性產生與其攜帶的耐藥基因有關，還與抗生素使用有關，沙門菌的耐藥性可以通過食物在動物與人之間傳播，給人們的健康帶來潛在的威脅。本試驗研究表明，分離的94株沙門菌株對青霉素、阿莫西林、新霉素等11種抗生素耐藥率在50%～97.9%之間，對其他抗生素的耐藥率在14.9%～30.9%之間。說明從鄭州地區屠宰場牛羊肉中污染沙門菌菌株耐藥性嚴重。與張強等、劉英玉等、金宣辰等報道的存在一定差異，可能與地區、屠宰的動物有關，還與屠宰過程中的檢疫有關。

4 結 論

本研究分離得到94株沙門菌，攜帶12種毒力基因；分離的94株沙門菌株對青霉素、阿莫西林、新霉素等11種抗生素耐藥率為50%～97.9%，對其他抗生素的耐藥率為14.9%～30.9%，說明鄭州地區屠宰場牛羊肉中沙門菌污染嚴重，攜帶多種毒力基因，且耐藥性嚴重。