生物除臭劑在生豬養殖場的應用及其急性毒性評價

張英濤，張宗源，馮印印，岳丹丹，安德榮，陳國參*

(1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南 鄭州 450000；2.西北農林科技大學 植物保護學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

據農業農村部統計，豬糞污年產量約18×10t，占畜禽糞污總量的47%。豬糞、豬尿和養殖污水對水、土壤和空氣質量均造成不利影響，其中以養殖場糞污產生的臭氣污染尤為突出，嚴重危害到飼養人員、周邊居民的日常生活及身心健康，同時也嚴重危害畜禽健康以及生產能力，臭氣治理已經成為生豬養殖業急需解決的關鍵問題之一。生豬養殖場臭源主要成分有氨氣(NH)、硫化氫(HS)等，這些物質易溶于水，當吸附到人和動物呼吸道黏膜，會導致呼吸道疾病和其它病癥。目前養殖場除臭方法主要包括化學法、物理法和生物法。由于生物除臭具有高效、環保、低成本、無毒性、無二次污染等優點，越來越多地用在養殖場除臭方面，應用前景廣闊。生物除臭法的有效手段是使用微生物除臭劑，微生物除臭劑的關鍵在于高效除臭微生物的篩選，由于微生物特異性等原因，效果各有差異，如邵栓等選用具有除臭功能的貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母和干酪乳桿菌4種微生物菌種復配去除NH和HS；成鋼等以新鮮蚯蚓糞為材料篩選出6株具有除NH和HS的微生物用來去除羊糞臭氣。俞潔雅等以土壤為材料，通過NH選擇性培養基篩到的煙曲霉菌。李玥等以雞糞堆肥為材料，分離到芽孢桿菌屬、貝萊斯芽孢桿菌、耐寒短桿菌、木糖葡萄球菌和變異棒桿菌。這些研究報道大多集中于高效除臭菌株的分離與篩選，實際應用于養殖場的不多，也少見相關生物除臭劑急性毒性評價試驗的報道，同時文獻中的微生物除臭劑在實驗室條件下，大多需要較長時間堆積發酵才能達到高效除臭效果。

本研究將已篩選出的有益菌制備的復合微生物除臭劑應用于豬養殖場，對其糞污進行短時間處理，以豬糞臭氣主要成分NH和HS釋放量為研究指標，來評價其對豬排泄物發酵釋放的惡臭氣味的去除能力，同時對該生物除臭劑進行小鼠和家兔急性毒性檢測等毒理學評價，為豬養殖場糞污臭氣的高效處理、環境保護及進一步應用推廣提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與糞樣 復合微生物菌液包括以下有益菌：羅倫隱球酵母(),10CFU/g;植物乳桿菌(),10CFU/g;枯草芽孢桿菌(),10CFU/g。以上菌株均由西北農林科技大學旱區作物逆境生物學國家重點實驗室提供。

試驗用新鮮豬糞采自陜西楊凌某養豬場飼養的健康豬群。

1.1.2 試驗動物 昆明種小鼠，購于成都達碩試驗動物有限公司；普通級新西蘭家兔，購于西安迪樂普生物醫學有限公司。

1.1.3 培養基和設備 普通肉湯培養基、乳酸細菌(MRS)培養基、綜合馬鈴薯培養基等，均購于北京奧博星生物技術有限責任公司。

主要設備有電子天平BS2202S、振蕩培養箱ZQZY-C8、可見分光光度計L025、DYM空盒氣壓表L031、KB-6E大氣采樣器L182等。

1.2 方法

1.2.1 生物除臭劑的制備 將微生物菌株分別于相應的培養基進行震蕩培養至對數生長期后期，取培養液按照一定的比例組合制備生物除臭劑，制備的復合微生物菌液中羅倫隱球酵母數≥2.0×10mL，植物乳桿菌數≥2.0×10mL，枯草芽孢桿菌數≥3.0×10mL。

1.2.2 豬排泄物中廢氣的檢測 豬排泄物中廢氣的檢測分為大氣環境試驗和密閉環境試驗，廢氣檢測的指標主要為NH、HS和臭氣濃度。其中去除率(%)=(對照組廢氣濃度-試驗組廢氣濃度)/對照組廢氣濃度×100%。

1.2.2.1 大氣環境試驗 處理1：將養豬場中的豬排泄物取500 kg置于2 m的池子中，然后使用200 L清水均勻噴灑和攪拌于豬排泄物中，靜置2 h后采用5點采樣法從表面0～5 cm處用大氣采樣器采樣。

處理2：將養豬場中的豬排泄物取500 kg置于2 m的池子中(長2 m×寬1 m×高1 m)，然后將復合微生物菌液取1 kg稀釋至200 L后均勻噴灑和攪拌于豬排泄物中，靜置2 h后采用5點采樣法從表面0～5 cm處用大氣采樣器采樣。

1.2.2.2 密閉環境試驗 密閉環境試驗示意圖見圖1。將100 g豬排泄物放入2.5 L塑料桶中，密閉靜置30 min后開始采集豬排泄廢棄物中NH、HS和臭氣濃度樣品，臭氣濃度為瞬時采樣，記錄除臭前各組分濃度；取2 g復合微生物菌液稀釋至1 L，每5 min對塑料桶內進行噴霧，直至復合微生物菌液稀釋液全部用完，同時取等量的無菌水作為對照組進行噴霧。噴霧完成后，靜置30 min后開始采集NH、HS和臭氣濃度樣品各1組，臭氣濃度為瞬時采樣，以上試驗均做3個重復。復合微生物菌液噴灑及采集樣品過程中盡量保持塑料桶密閉狀態，檢測項目及時間見表1。

圖1 密閉環境試驗示意圖

表1 豬排泄物中廢氣的檢測

1.2.3 復合微生物菌液小鼠急性毒性的檢測 選用昆明種小鼠20只，體重18～22 g，雌雄各半，試驗前將其禁食6 h，不禁水。試驗設1個劑量組，按原液(羅倫隱球酵母2.0×10mL，植物乳桿菌2.0×10mL，枯草芽孢桿菌3.0×10mL)進行灌胃，灌胃體積為40 mL/kg體重。參照《新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編》、《藥物安全藥理學研究技術指導原則》進行小鼠急性毒性試驗。按上述劑量一次性經口灌胃給予受試物，觀察14 d。記錄各組小鼠中毒表現及死亡情況。通過最大耐受量試驗結果確定復合微生物菌液對小鼠經口灌胃的LD值。

1.2.4 復合微生物菌液家兔急性毒性的檢測 選用檢疫合格的成年、健康、皮膚無損傷的家兔4只，試驗前一天將家兔背部脊柱兩側毛剪掉，去毛范圍左、右側各3 cm×3 cm，表皮光滑無損。試驗時取供試品1 mL均勻涂抹于左側剪毛區，然后用2層紗布(2.5 cm×2.5 cm)和一層玻璃紙覆蓋，再用無刺激性膠布和繃帶加以固定。采用封閉試驗，敷用時間為24 h，試驗結束后用溫水清除殘留受試物。右側剪毛區不做任何處理為對照。參照《新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編》、《藥物安全藥理學研究技術指導原則》有關規定進行皮膚刺激強度。皮膚刺激評分及強度分級參照表2，皮膚刺激反應評分標準見表3。

表2 皮膚刺激強度評價標準

表3 皮膚刺激反應評分標準

1.2.5 惡臭等級(氨、硫化氫)評價標準 氨評價標準為《工業企業設計衛生標準》(TJ36-1979)，標準限值為0.20 mg/m，硫化氫評價標準為《惡臭污染物排放標準》(GB14554-93)，標準限值為0.60 mg/m。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 豬排泄物臭氣的檢測結果

復合微生物菌液處理豬排泄物臭氣測定結果見表4和表5。從表4可以看出，在大氣環境下，加入復合微生物菌液的處理方法相比較于只加入清水的處理方法產生的惡臭氣體中NH、HS濃度都明顯下降(<0.05)，通過該生物除臭劑處理，NH去除率為76.13%，HS去除率為82.61%，臭氣濃度去除率83.25%。在密閉環境下(表5)，相比除臭前，添加復合微生物菌液對惡臭體中的NH、HS具有明顯去除效果(<0.05)，NH去除率為80.48%；HS去除率68.42%。臭氣濃度去除82.51%。與清水組也有顯著降低(<0.05)，表明復位微生物在除臭過程中起主要作用。試驗結果表明該生物除臭劑在自然環境與密閉環境下，均有明顯的除臭作用，能夠將NH和HS等有害氣體降低到標準限值以下。

表4 大氣環境下豬排泄物臭氣的檢測結果

表5 密閉環境下豬排泄物臭氣的檢測結果

2.2 復合微生物菌液小鼠急性毒性的檢測

給予受試物后，兩組共20只小鼠在給藥后14 d觀察期內未見其它異常情況，未出現死亡，結果見表6。參照最大耐受量試驗規定，得出復合微生物菌液對雄、雌性小鼠的急性經口毒性LD>40 g/kg體重，屬于實際無毒級物質。

表6 復合微生物菌液急性經口毒性試驗結果統計表

2.3 復合微生物菌液家兔急性毒性的檢測

試驗期內，家兔試驗區皮膚未見紅斑和水腫等刺激性反應，每只動物皮膚刺激反應積分均值0(表7)，按《新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編》、《藥物安全藥理學研究技術指導原則》皮膚刺激性試驗有關規定判定為無刺激性。

表7 復合微生物菌家兔急性皮膚刺激性試驗結果

3 討 論

臭氣中NH、HS嚴重危害畜禽正常生長和影響人類健康，這2種氣體常作為養殖場環境污染的主要檢測指標以及作為衡量除臭劑效果的重要指標。養殖場惡臭來源于動物糞尿、霉變墊料、飼料等，其中主要來源于動物排泄物中未被消化的各種有機物的微生物發酵分解，釋放多種揮發性硫化物、NH和揮發性胺類等。畜禽糞便中含有大量土著微生物，是惡臭產生的主要微生物種群。邵栓等報道，以貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母和干酪乳桿菌4種微生物菌種復配得到的微生物除臭劑效果最好，通過7 d的堆積發酵，NH和HS的去除率達到63.60%和70.29%。本研究利用酵母菌、乳酸桿菌以及芽孢桿菌3種有益菌制備的復合微生物除臭劑，NH和HS去除率達到76.1%和68.42%以上，取得了高效的除臭效果。該結果可能是因為添加的釀酒酵母、芽孢桿菌、乳酸菌等復合微生物與豬糞中土著微生物產生拮抗作用，產生了乳酸、乙酸等代謝物，形成酸性環境抑制產生惡臭微生物的生長，減少惡臭氣體的產生和釋放，或者益生菌自身代謝降解了惡臭物質。復合微生物的除臭機理比較復雜，有待進一步研究探討。目前大多數微生物除臭劑的研究僅限于實驗室階段，本試驗是在生豬養殖場大氣環境和密閉環境下進行，為該除臭劑的實際應用提供理論基礎。

生物除臭劑的優點還在于安全性高，無二次污染，但是作為微生物制劑，不應該忽視其對環境以及動物和人類帶來的潛在危害，必須對其安全性進行評價。本研究使用的復合微生物除臭劑均為自然環境中存在的有益菌，能有效治理養殖場的臭氣污染，對昆明種雄、雌性小鼠急性經口毒性LD>40 g/kg體重，且對皮膚無刺激，具有較好的使用安全性。

4 結 論

試驗以氨、硫化氫去除率作為衡量除臭劑效果的重要指標，同時經急性毒性評價試驗，結果表明本研究使用的復合微生物菌液具有較好的安全性及除臭能力，為豬養殖場糞污臭氣的高效處理、環境保護及進一步應用推廣提供依據。