干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY 基因的鑒定與分析

付家旭，閆亞麗，謝小文，張心悅，溫鵬飛，關小康，王同朝，衛 麗

（河南農業大學 農學院，河南 鄭州 450002）

玉米（Zea mays）是我國主要的糧食作物，也是重要的飼料和工業原料。近年來，隨著全球氣候變暖，干旱發生的頻率和強度逐年增加，對玉米生產造成嚴重影響[1]。尤其在播種-出苗階段，若遭遇干旱，會嚴重影響玉米出苗和生長。干旱脅迫條件下，水分虧缺會引起氣孔關閉，導致光合作用下降，造成減產，嚴重時甚至絕收[2]。

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質，通過與靶基因啟動子區的順式作用元件結合，激活或抑制基因的表達，在植物逆境脅迫中發揮著重要作用[3]。目前，已發現WRKY、bZIP（Basic leucine zipper）、NAC（NAM、ATAF1/ATAF2 和CUC2）、MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog ）和bHLH（Basic helix-loophelix）等轉錄因子家族與逆境脅迫密切相關[4-8]。WRKY 是植物中較龐大的一個轉錄因子家族，自ISHIGURO 等[9]從甘薯中克隆出第一個WRKY 基因SPF1（Sweet potato factor 1）后，在 擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）[10]、水稻（Oryza sativaL.）[11]、高粱（Sorghum bicolor）[12]、小 麥（Triticum aestivumL.）[13]、大麥（Hordeum vulgareL.）[14]、玉米[15]和陸地棉（Gossypium hirsutum）[16]等多個物種中鑒定到WRKY基因。WRKY 轉錄因子通過特異性結合靶基因啟動子的順式作用元件W-box[（T）TGAC（C/T）]而調控基因表達，在植物生長發育及逆境脅迫中具有重要作用[17]。過表達小麥TaWRKY2基因提高了干旱脅迫條件下轉基因小麥葉片中的游離脯氨酸、可溶性糖和葉綠素含量，進而提高了對干旱的耐受性[18]。干旱和鹽脅迫誘導大豆（Glycine max）GmWRKY12表達，過表達GmWRKY12基因提高了大豆葉片中脯氨酸含量，降低了丙二醛（MDA）含量，最終提高了抗旱性和耐鹽性[19]。過表達陸地棉GhWRKY33基因可以提高擬南芥對脫落酸（ABA）和干旱的耐受能力[20]。前期，河南農業大學農學院旱作節水課題組以豫882為試驗材料，在苗期進行干旱-復水處理轉錄組測序分析，從中得到11 002 個差異表達的基因，包括56 個轉錄因子家族，2 332 個轉錄因子[5，21-23]。在前期[23]研究基礎上，對干旱-復水處理下差異表達的玉米WRKY 基因進行鑒定，并對其蛋白質理化性質、系統進化、染色體分布和復制關系、基因結構和蛋白質保守基序、啟動子區順式作用元件及干旱-復水條件下的表達量等進行分析，為WRKY基因的進一步利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與干旱處理

供試玉米材料為豫882，選取籽粒飽滿、均勻的種子，滅菌后播種在土壤∶蛭石為3∶1 的混合土樣中，放置于光照培養箱中[溫度28 ℃/22 ℃，光照周期14 h/10 h，光照強度120 μmol/（m2·s），相對濕度60%]。待玉米生長至有3 片展開葉時，將其移栽到霍格蘭（Hoagland）營養液中，營養液每2 d 更換一次。處理組在營養液中加入20%聚乙二醇（PEG）6000 模擬干旱，分別處理60 h 和96 h，復水3 d，記為T60、T96、TR3d；不進行干旱處理的對照組（霍格蘭營養液）分別記為CK60、CK96、CK3d。取葉片立即放入液氮中速凍，然后放置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 玉米WRKY基因的鑒定

使 用Pfam 數 據 庫（http://pfam.xfam.org/）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線網站進一步分析玉米WRKY 基因相對應的蛋白質，去除冗余和重復的基因并刪除缺少完整結構域的蛋白質序列，并將其結構域與WRKY 結構域進行比對，保留含有WRKY 結構域的基因。采用RPKM 值計算基因在對照組與處理組之間的表達量差異倍數，以|log2（差異倍數）|≥1、錯誤率（FDR）＜0.05 為標準，篩選玉米干旱-復水處理中差異表達的WRKY 基因，并 參 考Ensembl Plants（http://plants. ensembl. org/index.html）和MaizeGDB（https://www.maizegdb.org/）數據庫進行命名。

1.3 玉米WRKY基因的生物信息學分析

1.3.1 蛋白質分子質量和等電點 利用在線網站ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）預測和分析玉米WRKY 基因編碼蛋白質的分子質量和等電點。

1.3.2 系統進化 從玉米數據庫MaizeGDB（https://www.maizegdb.org/）中下載51 個WRKY 蛋白序列，從TAIR數據庫（https://www.arabidopsis.org/）中下載擬南芥的WRKY蛋白序列，采用DNAMAN軟件對玉米和擬南芥WRKY 蛋白的氨基酸序列進行比對，篩選出同源序列。采用MEGA 7.0軟件NJ（Neighbor-joining）法構建系統進化樹，步長設置為1 000。

1.3.3 基因在染色體上的分布和復制關系 利用Ensembl Plants 下載玉米基因組注釋信息，使用TBtools分析基因在染色體上的分布和復制關系。

1.3.4 基因結構和蛋白質保守基序（Motif） 利用GSDS（https://gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線分析WRKY 基因外顯子-內含子結構。利用MEME Suite 5.4.1（https://meme-suite.org/meme/）在線預測玉米WRKY蛋白的保守基序，Motif 個數設置為10 個，基序長度為6～70 aa，其他參數均為默認值。

1.3.5 啟動子區順式作用元件 從數據庫Ensembl Plants（http://plants.ensembl.org/index.html）獲取WRKY基 因 上 游2 000 bp 序 列，用Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對WRKY基因啟動子區的順式作用元件進行分析。

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

根據Ensembl Plants 中檢索到的候選WRKY 基因的cDNA 序列，使用Primer Premier 5.0 進行qRTPCR 引物設計（表1）。利用Trizol 試劑提取葉片總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）反轉錄試劑盒合成cDNA，按照TB GreenPremix ExTaqTMⅡ（TaKaRa）試劑盒說明書進行qRT-PCR，采 用 玉 米18S RNA（GenBank No.AF168884.1）作為內參基因。qRT-PCR 反應體系為20 μL：cDNA 1 μL，TB Green Premix ExTaqTMⅡ10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。qRT-PCR 反應程序：95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃30 s，40 個循環。試驗進行3 次生物學重復，采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量[24]。

表1 玉米WRKY基因qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences for WRKY genes in maize

2 結果與分析

2.1 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因的鑒定及理化性質分析

本研究在前期研究結果[23]基礎上鑒定出51 個干旱-復水處理下差異表達的玉米WRKY 基因（表2），開放閱讀框（ORF）為690～2 248 bp；編碼的氨基酸數目最多為729 個，最少為99 個；編碼蛋白質分子質量為11.22～78.73 ku。編碼蛋白質等電點最小為4.58，最大為12.26，平均為7.6。其中，有20個小于7，占總數的39.22%；有31 個大于7，占總數的60.78%，說明這51 個差異表達的玉米WRKY基因編碼的蛋白質偏向于堿性。

表2 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因基本信息Tab.2 The basic information of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

續表2 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因基本信息Tab.2（Continued） The basic information of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

2.2 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因系統進化分析

本研究篩選出31個干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY 基因的擬南芥同源基因，構建玉米、擬南芥WRKY 蛋白系統進化樹（圖1）。82 個WRKY蛋白可劃分為3 組，其中，Ⅰ組含有9 個玉米WRKY蛋白，占玉米總數的17.65%；Ⅱ組有28 個玉米WRKY 蛋白，占玉米總數的54.90%，占比最高，說明Ⅱ組可能在玉米進化中占主體地位；Ⅲ組有14個玉米WRKY蛋白，占玉米總數的27.45%。Ⅱ組又可分為5 個亞組（Ⅱa—Ⅱe），其中，Ⅱc 亞組中含有12 個玉米WRKY蛋白，占玉米總數的27.45%。每個組都有擬南芥WRKY 蛋白，說明玉米和擬南芥的WRKY基因存在平行進化。

圖1 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY蛋白與擬南芥同源蛋白系統進化分析Fig.1 Phylogenetic evolution analysis between differentially expressed WRKY proteins in maize under drought-rewatering treatment and part of homologous WRKY proteins in Arabidopsis thaliana

2.3 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因染色體分布與復制關系分析

51個干旱-復水處理下差異表達的玉米WRKY基因不均勻地分布在10 條染色體上（圖2）。其中，第3 和第8 染色體上分布的WRKY 基因較多，分別有10、11個；分布最少的是第2和第10染色體，各分布2 個基因。 發生了2 對串聯復制事件（ZmWRKY26/ZmWRKY80、ZmWRKY27/ZmWRKY56），分別發生在第8 染色體、第3 染色體上。發生了16對片段復制事件（ZmWRKY102/ZmWRKY109、ZmWRKY73/ZmWRKY82、ZmWRKY106/ZmWRKY86、ZmWRKY87/ZmWRKY52、ZmWRKY43/ZmWRKY57、ZmWRKY27/ZmWRKY80、ZmWRKY74/ZmWRKY86、ZmWRKY48/ZmWRKY124、ZmWRKY25/ZmWRKY38、ZmWRKY29/ZmWRKY111、ZmWRKY43/ZmWRKY115、ZmWRKY56/ZmWRKY26、ZmWRKY103/ZmWRKY111、ZmWRKY82/ZmWRKY68、ZmWRKY57/ZmWRKY115、ZmWRKY74/ZmWRKY106）。其中，7 對片段復制事件（ZmWRKY27/ZmWRKY80、ZmWRKY74/ZmWRKY86、ZmWRKY29/ZmWRKY111、ZmWRKY43/ZmWRKY115、ZmWRKY56/ZmWRKY26、ZmWRKY103/ZmWRKY111、ZmWRKY74/ZmWRKY106））發生在第3 染色體和第8染色體上，表明第3染色體和第8染色體可能與玉米WRKY家族擴張密切相關。

圖2 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因染色體分布及復制關系Fig.2 Chromosome distribution and duplication of differentially expressed WRKY genes in maize under droughtrewatering treatment

2.4 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因結構和蛋白質保守基序分析

干旱-復水處理下51 個差異表達玉米WRKY基因結構如圖3 所示，玉米WRKY 基因的外顯子數是1～12 個，含有3 個外顯子的占62.74%。除ZmWRKY25基因外，其余WRKY 基因均含有內含子。大部分同一組或亞組的WRKY 基因具有相對保守的外顯子數，如Ⅱc 中除了ZmWRKY30和ZmWRKY108基因外，均含有3 個外顯子，Ⅱd 亦是如此。而Ⅰ中外顯子數量變化較大，介于2～8個，其中 有 3 個 基 因（ZmWRKY115、ZmWRKY43和ZmWRKY1）含有5 個外顯子，2 個基因（ZmWRKY83和ZmWRKY62）含 有3 個 外 顯 子，ZmWRKY92、ZmWRKY87、ZmWRKY57、ZmWRKY52分別含有2、4、6、8 個外顯子；Ⅲ中ZmWRKY25只含有1 個外顯子，ZmWRKY65含有12個外顯子。

圖3 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因結構和蛋白質保守基序分析Fig.3 Analysis of differentially expressed WRKY gene structure and encoded protein conserved motif in maize under drought-rewatering treatment

41個玉米WRKY 蛋白含有2～4個保守基序，占80.39%。同一組中的WRKY 成員具有相似的基序組成，例如，Ⅰ中都含有Motif1、Motif2、Motif4 和Motif9；Ⅱc 中 除ZmWRKY100（含 有Motif1 與Motif4）外 其 余 成 員 都 含 有Motif1、Motif2 和Motif4。

2.5 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因啟動子順式作用元件分析

為進一步預測玉米WRKY 基因的功能，對51個玉米WRKY 基因上游2 000 bp 啟動子區域進行順式作用元件分析。由圖4 可知，51 個玉米WRKY 基因啟動子區域含有ABA 響應元件（ABRE）、生長素響應元件（AuxRR-core、TGA-element）、水楊酸響應元件（TCA-element）、赤霉素響應元件（GAREmotif、P-box、TATC-box）、茉 莉 酸 甲 酯 響 應 元 件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、防衛和脅迫響應元件（TC-rich repeats）、低溫響應元件（LTR）、干旱響應元件（MBS）、缺氧誘導有關元件（GC-motif）等植物激素及非生物脅迫相關的順式作用元件。其中，AREB、LTR、MBS、TCA-element 和TGACG-motif 分布較多，而GARE-motif、P-box、TC-rich 和TATCbox 分 布 較 少。 除 了ZmWRKY1、ZmWRKY52、ZmWRKY96和ZmWRKY106外，其余基因均含有ABRE。 含 有 CGTCA-motif 較 多 的 基 因 有ZmWRKY15、ZmWRKY29、ZmWRKY40、ZmWRKY53、ZmWRKY92和ZmWRKY104；ZmWRKY28、ZmWRKY52、ZmWRKY108和ZmWRKY115等24個基因含有MBS；88.24%的ZmWRKY基因含有TGACGmotif，其 中ZmWRKY38、ZmWRKY43、ZmWRKY53、ZmWRKY92、ZmWRKY96和ZmWRKY99含 有4 個 及以上。以上結果說明玉米WRKY 基因在激素信號轉導和非生物脅迫響應中可能起著重要的作用。

圖4 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因啟動子區順式作用元件分析Fig.4 Analysis of cis-acting elements in the promoter region of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

2.6 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因的表達分析

依據轉錄組結果，在干旱-復水處理下，51個玉米WRKY基因呈現不同的表達模式（圖5）。在干旱處理60 h、96 h 和復水3 d 3 個處理時間點，上調表達的基因數分別為25、19、3 個，下調表達的基因數分 別 為26、32、48 個。ZmWRKY1、ZmWRKY10、ZmWRKY16、ZmWRKY28、ZmWRKY30、ZmWRKY33、ZmWRKY42、ZmWRKY65、ZmWRKY68、ZmWRKY78、ZmWRKY96、ZmWRKY99、ZmWRKY100、ZmWRKY102和ZmWRKY111在干旱處理下，其表達量高于對照組，在復水處理后，其表達量低于對照組，說明這15個基因正向響應干旱脅迫。ZmWRKY87基因在干旱處理下下調表達，復水處理后，表達量高于對照組，是負向響應干旱脅迫基因。其他基因的表達模式無規律，如ZmWRKY15、ZmWRKY52、ZmWRKY103等。

圖5 干旱-復水處理下差異表達玉米WRKY基因的表達分析Fig.5 Expression analysis of differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

為驗證轉錄組數據的可靠性，隨機挑選了8 個WRKY 基因（ZmWRKY1、ZmWRKY16、ZmWRKY30、ZmWRKY34、ZmWRKY48、ZmWRKY68、ZmWRKY82、ZmWRKY102）進行qRT-PCR 分析。由圖6 可知，ZmWRKY1、ZmWRKY16、ZmWRKY30、ZmWRKY68、ZmWRKY102在干旱處理60 h 和96 h 條件下表達量上升，復水3 d 后表達量下降，正向響應干旱脅迫。其中，ZmWRKY1、ZmWRKY30、ZmWRKY68在3 個處理時間點下均達到顯著差異水平。ZmWRKY1、ZmWRKY16、ZmWRKY30、ZmWRKY34、ZmWRKY48、ZmWRKY68、ZmWRKY82、ZmWRKY102這8 個基因在3 個處理時間點的qRT-PCR 結果和轉錄組結果趨勢基本一致，進一步驗證了轉錄組結果的準確性。

圖6 干旱-復水處理下部分差異表達玉米WRKY基因的表達驗證Fig.6 Expression validation of partial differentially expressed WRKY genes in maize under drought-rewatering treatment

3 結論與討論

玉米是高需水、需肥作物，而我國玉米主產區大多都存在水資源不足問題，尤其是近年來全球氣候變暖，干旱導致玉米產量降低的問題日益突出。玉米生長發育進程中，經常處于干旱-濕潤-干旱的動態環境中，尤其是河南省夏季，雨量分配不均。夏玉米播種期或苗期，經常遭遇干旱，而生育中期或后期，降雨量偏多。適宜播期遇旱導致出苗較差，缺苗斷壟，苗期干旱導致發育受阻。因此，發掘抗旱基因，培育抗旱品種，提高玉米自身的抗旱能力對玉米生產的發展尤為重要。本研究在轉錄組結果分析的基礎上，鑒定篩選出響應干旱-復水處理的51 個差異表達的WRKY 基因。通過生物信息學分析發現，51 個WRKY 基因不均勻地分布在10條染色體上，部分基因存在片段復制關系，暗示著這些基因在玉米WRKY 基因家族進化中發揮重要作用[25]。進化樹分析結果顯示，51 個WRKY 基因分成了3 個組，與小麥、擬南芥[26]分類結果一致，進一步說明WRKY 轉錄因子家族具有平行進化關系。51 個玉米WRKY 基因的啟動子區域含有多個與植物激素和逆境脅迫相關的順式作用元件，如ABRE、TGACG-motif、TGA-element、LTR、MBS 等，進而更加證明WRKY 轉錄因子在植物逆境脅迫響應中起重要的調控作用。

逆境脅迫下，植物自身通過激活或抑制基因的表達來適應環境條件的變化，進而達到一種平衡。HU 等[27]研究發現，在超表達陸地棉GhWRKY1-like基因的擬南芥植株中，GhWRKY1-like 與ABA 生物合 成 所 必 需 的AtNCED2、AtNCED5、AtNCED6和AtNCED9基因啟動子的W-box 順式作用元件結合，促進這些靶基因的表達，從而提高植株的抗旱性。XIONG 等[3]研究發現，超表達文冠果XsWRKY20基因通過ABA 途徑提高煙草的抗旱性。本研究發現，在干旱-復水處理下，51 個玉米WRKY 基因呈現出不 同 的 表 達 模 式。ZmWRKY1、ZmWRKY10、ZmWRKY16、ZmWRKY28、ZmWRKY30、ZmWRKY33、ZmWRKY42、ZmWRKY65、ZmWRKY68、ZmWRKY78、ZmWRKY96、ZmWRKY99、ZmWRKY100、ZmWRKY102和ZmWRKY111這15 個正向響應干旱脅迫基因與1個負向響應干旱脅迫基因（ZmWRKY87）是今后深入研究ZmWRKY家族干旱脅迫響應的候選基因，可為玉米抗旱分子育種以及培育玉米新品種奠定基礎。