不同產地雪茄煙葉的風味特征和微生物群落分析

鄭天飛，張倩穎，李東亮，張 娟，堵國成

（1. 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2. 四川中煙工業有限責任公司技術中心，四川 成都 610000）

近年來，中國雪茄市場發展迅速，國內消費者對高端雪茄的需求旺盛[1-2]。然而，由于國內雪茄煙葉種植起步晚，原料基礎研究較為薄弱，雪茄煙葉發酵技術還不成熟[3-4]，導致國產雪茄煙葉原料與國外原料在品質上存在較大差異，高端雪茄煙葉原料主要依賴國外進口[5]。

國外優質雪茄煙葉產地分布廣泛，且具有不同的風格特色[6-7]。古巴的雪茄煙葉口感強勁、醇厚，帶有辛辣味和多種芳香；多米尼加的雪茄煙葉以其獨特的醇和煙味、輕盈的青草香氣和微酸味道深受全球消費者的推崇；洪都拉斯的雪茄煙葉以濃烈、辣味和芳香聞名于世[8]。雪茄由混合煙葉卷制而成，不同的煙葉原料配比會影響整支雪茄的香味風格。因此，系統評價雪茄煙葉的風味特征對雪茄煙葉原料利用、產品開發和應用創新具有重要意義。此外，微生物在雪茄煙葉發酵過程中起著至關重要的作用[9]，不同產地的雪茄煙葉可能具有不同的微生物群落，對雪茄煙葉中的微生物群落進行研究能夠為雪茄煙葉發酵指明方向[10]。近年來，基于細菌16S rRNA 基因及真菌rRNA 基因間隔區（Internal transcribed spacer，ITS）的高通量測序技術已廣泛應用于傳統發酵微生物群落分析[11]，如葉長文等[10]采用高通量測序技術對10 個雪茄煙樣品進行測序分析，發現雪茄煙樣品中的優勢菌門為厚壁菌門和子囊菌門，優勢菌屬為葡萄球菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬和曲霉屬。不同雪茄煙葉樣品中微生物群落多樣性和結構存在顯著差異。閆鐵軍等[12]通過高通量測序研究海南不同產區茄衣、茄套和茄芯的細菌群落組成，發現不同產區不同用途雪茄煙葉細菌群落多樣性豐富，結構組成相似，相對豐度有所差異，葡萄球菌科、腸桿菌科是造成煙葉細菌群落結構差異的關鍵菌科。這些結果表明，不同地區生產的雪茄煙葉細菌群落組成可能存在較大差異。目前，關于國內外雪茄煙葉的研究已有報道[6，10]，但關注較多的是不同產地雪茄煙葉微生物群落的組成和風味差異，而微生物群落與風味之間的聯系并未被探究。鑒于此，通過對國產高端雪茄常用的進口雪茄煙葉，即多米尼加、印尼和美國雪茄煙葉進行感官評吸和微生物高通量測序，分析不同產地雪茄煙葉的風味和微生物群落組成及差異，明確雪茄煙葉中的關鍵微生物，解析微生物群落與雪茄煙葉風味特征之間的聯系，為國產雪茄工業的原料利用、產品開發和應用創新奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為目前國內雪茄工業企業的進口雪茄煙葉，主要來自多米尼加（熱帶雨林氣候）、印尼（熱帶雨林氣候）、美國（亞熱帶氣候）3個國家，試驗樣品情況見表1，每份煙葉樣品采集200～1 000 g，總共24份煙葉樣品，均由四川中煙工業有限責任公司長城雪茄廠提供。

表1 供試雪茄煙葉信息Tab.1 Information of cigar tobacco leaves

1.2 試驗方法

1.2.1 感官評價 將發酵后的雪茄煙葉去梗，回潮至含水率為（15±0.5）%；將回潮后的煙葉手工卷制成長50 mm、直徑10 mm的單料煙樣品待用，并對卷制樣品進行基本信息標記；雪茄煙葉樣品經卷制后保存在溫度為18 ℃、濕度為（68±1）%的環境中平衡水分，評吸前將樣品放置于室溫環境中醒茄10 h 以上，供感官評吸使用。

感官評吸小組由四川中煙雪茄煙感官評吸專家組成，對試驗樣品的風味類型、風味強度、風味濃度進行鑒定和評分，按1—9分進行打分。評定項目主要包括雪茄煙葉的風味特征，如堅果香、豆香、木香、辛香、果香、清甜香、焦甜香、蜜甜香、正甜香、花香、熏香、藥香、奶香、膏香、樹脂香、窖香、烘烤香、壤香、干草、皮革香、酸香和脂粉香；雪茄煙葉的雜氣，如脂粉香、蛋白質氣息、土腥氣、青雜氣、枯焦氣、金屬氣、花粉氣、木質氣；香氣的醇香感，如醇和度、豐富度、成熟度；煙氣的醇和感，如飽滿度、流暢度、纏綿感；余味的醇凈感，如甜潤度、刺激性、干凈度、回味感；雪茄煙葉的燃燒特性，如燃燒性、灰色、凝灰度；可感燃吸指標，如平衡感。

1.2.2 微生物群落分析 將5 g 雪茄煙葉樣品與100 mL 無菌生理鹽水（0.85% NaCl）加至250 mL 燒瓶中，在轉速為220 r/min 的搖床中4 ℃振蕩洗脫3 h，過濾煙葉碎片，7 000 ×g離心15 min 收集微生物。根據DNeasy PowerSoil 試劑盒（QIAGEN，Inc.，Venlo，Netherlands）說明書對煙葉中微生物總DNA進行抽提，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度。各樣品3 個生物學重復，提取的DNA 樣品均保存于-20 ℃以備進一步分析。

以提取的DNA 為模板，使用正向引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和反向引物907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）對細菌和古細菌16S rRNA V4-V5 區域的基因進行擴增，使 用 通 用 引 物 ITS1F （5′-CTTGGTTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）擴增真菌內部轉錄間隔基因。PCR 反應體系（25 μL）：5 μL Q5 反應緩沖液（5×），5 μL Q5 High-Fidelity GC 緩沖液（5×），0.25 μL Q5 High-Fidelity DNA Polymerase（5 U/μL，NEB），2 μL（2.5 mmol/L）dNTPs，1 μL 正向引 物（10 μmol/L），1 μL 反 向 引 物（10 μmol/L），2 μL DNA 模板和8.75 μL無核酸酶水。PCR反應條件：98 ℃預變性2 min，28 個循環（98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最終72 ℃延伸5 min。 使 用 Agencourt AMPure Beads（ 美 國Beckman Coulter 公司）純化擴增的PCR 產物，使用PicoGreen dsDNA Assay Kit（美國Invitrogen 公司）進行定量，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應比例進行混合。采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit（美國Illumina 公司）制備測序文庫。使用MiSeq 測序儀和MiSeq Reagent Kit V3（600 cycles）進行2×300 bp的雙端測序。

使用QIIME 2對原始序列進行處理。先對原始序列（Reads）進行低質量部分剪切，再根據Barcode從得到的Reads 中拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列初步質控得到原始數據（Raw reads）。經過以上處理后得到的Reads 序列通過UCHIME Algorithm 與物種注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列，并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據。對有效數據在99%水平上聚集成擴增子序列變體（ASV），使用q2-feature-classifier QIIME 2 插件執行分類學分類。

1.3 數據處理與統計分析

采用Excel 2019 對試驗數據進行整理，采用SPSS 22.0、Origin 8.0分別對試驗數據進行差異顯著性分析、圖表制作，使用Galaxy（https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）進行LEfSe 分析，評估不同產地雪茄煙葉的差異顯著性。并通過Spearman 相關系數（P＜0.05，|r|＞0.3）建立代表性微生物和雪茄煙葉風味特征之間的相關性，使用Gephi 軟件進行網絡可視化。

2 結果與分析

2.1 不同產地雪茄煙葉的風味特征分析

雪茄煙葉樣品的風味、雜氣和整體質量得分如圖1 所示。風味中堅果香、木香、焦甜香和烘烤香，得分最高（4 分），其他香味大多得分在2～3 分；雜氣方面，蛋白質氣息、青雜氣和枯焦氣問題較為顯著，得分最高為3分；煙葉整體質量方面，醇和度得分最高，其他大多得分在4～7分，不同煙葉間差異較小。

圖1 不同產地雪茄煙葉樣品評吸得分Fig.1 Evaluation score of cigar tobacco leaves from different producing areas

對雪茄煙葉感官評吸數據進行主成分分析，結果如圖2 所示。印尼雪茄煙葉樣品YBQ、YCQ 和YM1Q 因具有較高的蛋白質氣息、青雜氣和枯焦氣而聚類在一起，煙葉樣品YBH、YCH 和YM1H 具有較高的蜜甜香和酸香。多米尼加的雪茄煙葉樣品香氣最為豐富，具有堅果香、豆香、木香、焦甜香、烘烤香、焦甜香和甘草香等風味，且煙葉整體質量較好。美國雪茄煙葉樣品風味和雜氣均不突出。印尼雪茄煙葉樣品的風味與多米尼加雪茄煙葉樣品有一定的差異，而且有些煙葉樣品具有較為嚴重的雜氣。

圖2 不同產地雪茄煙葉樣品評吸得分的主成分分析Fig.2 PCA plot marked by sensory analysis score of cigar tobacco leaves from different producing areas

2.2 不同產地雪茄煙葉的微生物群落分析

2.2.1 微生物群落組成 對24 個雪茄煙樣品中的微生物進行Illumina MiSeq 高通量測序，分別得到2 504 129條和3 701 781條高質量的16S rRNA 序列和ITS 序列，平均每個樣品分別高達34 779 條和51 413 條。對這些序列進行分類鑒定，如圖3 所示，細菌中優勢的門為Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria（圖3A），優勢的屬為Staphylococcus、Pseudomonas和Sphingomonas（圖3B）。真菌中優勢的門為Ascomycota 和Basidiomycota（圖3C），優勢的屬為Aspergillus、Sampaiozyma和Alternaria（圖3D）。不同產地雪茄煙葉中微生物相對豐度具有顯著差異。其中，差異最顯著的是細菌中的優勢門Proteobacteria 和Firmicutes，在多米尼加雪茄煙葉樣品中相對豐度分別為13.87%和67.74%，在美國雪茄煙葉樣品中相對豐度分別為35.92%和50.22%，在印尼雪茄煙葉樣品中相對豐度分別為78.54%和6.80%；差異最顯著的屬是Staphylococcus和Pseudomonas，在多米尼加雪茄煙葉樣品中相對豐度分別為55.61%和2.41%，在美國雪茄煙葉樣品中相對豐度分別為35.90%和6.61%，在印尼雪茄煙葉樣品中相對豐度分別為1.88%和26.52%。不同地區雪茄煙葉樣品中真菌群落的差異小于細菌。

圖3 不同產地雪茄煙葉樣品中主要細菌門（A）和屬（B）以及主要真菌門（C）和屬（D）的相對豐度Fig.3 Relative abundance of predominant bacterial phyla（A）and genera（B），predominant fungal phyla（C）and genera（D）in cigar tobacco leaves from different producing areas

2.2.2 微生物群落多樣性 采用基于Chao1指數的α-多樣性衡量不同產地雪茄煙葉樣品中微生物群落的豐富度，采用基于bray_curtis 距離矩陣的β-多樣性衡量不同產地雪茄煙葉樣品中微生物群落物種組成的差異性。不同產地雪茄煙葉中微生物群落多樣性分析如圖4 所示。由圖4 可知，不同產地雪茄煙葉中微生物群落α-多樣性具有顯著差異，美國和印尼的雪茄煙葉中細菌群落的豐富度顯著高于多米尼加，而多米尼加的雪茄煙葉中真菌群落的豐富度顯著高于美國。不同產地雪茄煙葉樣品中微生物群落的物種組成也有一定差異，細菌群落因地域原因在橫坐標上造成36.9%的差異，真菌群落因地域原因在橫坐標上造成20.4%的差異，真菌因地域造成的差異小于細菌。

圖4 不同產地雪茄煙葉樣品中微生物群落的多樣性Fig.4 Diversity of microbial communities in cigar tobacco leaves from different producing areas

通過韋恩圖統計不同產地雪茄煙葉微生物群落中的相同物種數目，如圖5 所示，3 個產地共有細菌有280 種，共有真菌僅有84 種。其中，多米尼加與印尼有較多相似的細菌和真菌物種。

圖5 不同產地雪茄煙葉樣品中獨特和共有的細菌（a）和真菌（b）微生物群數量Fig.5 Numbers of unique and shared bacterial（a）and fungal（b）microbiota in cigar tobacco leaves from different producing areas

通過LEfSe 分析不同產地雪茄煙葉微生物群落中門水平以下的特異性物種，如圖6所示，細菌中的差異物種包括6 個門，10 個綱，21 個目，29 個科，34個屬；真菌中的差異物種包括6 個門，12 個綱，19 個目，26 個科，37 個屬。印尼的雪茄煙葉有較多特異性細菌，多米尼加的雪茄煙葉有較多特異性真菌。

圖6 不同產地雪茄煙葉樣品中具有顯著差異的細菌（a）和真菌（b）進化分支圖Fig.6 Evolutionary branch map of bacteria（a）and fungi（b）with significant difference in cigar tobacco leaves from different producing areas

為了更好地區分不同產地的雪茄煙葉，進一步分析煙草微生物群成員是否可以如其他性狀（如風味、葉色和基因組特征）一樣用于區分雪茄煙葉的產地。通過隨機森林模型在屬水平上篩選一些微生物來區分不同產地的雪茄煙葉，結果如圖7所示，20 個細菌屬如Methylobacterium、Yaniella、Bacillus、Faecalibacterium、Tetragenococcus等和20 個真菌屬如Wallemia、Pichia、Thermoascus、Penicillium、Fusarium、Alternaria等在區分不同產地雪茄煙葉方面具有顯著的重要性。

圖7 用于區分不同產地雪茄煙葉的重要性排名前20的細菌屬（a）和真菌屬（b）Fig.7 Top 20 genera of bacterial（a）and fungal（b）communities used for discriminating tobacco leaves from different regions

2.3 雪茄煙葉風味特征與微生物群落之間的關系

用Spearman 相關系數分析風味特征和微生物（相對豐度排名前30的細菌和真菌）之間的聯系，并用Gephi 可視化。如圖8 所示，雪茄煙葉的風味與細菌群落具有密切的相關性，如堅果香、豆香、木香、辛香、果香、焦甜香、花香、熏香、膏香、烘烤香、干草香和皮革香與Staphylococcus、Corynebacterium_1、Tetragenococcus和Atopostipes具有顯著的正相關性，清甜香和蜜甜香與Pseudomonas、Ralstonia、Pantoea、Brevibacterium、Methylobacterium、Bacillus、Stenotrophomonas和Ochrobactrum具有顯著的正相關性。雪茄煙葉的風味特征與真菌群落的關聯較與細菌的關聯少，但堅果香、豆香、辛香、果香、焦甜香、花香、熏香、膏香、窖香、干草香和皮革香也與許多真菌呈正相關。煙葉中的雜氣，如蛋白質氣息、青雜氣和枯焦氣與Sphingomonas具有正相關，與Atopostipes具有負相關。

圖8 雪茄煙葉微生物群落與風味特征的相關性Fig.8 The correlation between flavor characteristics and microbial community of cigar tobacco leaves

3 結論與討論

本研究對多米尼加、美國和印尼3 個產區的雪茄煙葉進行感官評吸，并通過高通量測序技術分析其表面微生物，以揭示不同產地雪茄煙葉的風味、品質、表面菌群特征差異以及微生物群落與風味特征之間的聯系。

感官評吸結果表明，多米尼加的雪茄煙葉香氣最為豐富，雜氣較少，且煙葉整體質量較好。美國和印尼的雪茄煙葉香氣較少，且有些雜氣，這與李秀妮等[6]對全球主要雪茄產地雪茄煙葉風味特征的初探結果一致。微生物群落分析發現，本研究中雪茄煙葉的優勢菌門如Firmicutes、Proteobacteria 和Actinobacteria，也在其他煙草微生物群落研究中出現，它們在煙草發酵過程中充當分解者，將大分子（纖維素、果膠和淀粉）降解為小分子（葡萄糖、果糖和 麥 芽 糖）[13]；優 勢 菌 屬 如Staphylococcus、Pseudomonas和Sphingomonas在其他研究中也有報道。葡萄球菌（Staphylococcus）參與脂肪代謝，產生的脂肪酸會進一步降解形成醛和酮類等芳香類物質[14]。 之前的研究發現，鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）也是雪茄煙葉中醛和酮的主要產生者[15]。假單胞菌（Pseudomonas）可以降解煙堿，影響雪茄煙葉吸食勁頭[16]。以往對雪茄煙葉中真菌群落的研究較少，本研究中，雪茄煙葉真菌優勢屬有Aspergillus、Sampaiozyma和Alternaria，其在推動養分循環、調節植物礦質營養和緩解煙葉養分限制方面也發揮著重要的生態作用[17]。

此外，本結果表明，不同產地雪茄煙葉細菌群落具有較大差異，不僅一些優勢細菌的相對豐度差異較大，而且整體群落結構也有很大差異。雪茄煙葉上的微生物群落主要來自田間生長時的土壤和周圍環境，以及干燥時的空氣。環境中微生物群落也影響煙葉上的微生物群落[18]?？臻g是造成不同產地煙葉細菌群落差異的一個重要因素[19]。另外，煙葉原材料、發酵工藝和發酵過程參數調控也會極大地影響雪茄煙葉中的細菌群落[20-22]。然而，與細菌群落相比，真菌群落中沒有發現相同的趨勢，不同地區雪茄煙葉中真菌群落差異較小，故認為雪茄煙葉中的真菌群落不呈區域性變化。

不同產地的雪茄煙葉也有一些共同成員，盡管數量相對較少。這些共有成員可能與大分子物質的降解有關，但它們也可能是有害物質的生產者，因為有害物質（如亞硝胺和焦油等）基本上存在于所有煙草產品中。相反，不同產地的特異性微生物群落可能是不同產地雪茄煙葉特殊香氣的創造者。此外，本研究發現一些微生物類群可以用來區分不同產地的雪茄煙葉。通過關聯網絡分析發現，與真菌群落相比，細菌群落與雪茄煙葉風味特征之間的聯系更加密切，Staphylococcus、Corynebacterium_1、Tetragenococcus和Atopostipes等對雪茄煙葉的風味形成具有重要的貢獻。

本研究通過對不同產地雪茄煙葉的風味和微生物群落進行研究，揭示了雪茄煙葉中微生物群落與煙葉品質之間的聯系。結果表明，多米尼加的雪茄煙葉風味特征最為突出，香氣最為豐富；雪茄煙葉中優勢細菌屬為Staphylococcus、Pseudomonas和Sphingomonas，優 勢 真 菌 屬 為Aspergillus、Sampaiozyma和Alternaria；不同產地雪茄煙葉中細菌群落相較于真菌群落具有更大的差異，且細菌群落與風味特征之間的聯系更加密切，對雪茄煙葉的風味形成具有重要的貢獻。這些結果將會促進我國雪茄煙葉原料利用、產品開發和應用創新，為從優質進口雪茄煙葉中篩選功能菌株用于國產雪茄煙葉發酵，改善雪茄煙葉的風味和質量，減少有害物質奠定基礎。