硝化抑制劑類型和劑量對不同類型土壤硝化抑制作用機理的研究

劉發波，郎 明，馬 笑，程泰鴻，張 芬，郭廣正，陳新平，3，王孝忠，3*

（1. 西南大學資源環境學院，重慶 400716；2．西南大學農業科學研究院，重慶 400716；3．西南大學長江經濟帶農業綠色發展中心，重慶 400716）

氮素是保證作物正常生長發育必需的營養元素之一，也是對作物產量和品質形成起重要作用的元素［1］。2010年以來，我國氮肥生產量年均4396萬t，農用氮肥施用量年均2320萬t，單位面積施用量遠高于美國和歐盟水平，但氮素利用效率低于世界平均水平［2］。過量施用氮肥會造成其通過硝化-反硝化等途徑損失進入環境，導致N2O排放、NO3--N淋溶損失、氨揮發、土壤酸化等一系列環境生態問題，加劇了環境污染的風險并威脅人體健康［3-5］。因此，如何減少氮肥的施用，降低環境代價風險，同時促進農作物穩產增收已經成為我國集約化農業綠色生產亟待解決的難題。

硝化抑制劑（NIs）是一類能夠延緩土壤中銨態氮向硝態氮轉化的化合物，延長銨態氮在土壤中存留的時間，增加土壤對銨態氮生物吸收和吸附［6-7］，因而被認為是提高氮肥利用率和減少活性氮損失的有效調控手段。盡管硝化抑制劑種類很多，但在目前的農業系統中，雙氰胺（DCD）、3，4-二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP）和2-氯-6-（三氯甲基）吡啶（NP）是廣泛使用的商業化硝化抑制劑［8］?？茖W家通過Meta分析表明，NIs可以提高氮肥利用率（NUE）4%～18%，減少37%～48%的氮淋洗損失以及38%～57%的N2O和NO排放［9-12］。硝化抑制劑受硝化抑制劑類型及用量、自身的理化特性、土壤與環境條件、田間管理等因素影響，不同土壤類型施用效果變異較大［13-14］。因此，要取得理想的硝化抑制效果需要適宜的硝化抑制劑類型和劑量。然而，目前的研究主要集中于針對一種土壤類型比較不同硝化抑制劑類型、不同劑量的硝化抑制效果或者針對不同土壤類型比較同種硝化抑制劑不同劑量的硝化抑制效果［15-18］。對從類型和劑量上把目前幾種主要硝化抑制劑對不同類型土壤的硝化作用機理進行系統比較的研究還尚不多見。

紅壤、水稻土是我國南方地區主要的土壤類型，約占全國耕地面積的2/5［19-20］，潮土是我國華北地區主要的土壤類型之一，潮土區是我國冬小麥-夏玉米作物的主要產區［21］。本研究選取了全國典型酸性土（廣西紅壤、安徽水稻土）、堿性土（河北潮土）開展為期28 d的靜態土壤培養試驗，通過比較DCD、DMPP和NP 3種硝化抑制劑及不同劑量對不同類型土壤（紅壤、水稻土、潮土）硝化作用的影響，為不同土壤類型硝化抑制劑的合理應用和氮素優化管理提供理論基礎和科學依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試肥料：硫酸銨（ASN），分析純，含量99.0%，白色晶體。

供試硝化抑制劑：雙氰胺（DCD）、3，4-二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP）、2-氯-6-（三氯甲基）吡啶（NP）。

供試土壤：廣西紅壤、安徽水稻土和河北潮土，以上3種類型土壤均取自農田耕作表層土壤（0～30 cm）。試驗所用新鮮土樣剔除雜物及殘留根系，經自然風干后過2 mm篩備用，土壤基本理化性質見表1。

表1 供試土壤基本理化性質

1.2 研究方法

試驗于2019年10～11月在國家紫色土肥力與肥料效益監測站進行，采用室內土壤培養方法，供試氮源為硫酸銨［（NH4）2SO4，補充含氮量］，用量為N 200 mg·kg-1，每種土壤類型設置以下處理：對照（CK），不施氮（硫酸銨）；單施（NH4）2SO4處理（ASN）；ASN+DCD處理，設置4個DCD用量水平，分別為施氮量的2.5%、5%、10%和 15%；ASN+NP處理，設置4個NP用量水平，分別為施氮量的0.25%、0.5%、1%、3%；ASN+DMPP處理，設置4個DMPP用量水平，分別為施氮量的0.5%、1%、2.5%、5%，其中添加硝化抑制劑處理施氮量與單施硫酸銨處理施氮量相同，每個處理4次重復。培養開始前將風干后過2 mm篩的土壤調節水分至40%田間持水量，而后用黑色塑料布遮蓋以防止土壤水分散失，置于恒溫培養箱中25 ℃、無光條件下預培養兩周，使土壤活化。預培養結束后測定土壤含水量，根據土壤水分狀況添加去離子水溶解硫酸銨和硝化抑制劑，均勻噴灑于土壤表面并充分混勻，裝入100 mL白色塑料瓶（口徑5 cm）中，每瓶裝50 g，每個處理裝28瓶。置于25℃的恒溫培養箱培養，培養周期28 d。培養期間，每個處理都用parafilm保水透氣膜包好，用針扎數個小孔以創造好氣環境，相對含水量均勻保持在田間持水量的65%，風干土含水量3%計。采樣7次，分別在培養后的第0、2、4、7、14、21和28 d破 壞 性 取 樣。培養期間每周采用稱重法補水2次，使土壤含水量保持在田間持水量的65%，并使補水后土壤充分混勻。

1.3 測定方法及數據分析

土壤pH值采用電位法測定（土水比1∶2.5）；土壤含水量測定采用烘干法測定；土壤有機質采用重鉻酸鉀氧化-容量法測定；土壤全氮采用凱氏定氮法測定；土壤中銨態氮、硝態氮采用0.01 mol·L-1CaCl2溶液浸提在 180 r·min-1振蕩器中振蕩1 h，浸提液使用 3-AA3 型（Auto-Analyzer III，Bran + Luebbe，Norderstedt，Germany）連續流動分析儀測定土壤銨態氮和硝態氮含量。

土壤表觀硝化率根據下式計算：土壤表觀硝化率（%）=硝態氮含量/（硝態氮含量+銨態氮含量）×100。

對試驗結果采用雙因素方差分析，分析土壤類型和硝化抑制劑類型對表觀硝化率、無機氮含量、銨硝比的交互作用和主要影響；采用主成分分析（PCA）確定硝化抑制劑對土壤硝化作用抑制效果的主導因素；所有數據均采用Excel 2010、SPSS 18.0 、Origin 2018進行統計分析，采用 Duncan 最小顯著極差法進行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同類型和用量的抑制劑對不同土壤pH值的影響

由圖1可知，隨著培養時間的延長，ASN處理的水稻土和潮土土壤pH值明顯下降，培養前后土壤pH值分別下降了1.30和0.16個單位。3種硝化抑制劑均能夠延緩水稻土和潮土土壤pH值的下降，且隨著硝化抑制劑濃度的增加，延緩土壤pH值下降的效果越好，至培養結束時，各劑量DCD、NP、DMPP處理水稻土的土壤pH值分別比ASN處理高0.29～0.81、0.37～0.65、0.39～0.44個單位。3種硝化抑制劑在潮土中延緩酸化的作用總體表現為：DCD＞NP＞DMPP。與ASN處理相比，3種硝化抑制劑對于紅壤pH值影響差異均不顯著。

2.2 不同抑制劑對不同土壤無機氮轉化的影響

由圖2可知，隨著培養時間的延長，添加ASN處理的水稻土和潮土硝態氮含量顯著增加（P＜0.05），紅壤硝態氮含量培養前后無顯著差異（P＞0.05）。至培養的第14 d，潮土的硝態氮含量達到峰值，而后不再增加，水稻土至培養結束時硝化作用仍在進行，表明潮土的硝化作用強于水稻土。在水稻土和潮土上，添加硝化抑制劑的處理培養期間硝態氮含量均不同程度低于ASN處理；此外，隨著DCD和NP劑量的增加，硝態氮含量明顯降低，而DMPP處理無明顯的劑量效應。然而，在紅壤中3種硝化抑制劑處理培養前后硝態氮含量無顯著差異，各劑量處理之間也無顯著差異。DCD、NP、DMPP各劑量處理的水稻土在第21 d時硝態氮的平均含量分別為56.1、46.4、69.6 mg·kg-1，較ASN處理分別降低了42.8%、52.7%、29.1%，在潮土中的平均含量分別為207.3、224.8、231.8 mg·kg-1，較ASN處理分別降低了40.5%、35.5%、33.5%。

由圖3可知，添加ASN處理的水稻土和潮土銨態氮含量迅速增加，而后隨著培養時間的延長，水稻土中的銨態氮逐漸下降，培養結束時仍保持較高水平；而潮土中的銨態氮第4 d迅速下降到1.2 mg·kg-1，第14 d時則完全轉化為其他氮形態，紅壤則隨著時間的延長顯著增加，且不同劑量之間無明顯差異。各劑量硝化抑制劑處理的水稻土和潮土銨態氮含量均不同程度高于ASN處理，而各劑量硝化抑制劑處理紅壤與ASN處理無顯著差異（P＞0.05）。同一時間點，添加DCD和NP處理的水稻土和潮土銨態氮含量隨著硝化抑制劑劑量的增大而增加，而DMPP不同劑量處理間水稻土和潮土銨態氮含量差異不顯著（P＞0.05）。相較于ASN處理，在第14 d時，各劑量DCD、NP、DMPP處理的水稻土銨態氮平均含量分別增加了17.6、3.9、8.4 mg·kg-1，潮土的銨態氮平均含量分別增加了40.3、37.5、43.2 mg·kg-1；至培養的第28 d時，DCD、NP、DMPP各劑量處理的水稻土銨態氮平均含量較第14 d分別為67.3、72.9、57.4 mg·kg-1，潮土的銨態氮平均含量分別為29.14、12.2、2.67 mg·kg-1。

圖3 不同硝化抑制劑類型和劑量條件下紅壤、水稻土、潮土中銨態氮含量的動態變化

2.3 不同抑制劑對不同土壤表觀硝化率的影響

由圖4可知，ASN處理的水稻土、潮土硝化作用發生強烈，在培養期間表觀硝化率分別可增加到86.5%、100%，而各硝化抑制劑均可顯著降低水稻土和潮土的表觀硝化率。DCD和NP處理對水稻土和潮土表觀硝化率均表現出較為明顯的劑量效應，然而，DMPP對這2種土壤的表觀硝化率均無明顯的劑量效應。DCD、NP、DMPP各劑量處理的水稻土和潮土在第14 d的表觀硝化率平均值分別為30.3%、82.0%、27.7%和83.0%、39.3%和80.1%。然而，在紅壤上，各劑量處理3種硝化抑制劑間與ASN處理各培養時期土壤表觀硝化速率沒有顯著變化。

圖4 不同硝化抑制劑類型和劑量對土壤表觀硝化率的影響

由表2可知，土壤類型和硝化抑制劑類型顯著影響了土壤硝化作用。在水稻土中，DCD和NP處理的表觀硝化率平均值顯著低于DMPP處理，而NP處理的銨硝比顯著高于DCD和DMPP處理，說明NP處理在水稻土中延緩銨態氮向硝態氮轉化的能力強于DMPP和DCD處理。在潮土中，DCD處理的表觀硝化率顯著低于NP和DMPP處理，銨硝比顯著高于NP和DMPP處理，表明DCD處理對潮土硝化作用的抑制效果優于NP和DMPP處理。利用主成分分析（PCA）分析了土壤理化性質（pH值、無機氮含量、有機質含量和碳氮比 ）和硝化抑制劑濃度等主要因素與土壤表觀硝化率的關系（圖5）。主成分分析篩選出2個主成分，累積方差達83.8%。土壤pH值、硝態氮含量與土壤表觀硝化率存在較強的正相關，而碳氮比、有機質含量與表觀硝化率相關性較弱，硝化抑制劑濃度、銨硝比與土壤表觀硝化率存在負相關性。

圖5 土壤表觀硝化率與土壤理化性質、硝化抑制劑濃度的主成分分析

表2 不同土壤類型和硝化抑制劑類型對土壤硝化作用的影響（第21 d）

3 討論

土壤pH值是調控土壤硝化過程的關鍵因素，先前研究表明，在pH為5.0～8.0的范圍內，硝化速率與土壤pH值呈正相關［22］。土壤pH值是調控硝化抑制劑抑制硝化作用效果的主要因素（圖5），在一定范圍內，隨著土壤pH值的增大，硝化抑制劑的作用效果越明顯［23］。本研究的3種土壤中，堿性潮土的硝化作用強于水稻土和紅壤，其中紅壤的硝化能力最弱，進而導致3種硝化抑制劑整體上對潮土和水稻土的硝化抑制劑作用強于酸性紅壤。與之前的研究結果一致［24］。在第14 d時，與ASN處理相比，各硝化抑制劑處理的水稻土、潮土表觀硝化率分別降低10.1%～21.8%、17.0%～18.0%，而紅壤中各硝化抑制劑處理間的表觀硝化率均無顯著差異。導致這一差異可能的原因是土壤pH值主導著氨氧化微生物的生態位，研究表明［25］，氨氧化古菌（AOA）主導著酸性土壤的硝化作用，氨氧化細菌（AOB）主導著中性和堿性土壤的硝化作用。Beeckman等［26］基于文獻總結發現，DCD、DMPP和NP這3種硝化抑制劑對AOB的抑制效果顯著高于AOA。一方面是由于AOB的豐度隨著土壤環境pH值的增大被顯著抑制，另一方面可能是由于基本代謝和細胞之間的差異，細菌相對古菌更容易受到抑制的影響［20］，硝化抑制劑主要通過抑制環境中主導硝化微生物菌群的生長，從而抑制硝化過程。這也可能是本研究中3種硝化抑制劑在潮土和水稻土的抑制效果要強于紅壤的原因。

硝化抑制劑類型對不同土壤類型的表觀硝化率和銨硝比有顯著影響（表2），導致不同硝化抑制劑類型的抑制效果存在顯著差異。本研究中，在水稻土中，NP的抑制效果強于DMPP和DCD；在潮土中，DCD的抑制效果優于NP和DMPP。這與賴晶晶等［27］研究結果一致，其研究結果表明，不同硝化抑制劑類型對不同pH值紫色土硝化過程的抑制效果不一致。導致此差異的主要原因在于：一方面，大多數硝化抑制劑通過抑制硝化作用過程中第一個步驟（氨氧化過程）的氨單加氧酶（AMO）活性以實現延緩硝化作用的目的，不同的硝化抑制劑類型具有不同的硝化抑制機理［13］，因此對氨氧化微生物的作用效果也有所差異。有研究表明，DCD和DMPP屬于金屬螯合抑制劑，能與氨AMO中amoB亞基的活性位點銅螯合，使氨氧化微生物中AMO活性降低，進而影響氨氧化微生物的豐度和群落結構，最終抑制氨氧化過程，且該2種硝化抑制劑對AOB豐度的抑制效果強于對AOA豐度的抑制效果［26，28］。NP可直接與AMO結合產生不可逆失活的氨氧化產物，從而抑制氨氧化過程，對AOA和AOB豐度都有抑制作用，其抑制效果強弱主要取決于硝化過程主導的氨氧化微生物種群［26，28-29］。另外，硝化抑制劑的自身結構特點也是影響抑制效果的關鍵因素。DCD的水溶性較大，在含水量較大且保水能力較弱的土壤中，一旦遭遇強降雨會隨水流失，抑制效果降低［30-31］；NP在光照條件下易于分解，造成揮發導致抑制效果不理想，不宜表施［32］；DMPP遷移性較小，不易與土壤剖面中的銨態氮分離，低劑量DMPP也能保持較好的抑制效果［30］。

硝化抑制劑用量是影響土壤硝化作用抑制效果的重要因素（圖5），總體而言，隨著劑量的增大，對硝化作用的抑制效果越明顯［33-34］。DCD和NP對水稻土和潮土的硝化抑制作用表現出明顯的劑量效應。然而，DMPP對水稻土和潮土的硝化抑制作用無明顯的劑量效應。當DCD和NP用量分別為純氮用量的5%～10%和0.5%～1.0%時，即可有效抑制水稻土和潮土硝態氮向銨態氮的轉化。與劉倩等［34］和管西林等［35］研究結果一致。有研究表明，DMPP不同用量在大宗土壤中硝化作用的抑制效果無明顯差異［33，36］，與本研究結果一致，可能的原因是DMPP在土壤中比較容易被土壤膠體吸附［30］，且在土壤剖面中不易與銨態氮分離［37］。本研究結果顯示，在水稻土和潮土中DCD、NP的硝化抑制劑效果均優于DMPP，然而，一項基于全球土壤數據的整合分析表明，DMPP在中性或堿性土壤上對由硝化作用導致的硝酸鹽淋洗損失降低效果要好于DCD和NP［25］，這可能與土壤質地、有機質含量等理化性質關系強烈。由于紅壤pH值較低，土壤硝化作用比較弱，不同硝化抑制劑不同用量對紅壤的硝化作用抑制效果均不顯著，Wang等［38］的結果顯示，酸性紫色土的硝化作用強度顯著低于中性、堿性紫色土，而隨著土壤pH值的降低，硝化抑制劑對硝化過程的抑制效果隨之降低［39］。張昊青等［20］研究表明，適宜量的石灰和硝化抑制劑結合施用，不僅能夠減緩酸性紅壤的酸化，而且能夠抑制硝化作用，降低硝態氮的潛在環境風險。

大量研究證實，在我國蔬菜［40］、水稻［41］、玉米［42］等不同作物生產系統中，氮肥配施硝化抑制劑能夠提高氮肥利用率的同時增加作物產量。然而，因地域環境、氣候條件的差異導致我國土壤類型眾多，而硝化抑制劑的作用效果因土壤類型而大有差異，因此，要結合當地的氣候條件、生態環境因地制宜的選擇最佳硝化抑制劑類型，同時還應考慮劑量的大小帶來的環境效益。今后的研究中應結合我國農業生產特性加強室內培養試驗和大田示范性研究的結合，從微觀角度進一步揭示硝化抑制劑的作用機理，加快硝化抑制劑在我國推廣應用的進程。

4 結論

3種硝化抑制劑均可延緩水稻土和潮土的酸化作用，對紅壤pH值影響不顯著。由于潮土和水稻土硝化能力強，3種硝化抑制劑均可顯著抑制潮土和水稻土硝化過程中的銨態氮向硝態氮轉化過程，對該2種土壤硝化作用抑制效果好，且在堿性潮土中的硝化抑制效果要優于偏中性水稻土，由于酸性紅壤自身硝化能力弱而在酸性紅壤中的抑制效果均不明顯。DCD和NP對潮土和水稻土中硝化作用的效果有明顯的劑量效應，當DCD和NP用量分別為純氮用量的5%～10%和0.5%～1.0%時，作用效果最佳。硝化抑制劑類型對土壤表觀硝化率有顯著影響進而導致不同硝化抑制劑類型的抑制效果存在顯著差異，在水稻土中，NP的抑制效果強于DMPP和DCD；在潮土中，DCD的抑制效果優于NP和DMPP，這些差異可能是由不同硝化抑制劑類型硝化抑制機理的差異以及其自身特性的差異導致的。