不同濃度新型分裂素PBU誘導的尾巨桉愈傷組織中miRNA396及CKX基因表達差異研究

劉亞梅 吳宇朋 李莉梅 蘇 敏 余 珠 歐陽樂軍*

（1. 喀什大學生命與地理科學學院，葉爾羌綠洲生態與生物資源研究高校重點實驗室，喀什 844000；2. 廣東石油化工學院生物與食品工程學院，茂名 525000）

桉樹是世界上公認的三大人工林樹種之一，在全球各地的種類已達到1 000多種。桉樹不僅在環境綠化、生態保護等方面起著重要作用，還廣泛應用于制漿造紙行業，也可作為實木用材，葉片還可用于提煉桉葉油，在化工生產方面也有著重要作用。中國是目前世界上種植桉樹面積第三的國家，其木材產量占全國木材總產量的30%左右，大大緩解了我國對天然林保護的壓力。尾巨桉（）是尾葉桉和巨桉的雜交種，具有良好的雜交優勢，是綜合性比其他桉樹品種更好的速生樹種。因桉樹種子高度雜合，其種苗生產一直是通過植物組培技術進行，但普遍存在不定芽分化效率不理想，再生效率低等問題。由于桉樹的遺傳背景較為復雜，遺傳機理尚未明確，大多數性狀屬于多基因調控，常規育種手段已經無法滿足培育不同用途的桉樹優良品種的需求，利用基因工程技術進行遺傳改良具有十分廣闊的應用前景。

建立尾巨桉高效的離體再生體系是開展基因工程育種的前提，因此，尾巨桉愈傷組織誘導及不定芽分化機理的研究受到廣大研究工作者的高度重視。尾巨桉離體再生過程受到多方面因素的影響，其中內源激素的調控尤為重要，如細胞分裂素與生長素等。尾巨桉愈傷組織的內源激素受miRNA所調控，miRNA396便是其中一種與尾巨桉愈傷組織內源分裂素含量緊密相關的miRNA，從而調控愈傷組織的分化與不定芽的發生。最近幾年關于miRNA396基因家族的研究表明，在擬南芥中的miRNA396 有miRNA396A 和miRNA396B兩個基因，靶向7 個生長調節因子（Growth-Regulating Factor，），根據miRBase 上登錄的miRNA396 及其基因家族的研究進展來看，miRNA396是一條相當保守的miRNA，僅存在于36 個物種之中。在 水 稻 中，miRNA396 由8 個 基 因 編 碼（miRNA396A～H），可以影響水稻的籽粒發育與抗旱能力等。大豆根系能否正常發育已被證實與9 個miRNA396 及其23 個靶基因（）所構成的調控網絡有重要關系。根據公布的巨桉基因組比對分析，尾巨桉中miRNA396 家族有miRNA396A、miRNA396B，負責調控尾巨桉愈傷組織中的細胞分裂素氧化酶基因（Cytokinin oxidase gene，）與生長調節基因，從而參與尾巨桉愈傷組織內源激素對其生長分化的調控。細胞分裂素幾乎參與了植物生長發育的全部過程，特別是細胞的分裂與分化的過程，而基因可以有效地調節植物組織中細胞分裂素的水平，進而參與了調控植物的生長發育過程。據研究，miRNA396通過調控其靶基因來影響植物的生根、發芽、開花和結果等生物學過程，也能控制植物體內細胞的代謝與植物對脅迫的反應。歐陽樂軍等前期研究中發現新型分裂素PBU 對尾巨桉再生具有重要的調控作用。因此，研究不同濃度的PBU 處理下，尾巨桉愈傷組織miRNA396及基因表達差異，對研究尾巨桉高效再生體系建立有重要意義。

本研究以尾巨桉的無性系無菌苗的莖段作為外植體，以MS 作為基本培養基，添加瓊脂、蔗糖，并用自主合成的高活性噻唑基脲類新型植物生長調節劑PBU（專利號：ZL200510035860.X）結合IAA 誘導愈傷組織，選取不同濃度PBU 處理的桉樹愈傷組織樣品，提取總RNA，反轉錄得到cDNA，利用實時熒光定量PCR，分析了基因家族和miRNA396A、miRNA396B 在尾巨桉不同愈傷組織中的表達差異，初步分析miRNA396和基因對尾巨桉內源激素的調控作用。本研究結果可為優化尾巨桉胚性愈傷組織誘導提供一定依據，為揭示尾巨桉胚性愈傷組織發生及分化的分子機制提供一定的借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

湛江市林業科學研究所提供的尾巨桉無菌苗為材料，切取無芽點的莖段分別接種在0.5（樣品1）、1.0（樣品2）、2.0（樣品3）mg·L不同質量濃度的PBU 誘導愈傷組織，其他培養基組成為MS+0.05 mg·LIAA+100 mg·LVc，pH5.8～6.0，暗 培養2周后光培養1周，分別命名為樣品1、2、3，作為后續試驗材料。

1.2 主要試驗試劑

異丙醇、Tris、EDTA、NaCl、SDS、焦碳酸二乙酯（Diethy pyrocarbonate，DEPC）、無水乙醇、氯仿、Ms基鹽、蔗糖、瓊脂、Vc等購置于廣州化學試劑廠，新型噻唑基脲類細胞分裂素（N-phenyl-·N′-［6-（2-chlorobenzothiazol）-yl］urea，PBU）由本實驗室保存，Trans Zol Up Plus RNA Kit總RNA提取試劑盒、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒、Perfect StartGreen熒光定量PCR SuperMix 熒光定量試劑盒購于全式金生物技術有限公司，TIANgel Midi Purification Kit 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物設計

利用Primer 5 軟件設計鑒定及熒光定量PCR引物。以基因作為內參基因，引物序列見表1。引物合成由生工生物工程（廣州）有限公司完成。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence used in the expriment

1.4 試驗方法

分 別 用Eu396A-F、Eu396B-F 和Eu396A-R、Eu396B-R 為上下游引物，以尾巨桉基因組DNA 為模板，進行PCR 擴增，反應擴增程序為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環；72 ℃最終延伸3 min；4 ℃保存。將得到的PCR 產物用瓊脂糖（1.5%）凝膠電泳進行驗證并回收目的條帶。

將回收純化所得的PCR 產物送檢測序，利用DNAMAN 軟件對測序結果和miRNA396A、miRNA396B 進行比對，用Primer 5 軟件設計熒光定量PCR引物。引物設計方法同1.3，引物合成序列見表1。

分別提取前述3 種不同試驗處理得到的愈傷組織RNA，提取方法參照全式金生物技術有限公司Trans Zol Up Plus RNA Kit 總RNA 提取試劑盒，使用超微量分光光度計測定總RNA濃度。

使用全式金生物技術公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒，將上述RNA 逆轉錄成cDNA，進行下一步的實驗操作。

選用樣品1 的cDNA 作為模板，進行熒光定量PCR 擴增。為研究內參基因與目的基因引物特異性，進行不同退火溫度梯度的定量PCR 實驗。分別設置為56、58、60 ℃，其他條件不變。熒光定量PCR 反應體系為：2×TransScript Tip Green 熒光定量PCR SuperMix 10.0 μL，正向、反向引物各0.4 μL，cDNA 2.0 μL，ddHO 7.2 μL。反應程序：94 ℃30 s，94 ℃5 s，56 ℃/58 ℃/60 ℃15 s，72 ℃10 s，每個擴增40次循環，每一個溫度做3個重復。

采用全式金生物技術公司Perfect StartGreen 熒光定量PCR SuperMix 熒光定量試劑盒，StepOne 實時熒光定量PCR 儀對尾巨桉miRNA396A、miRNA396B 和基因的表達量進行檢測。內參基因選用尾巨桉基因，采用三步法進行熒光定量PCR，分析在不同濃度PBU 誘導下得到的桉樹愈傷組織中miRNA396 和基因的表達差異。數據使用2法計算分析。熒光定量PCR 的程序設置為94 ℃30 s，94 ℃5 s，58 ℃15 s，72 ℃10 s，40 個循環。使用模板量為1 000 ng 反轉錄得到的cDNA 作為熒光定量PCR 的模板，每個樣品做3個重復，反應體系同1.4.3。

2 結果與分析

2.1 miRNA396的PCR擴增結果

由圖1 可見，miRNA396A 與miRNA396B 擴增條帶很亮，說明擴增效率好，且兩條目的條帶的大小與預期相符；條帶濃度好，經送樣測序分析，結果比對見圖2，與預期生信分析的尾巨桉miRNA396A、miRNA396B 序列完全一致，圖中個別堿基差異是由套峰所致。

圖1 miRNA396A與miRNA396B擴增電泳圖1.miRNA396A；M.Marker；2.miRNA396BFig.1 Amplification electrophoresis of miRNA396A gene and miRNA396B gene 1.miRNA396A；M.Marker；2.miRNA396B

圖2 miRNA396A與miRNA396B序列比對圖A.miRNA396A序列比對圖；B.miRNA396B序列比對圖Fig.2 Sequencing results of miRNA396A and miRNA396BA.miRNA396A sequence alignment diagram；B.miRNA396B sequence alignment diagram

在DNAMAN 軟件中對比測序結果，選取miRNA396A 和miRNA396B 中一段連續200 bp 的堿基序列，以此序列設計熒光定量PCR的引物。

2.2 尾巨桉RNA提取結果

圖3 為不同濃度細胞分裂素PBU 處理下的桉樹愈傷組織誘導結果，不同濃度PBU 誘導得到的愈傷組織在形態大小上都表現出較大差異。在0.5 mg·L細胞分裂素PBU 處理下的桉樹愈傷組織質地緊密，呈顆粒狀，在1mg·LPBU 誘導的桉樹愈傷組織質地疏松、較膨大，頂端呈黃白色，在2 mg·LPBU 處理下的桉樹愈傷組織分裂呈規則分裂的形態，整體表現為綠色。

圖3 不同濃度PBU誘導得到的桉樹愈傷組織A.0.5 mg·L-1 PBU；B.1.0 mg·L-1 PBU；C.2.0 mg·L-1 PBUFig.3 Eucalyptus callus induced by different concentrations of PBUA.0.5 mg·L-1 PBU；B.1.0 mg·L-1 PBU；C.2.0 mg·L-1 PBU

圖4 為不同濃度細胞分裂素PBU 處理下的桉樹愈傷組織的RNA 提取電泳結果?？梢钥闯? 個樣品RNA 電泳圖中18 與28 S 兩條帶清晰無降解，并且28 S 的亮度很亮，幾乎是18 S 的兩倍，說明提取的RNA 完整性較好。也沒有雜帶，說明RNA 提取過程中沒有受到DNA的污染。符合后續逆轉錄與熒光定量PCR實驗要求。

圖4 不同樣品的RNA提取結果M.Marker；1～3.樣品1～3Fig.4 RNA extraction results of samplesM.Marker；1-3.Sample 1-3

使用超微量分光光度計所測得的RNA 濃度與OD/OD的值。3 份樣品的濃度最低為206 ng·μL，最 高 為655 ng·μL，OD/OD值 都 在1.8～2.0，證明提取的RNA 污染較少，提取的RNA濃度和純度均滿足后續實驗的要求。

2.3 擴增特異性分析

為了探究基因及目標基因的最適退火溫度，本實驗選用56、58 和60 ℃進行熒光定量PCR，對3 個溫度的擴增曲線和熔解曲線的結果進行分析?，F不同退火溫度下的目標基因都呈現單峰，說明引物特異性較好，但是基因的熔解曲線在56 與60 ℃時均出現了雜峰，因此，后續基因表達分析采用58 ℃為退火溫度。

2.4 基因表達測定結果

經StepOne Software v2.3軟件分析miRNA 396的表達差異，根據所測得的樣品CT值，代入2法的公式計算它們的相對表達量，并使用SPSS軟件對基因表達差異結果進行差異顯著性分析（檢驗），其結果見圖5。

圖5 不同濃度PBU誘導的愈傷組織中目標基因表達差異*表示不同濃度PBU誘導的愈傷組織基因表達量差異顯著；**表示不同濃度PBU誘導的愈傷組織基因表達量差異極顯著Fig.5 Different expression of target genes in callus induced by different concentrations of PBU* indicated significant difference among different concentrations of PBU（P＜0.05）；** indicated significant difference among different concentrations of PBU（P＜0.01）

與樣1 相比較，miRNA396A 和miRNA396B 在樣2 中表達量均下調，分別為樣1 的0.003 4 和0.032 1 倍，顯著性檢驗結果sig=0.000 3＜0.01 和sig=0.004 3＜0.01，說明差異極顯著。而樣3 的miRNA396A表達量下調為樣1的0.326 4倍，sig=1.46×10＜0.01，差異達到極顯著水平，miRNA396B表達量卻上調為樣1的1.149 3倍，sig=0.050 6＞0.05，差異不顯著。3 個樣品的擴增曲線都呈現出明顯的增長期和平臺期，且每個樣品的3個重復性較好。

用同樣方法對基因進行分析，其結果見圖5。與樣1 桉樹愈傷組織基因表達量相比較，樣2 的、和基因表達量下調，分別為樣1 的0.169 7、0.168 8 和0.756 6 倍，sig=1.067 1×10、sig=0.006 3、sig=0.003 4，均小于0.01，證明差異均達到極顯著水平，其他基因均上調。在上調的基因里，除基因表達量為樣1的14.360 1倍，sig=0.000 3＜0.01，差異達到極顯著性水平外，其他兩個基因表達差異均不顯著。同樣對樣3 的基因表達量進行分析。相較于樣1，樣3 的基因均上調，基因均下調，上調基因倍數對應為樣品1 的1.161 8、4.316 4、14.562 0 倍，顯著性檢 驗 結果sig=0.036 1、sig=0.002 3、sig=0.000 3，差異分別達到顯著、極顯著和極顯著水平，下調基因倍數對應為樣品1 的0.129 2、0.224 3和0.907 6 倍，sig=7.184 1E-09、sig=0.001 0、sig=0.000 4，均小于0.01，差異均達到極顯著水平。

3 討論

本 研 究 發 現，miRNA396A 與miRNA396B 在0.5 mg·LPBU 誘導下的桉樹愈傷組織表達量最高，因為在低濃度范圍內，隨著細胞分裂素濃度升高，愈傷組織的生長代謝加快，在1.0 和2.0 mg·LPBU 處理下的桉樹愈傷組織生長發育狀況要好于用0.5 mg·LPBU 誘導的桉樹愈傷組織。miRNA396通過作用其靶基因來形成調控植物組織生產發育的調控網絡。在本研究中的3種樣品中，2.0 mg·LPBU誘導的愈傷組織已出現芽點，生長狀態最好。在生長發育狀態更好的愈傷組織中，2 個基因的表達量都出現了下調，說明miRNA396A 與miRNA396B 負調控尾巨桉愈傷組織內源激素合成。細胞分裂素在高等植物中存在主要部位是細胞分裂活躍的器官和組織，CKX 是目前已知惟一的專一催化天然異戊烯類CK 及其核苷的不可逆降解的黃素酶，它的合成由基因表達調控。通過降解細胞分裂素，調控植物體內細胞分裂素平衡，進而調控植物的生長發育，同時與植物的抗逆性和產量有密切的聯系?；蚝突蛟?.0 mg·LPBU 誘導下的桉樹愈傷組織表達量最高，因為細胞分裂素氧化酶通過氧化細胞分裂素從而下調植物細胞內細胞分裂素含量，由于環境中的細胞分裂素濃度大大增加，為了使愈傷組織內的細胞分裂素水平達到穩定狀態，降解掉多余的CK，和基因在轉錄成mRNA 時受到正向調控，促進了它們的表達。同時細胞分裂素的含量是促進愈傷組織芽分化的重要因素之一，樣品3 的愈傷組織和樣品1、2 在外觀上已有明顯區別，樣品1、2 的愈傷組織整體呈紅色，而樣品3的愈傷組織呈大面積綠色，已經有分化出芽點的趨勢，可見在小于2 mg·LPBU 濃度時，升高培養基中的PBU 濃度可促進芽的分化。

本研究通過探究miRNA396 在不同生長發育時期及在不同濃度細胞分裂素培養的尾巨桉愈傷組織表達效率差異，初步確立了miRNA396 在尾巨桉植物組織中的調控情況和基因的表達差異，為后續進行尾巨桉miRNA 調控網絡的解析奠定了基礎。在此基礎，可繼續進行基因的表達效率差異測定的研究，從而確立調控網絡體系對尾巨桉愈傷組織誘導及不定芽分化的具體調控方法，進一步促進新型分裂素PBU 在尾巨桉高活性愈傷組織誘導及不定芽分化中的應用?；蚓哂械慕M織表達特異性，即使是在同一個進化分支上的基因表達模式也不盡相同，因此可以推測基因在進化過程中分化出了不同的功能?；蚣易宓牟煌蓡T在植物生長發育的不同階段都在相應的組織部位中發揮著其特定的作用，但其具體作用還有待深入探究。miRNA396 在植物中的調控網絡非常復雜，研究miRNA396 及其靶基因對植物組織生理分化等的影響具有重要意義。miRNA396 基因家族在多種植物中的調控網絡正逐漸被解密，在尾巨桉中的表達與調控只是miRNA396 基因調控網絡中極小的一部分。相信在未來，miRNA 在植物發育中的調控網絡究會成為眾多研究者所關注的熱點。