烏龍茶水提物的膜分離制備及其體外抗氧化活性評價

林清霞, 楊軍國, 王麗麗, 宋振碩, 陳林*

烏龍茶水提物的膜分離制備及其體外抗氧化活性評價

林清霞1, 楊軍國2, 王麗麗1, 宋振碩1, 陳林1*

(1. 福建省農業科學院茶葉研究所，福州 350013；2. 閩南師范大學生物科學與技術學院，福建 漳州 363000)

為探究烏龍茶水提液的不同膜分離工藝對產品品質、生化成分及體外抗氧化活性的影響，采用陶瓷膜(500 nm)和超濾膜(20、10、5、3.5 kD)對烏龍茶水提液進行分離，經噴霧干燥制得茶粉。通過感官品質、物理性質等方面評價不同膜分離工藝所制備的茶粉品質，并對茶粉的主要生化成分進行分析比較。同時，通過DPPH自由基清除力、FRAP氧化還原力、羥基自由基清除力、抗超氧陰離子活力方法評價茶粉的體外抗氧化活性。結果表明，陶瓷膜透過液的感官品質綜合得分最高，體外抗氧化活性亦最高。500 nm陶瓷膜可有效分離與富集茶多酚(TPs)、游離氨基酸(FAAs)、咖啡堿(CAF)、可溶性糖(SPS)等物質，還可達到除雜效果，經陶瓷膜分離后的烏龍茶水提液再經超濾膜分離，對TPs、CAF、SPS、兒茶素組分無分離與富集效果。截留分子量小于10 kDa的超濾膜可有效分離與富集游離氨基酸。500 nm陶瓷膜截留液的SPS含量最高，但綜合感官品質最差，抗氧化活性最低?；谄焚|、功效、節能3大要素考慮，500 nm陶瓷膜透過液制備的茶粉綜合品質最優。

閩南；烏龍茶；水提物；膜分離；抗氧化活性

茶葉深加工是將茶葉資源的開發利用拓展到功能食品、保健品、醫藥品、日化用品等領域，不僅豐富了茶葉市場的產品形態，更為傳統的茶產業帶來了良好的發展機遇，解決中低檔茶葉銷路，提升了茶葉附加值，增加茶產業的經濟效益。近年來，高品質、高功效、綠色節能這3大要素成為茶葉深加工行業的主旋律。膜分離技術具有高效、綠色、節能、不發生相變等優點，在茶葉精深加工領域已開展了廣泛的應用。Subramanian等[1]指出茶提取液內的小顆粒懸浮物，兒茶素及其氧化產物的相互作用，咖啡堿、蛋白質、果膠和金屬離子等絡合形成絮狀物是目前制約茶飲料發展的重要因素，需去除冷后渾或阻止冷后渾的形成，保障產品的澄清透徹。文中對紅茶和綠茶提取物的膜澄清技術進行討論，認為膜技術潛力巨大，對提高產品穩定性，減少冷后渾，保留茶提取液固有風味均有重要意義。Kumar等[2]采用兩級水基萃取法并結合微濾、超濾技術從綠茶中提取了高純度的表沒食子兒茶素沒食子酸酯。Chandini等[3]采用不同孔徑的微濾膜和超濾膜對紅茶提取物進行澄清，隨著膜孔徑的減小，茶葉澄清度增加，但截留分子量為500 kDa的超濾膜和微濾膜能更大程度地保留茶葉原有的顏色，固體回收率更高，包括澄清提取物中的多酚含量。蕭力爭等[4]比較了截留分子量為2 500、3 500和5 000 D的超濾膜對兒茶素渣料中茶氨酸得率與純度的影響，結果表明3 500 D的超濾膜效果最佳, 可獲得純度為8.92%的茶氨酸料液。程文娟等[5]采用膜分離與大孔吸附樹脂聯用技術純化茶皂素，茶皂素得率為55.3%，純度可達95%。姜紹通等[6]以綠茶茶末為原料，水相浸提后，選用10萬分子量超濾膜過濾再上吸附樹脂吸附分離制得產品純度達91.82%的茶多酚，比未超濾前茶多酚產品純度提高了13.14%。然而，研究多聚焦于膜分離產品的澄清、得率、純度，以及與其他技術的聯用。茶葉提取物的膜分離產品的生物學活性變化評價尚缺乏系統性的研究。茶葉具有多種保健功效，尤以抗氧化活性成為眾多學者關注的焦點[7–9]。因此，本研究以陶瓷膜、超濾膜對烏龍茶水提液進行分離, 比較不同膜分離對烏龍茶提取物的品質、生化成分及體外抗氧化活性的影響，從而為膜分離在茶葉深加工領域進一步應用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

鐵觀音品種制作的清香型烏龍茶(表1)，購自茶葉市場。主要試劑：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH, 純度>97.0%)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ，純度> 98%)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox, 純度>98%)購自合肥博美生物科技有限責任公司；六水合氯化鐵、福林酚、蒽酮、茚三酮等均為分析純試劑，購自上海國藥；羥基自由基試劑盒、超氧陰離子試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；標準品(純度均大于98.0%)，購自美國Sigma公司。

表1 樣品來源及編碼

1.2 主要儀器設備

HWS.28電熱恒溫水浴鍋(上海恒科公司); VARIO- SKAN LUX酶標儀(美國Thermo SCIENTIFIC公司);T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用); R- 100旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)；B-290噴霧干燥機(瑞士BUCHI公司)；膜分離系統(濟南博納生物技術有限公司)：包括BONA-GM-22陶瓷膜小型實驗機, BONA-GM-19反滲透膜小型試驗機，陶瓷膜元件(長度30 cm，直徑3 cm，孔徑500 nm，過濾面積0.08 m2)，超濾膜元件(PES聚醚砜材質，長度30 cm, 直徑5 cm, 過濾面積0.4 m2，選用截留分子量20、10、5、3.5 kD幾種超濾膜元件進行試驗)；Agilent 1260型高效液相色譜系統(美國Agilent公司)：包括四元泵(G1311CVL)、標準自動進樣器(G1329B)、柱溫箱(G1316A)和二極管陣列檢測器(G1315DVL)。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

茶樣磨碎，過40目，按1∶25 (/)加入沸水，100 ℃浸提45 min[10–12]，每10 min振搖1次趁熱抽濾；過濾液灌入陶瓷膜過濾設備中微濾，維持操作壓力0.15～0.2 MPa、全程冷凝水處理，平均溫度約為25 ℃；適時加水洗膜，收集陶瓷膜透過液和截留液。陶瓷膜透過液灌入超濾膜過濾設備中，適時加水洗膜，收集超濾膜透過液和截留液。樣品制作工藝流程見圖1。

圖1 樣品制作工藝流程

1.3.2 茶粉品質及主要生化成分檢測

茶粉感官審評參照GB/T 23776—2018和GB/T 31740.1—2015[13–14]，茶多酚(tea polyphenols, TPs)含量參照GB/T 8313—2018 (福林酚比色法)[15]，游離氨基酸(free amino acids, FAAs)參照GB/T 8314— 2013 (茚三酮比色法)[16]，可溶性糖(soluble polysac- charide, SPS)含量測定參照傅博強等[17]的方法(硫酸-蒽酮比色法)，咖啡堿(caffeine, CAF)、沒食子酸(gallic acid, GA)、兒茶素及氨基酸組分含量分別參照文獻[18–19]中的HPLC方法測定。

1.3.3 茶粉體外抗氧化活性測定[10,20]

DPPH自由基清除力 精密稱取100 mg茶粉,用蒸餾水定容至10 mL作為母液備用，取適量母液, 用蒸餾水梯度稀釋至4、6、8、10、12g/mL。取2 mL溶液于試管中，加入0.1 mmol/L的DPPH 溶液2 mL，測定茶粉的DPPH自由基清除能力, 并計算IC50。

總抗氧化能力 采用FRAP (ferric ion reducing antioxidant power)法測定。取10 mg/mL的母液用蒸餾水稀釋至200g/mL，分別取0.3 mL上述溶液于試管中，加入2.7 mL的FRAP工作液，混勻后37 ℃暗處靜置40 min，593 nm下測吸光值。以Trolox梯度濃度繪制標準曲線，以1 g茶粉的毫摩爾Trolox當量(mmol TE/g)表示。

羥基自由基清除力、抗超氧陰離子能力 采用羥基自由基試劑盒、超氧陰離子試劑盒檢測。羥基自由基清除試驗系列梯度濃度為100、150、200、250、300g/mL，并計算IC50?？钩蹶庪x子試驗濃度為10 mg/mL，以維生素C為標準，1 mg維生素C所抑制的超氧陰離子自由基的值為1個活力單位。

1.4 數據統計分析

所有數據以平均值±標準差(=3)表示。采用ChemPattern 2017 Pro對供試樣的氨基酸組分和兒茶素組分進行主成分分析；采用Excel對數據進行處理和作圖；采用SPSS 19.0軟件對數據進行單因素方差分析，顯著性水平為0.05。

2 結果和分析

2.1 不同膜分離部分對茶粉品質的影響

從表2、3可見，烏龍茶提取液經過陶瓷膜、不同孔徑的超濾膜進行分離，茶湯透過液的透光率、吸光度、冷溶性均得到明顯改善，感官品質佳。S0 保持茶湯原有的純正香氣和醇厚滋味，觀音特征明顯，然而其溶液透明度欠佳(圖2)，冷溶性較差。S1的鐵觀音特征稍有減弱，其花香清高，滋味濃厚甘甜，并且其透光性、吸光度、冷溶性均明顯優于S0。S3、S4、S5鮮味明顯增加，同時其收斂性也加強；S6綜合感官品質最差；S7、S8、S9、S10得率較低。

2.2 膜分離對茶粉主要化學成分的影響

2.2.1 茶粉的TPs、FAAs、CAF、SPS

TPs是茶湯中苦澀味的主體成分，亦是茶葉抗氧化的主要活性成分；FAAs、SPS分別是茶湯中鮮爽味和甜味的主體成分；CAF是茶葉中含量最高的嘌呤堿，呈苦味[21–22]。鮮、甘、苦、澀是茶湯的主味，因此，考察茶粉的TPs、FAAs、SPS和CAF含量對評價其感官品質具有重要意義。從表4可見, S1的TPs、FAAs、CAF含量均顯著高于S0和S6，S6的SPS含量顯著高于S0和S1，這說明500 nm孔徑的陶瓷膜過濾烏龍茶提取液可有效分離與富集TPs、FAAs、CAF、SPS等物質；結合表2和3, 孔徑為500 nm陶瓷膜可有效去除茶浸提液中的細微顆粒、懸浮雜質等大分子物質，這從另一方面說明，陶瓷膜過濾不僅可以分離與富集茶湯中的主要活性物質，還可達到除雜效果，進而大大提高茶粉品質。S1的TPs、CAF、SPS含量顯著高于S2、S3、S4、S5；除S2的CAF含量顯著低于S7，其他各膜透過液的TPs、CAF、SPS與截留液均無顯著性差異。綜上所述，經陶瓷膜過濾后的烏龍茶提取液再經截留分子量為20、10、5、3.5 kDa的超濾膜過濾，對TPs、CAF、SPS無分離與富集效果。S3、S4、S5的FAAs含量顯著高于S0、S1、S2，S2、S3、S4、S5的FAAs含量均顯著高于S7、S8、S9、S10，這說明分離與富集游離氨基酸適合選擇截留分子量小于10 kDa的超濾膜。

表2 不同茶粉的感官品質

S0～S10見表1。以下圖表同。

S0-S10 see Table 1. The same is following Tables and Figures.

表3 不同茶粉的物理性質

同列數據后不同字母表示差異顯著(<0.05)。下表同。

Data followed different letters within column indicate significant differences at 0.05 level. The same is following Tables.

圖2 0.6 g茶粉加入150 mL蒸餾水得到的水溶液

表4 茶粉的主要化學成分含量(%)

2.2.2 不同茶粉的兒茶素組分

兒茶素類是茶多酚的主體成分，占多酚類總量的60%～80%，主要包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate, ECG)、表沒食子兒茶素(epi-gallocatechin, EGC)和表兒茶素(epicatechin, EC)[7]。對茶粉的主要兒茶素組分和沒食子酸進行主成分分析(principal component analysis, PCA)，以茶粉在第1、2主成分(PC1、PC2)上的得分作圖，數據預處理采用基于變量的單位方差標度(unit variance scaling, UV-scaling)。由圖3可見，各茶粉主要兒茶素組分的PC1和PC2分別為78.64%和14.37%，累積方差貢獻率達93.01%，各茶粉有3個明顯的類群區分。結合多重比較結果(表5)分析，烏龍茶提取液經陶瓷膜過濾后，兒茶素組分以及沒食子酸含量均顯著提高，即經膜分離，各茶粉均向右偏移，以S1的偏移幅度最大。S1中的兒茶素組分及沒食子酸含量均顯著高于S0和S6，由此可見，孔徑為500 nm的陶瓷膜可有效分離與富集沒食子酸及兒茶素組分。以S0為參照，S1和S9向上偏移，其他向下偏移，S3向下偏移幅度最大。S3的EGCG和ECG的含量顯著低于其他茶粉，而這2個組分含量占兒茶素總量50%以上。除S0和S3外，其他茶粉間不存在明顯的類群區分，這說明烏龍茶提取液經500 nm孔徑的陶瓷膜過濾后，其體系中的沒食子酸以及兒茶素組分不適合再選用截留分子量為10、5、3.5 kDa的超濾膜進一步分離與富集。這與肖文軍[23]的研究結果不一致, 可能是由于3.5 kDa的超濾膜對兒茶素組分具有一定的富集效果，但其含量的增加收效甚微，而每增加一道工藝環節均會增加兒茶素組分的損失，從而最終未表現出兒茶素組分含量的富集效果。

圖3 不同茶粉的沒食子酸和主要兒茶素主成分分析

2.2.3 不同茶粉的氨基酸組分

采用基于變量的UV-scaling預處理，對茶粉的游離氨基酸組分進行主成分分析，以茶粉在第1、2主成分(PC1、PC2)上的得分作圖。由圖4可見，各茶粉游離氨基酸組分的PC1和PC2分別為75.68%和8.77%，累積方差貢獻率達84.45%，各茶粉有3個明顯的類群區分。以S0為參照，S3向右偏移幅度最大。多重比較分析結果(表6)表明，16種氨基酸組分中，茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸3種約占FAAs的70%，主要表現為鮮爽味，其中代表性氨基酸-茶氨酸約占FAAs的40%～60%。S3的Thea、Glu、ASP的含量顯著高于S0和S6，而S3、S4、S5間無顯著性差異；S3、S4、S5的Thea、Glu、ASP含量顯著高于S7、S8、S9、S10，這與FAAs的變化趨勢是一致的，說明截留分子量小于10 kDa的超濾膜能有效分離與富集Thea、Glu、ASP。Tyr、Val、Leu、Phe、Lys為芳香味氨基酸，其變化趨勢與Thea、Glu、ASP等氨基酸基本一致。Ser與Ala為甜味氨基酸，S1的Ser和Ala含量顯著高于S0，但顯著低于S3、S4、S5。Ile、Leu、Phe為苦味氨基酸，S1的含量顯著低于S3、S4、S5。

表5 茶粉的沒食子酸、兒茶素組分含量

EGC: 表沒食子兒茶素; C: 兒茶素; EGCG: 表沒食子兒茶素沒食子酸酯; EC: 表兒茶素; ECG: 表兒茶素沒食子酸酯; TC: 兒茶素總量。

EGC: Epigallocatechin; C: Catechin; EGCG: Epigallocatechin gallate; EC: Epicatechin; ECG: Epicatechin gallate; TC: Total catechin.

圖4 不同茶粉的游離氨基酸組分主成分分析

2.3 不同茶粉的體外抗氧化活性分析

體外抗氧化能力測定方法具有快速、簡便、穩定等特點，但其反應是在非生理條件下進行的，且不同方法中的自由基或離子反應不同，單用某一方法缺乏說服力[24–25]。因此，本研究綜合多種抗氧化能力測定方法以考察其活性的高低。由圖5可以看出，DPPH清除能力、羥自由基清除能力、FRAP還原力3種抗氧化活性的變化趨勢基本一致，S1的抗氧化活性顯著高于S0, S6的活性最低，即500 nm陶瓷膜分離可顯著提高茶粉的抗氧化活性。S2、S3、S4、S5間的DPPH清除能力、羥自由基清除能力、FRAP還原力無顯著差異，S7、S8、S9、S10間亦無顯著差異，這說明不同孔徑的超濾膜分離對茶粉抗氧化活性影響不大?？钩蹶庪x子的變化趨勢與上述3種抗氧化活性的變化趨勢略有不同，S1亦顯著高于S0和S6，然而S8的抗超氧陰離子活力最高, 顯著高于S7、S9、S10，S5的抗超氧陰離子活力顯著低于S2、S3、S4。推測某種高抗超氧陰離子的物質能透過分子量為20 kD的超濾膜，卻被分子量為10 kD超濾膜截留,即高抗超氧陰離子的物質在該部分富集。

表6 茶粉的氨基酸組分含量(%)

續表(Continued)

同行數據后不同字母表示差異顯著(<0.05)。

Data followed different letters within a row indicate significant differences at 0.05 level.

圖5 茶粉的抗氧化活性。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論和討論

膜分離是20世紀60年代迅速發展起來的一門分離新技術，通過借助外界能量或化學位差的推動實現不同組分氣體或液體進行分離、分級和富集, 具有高效、節能、工藝簡單、污染少且不發生相變等優點，因而在醫藥、食品、環保、水處理等領域得到了廣泛的應用，成為當今分離學科中最重要的手段之一[26]。茶葉浸提過程中，提取有效成分的同時也會浸出蛋白質、果膠、纖維素等雜質，直接影響茶葉的感官品質、溶解性和澄清度。膜技術的引進可以達到理想的除雜效果，并能有效解決因高溫操作引起茶葉理化性質改變、高能耗和三廢等問題[27]。本研究采用陶瓷膜、超濾膜對烏龍茶水提液進行分離，結果表明經陶瓷膜、超濾膜分離的烏龍茶提取液，其透過液的透光率、吸光度、冷溶性均得到明顯改善，感官品質佳；以陶瓷膜透過液制備的茶粉感官品質綜合得分最高，抗氧化活性亦最高，各生化成分含量均處于較高水平。陶瓷膜透過液再經截留分子量為20、10、5、3.5 kDa的超濾膜分離，會提升其透過液的吸光度、透光率，但對TPs、CAF、SPS、兒茶素組分等無顯著富集效果；截留分子量小于10 kDa的超濾膜對游離氨基酸及其組分具有分離與富集效果。綜合品質、功效、節能等因素, 今后烏龍茶水提物的功能性產品的開發，可以考慮500 nm陶瓷膜進行分離富集。

肖文軍等[23]認為超濾膜可分離純化EGCG、EGC等有效成分，通過多級或組合膜工藝能夠提高膜功效，這與本研究結果不一致。這一方面可能是由于料液體系成分復雜，各成分間相互作用，各種膜對茶葉功能性成分的分離并不是嚴格按照各化學成分的分子大小、形狀或電荷等特性進行分離；另一方面可能是由于選擇的膜產品的品種、規格不適合本實驗膜技術處理要求，今后需系統性地探究膜材、膜孔徑及操作技術等對膜分離功效的影響, 并針對具體的茶葉料液體系設計篩選高效膜及其工藝。

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Preparation of Oolong Tea Water Extract by Membrane Separation and Evaluation of Antioxidant Activity

LIN Qingxia1, YANG Junguo2, WANG Lili1, SONG Zhenshuo1, CHEN Lin1*

(1. Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013, China; 2. School of Biological Science and Biotechnology, Minnan Normal University,Zhangzhou 363000, Fujian, China)

In order to investigate the effects of different membrane separation processes on product quality, biochemical components and antioxidant activity, the water extract of Oolong tea was separated by ceramic membrane (500 nm) and ultrafiltration membrane (20, 10, 5, 3.5 kD), and tea powder was prepared by spray drying. The quality of tea powder prepared by different membrane separation processes was evaluated through sensory quality and physical properties, and the main biochemical components of tea powder were analyzed and compared. Meanwhile, the antioxidant activity of tea powderwas evaluated by DPPH radical scavenging capacity, the ferric ion reducing antioxidant power (FRAP), hydroxyl radical scavenging capacity and anti- superoxide anion activity. The results showed that the sensory quality and antioxidant activity of ceramic membrane were the highest. The 500 nm ceramic membrane can effectively separate and enrich tea polyphenols (TPs), free amino acids (FAAs), caffeine (CAF), soluble sugar (SPS) and other substances, but also achieve the effect of impurity removal. The water extract of Oolong tea separated by ceramic membrane and then separated by ultrafiltration membrane, TPs, CAF, SPS, catechin components have no separation and enrichment effect. Ultra- filtration membranes with molecular weight less than 10 kDa can effectively separate and enrich free amino acids. The 500 nm ceramic membrane interception solution had the highest SPS content, but the worst sensory quality and the lowest antioxidant activity. Therefore, considering the three factors of quality, efficiency and energy saving, the comprehensive quality of tea powder prepared by 500 nm ceramic membrane through liquid is the best.

Southern Fujian; Oolong; Water extract; Membrane separation; Antioxidant activity

10.11926/jtsb.4514

2021-09-02

2021-11-18

福建省自然科學基金項目(2020J011367)；福建省屬公益類科研院所專項(2019R1029-3, 2022R1029006)；福建省農業科學院科技創新團隊項目(CXTD2021004-2)資助

This work was supported by the Project for Natural Science in Fujian (Grant No. 2020J011367), the Special Project for Public Welfare Research Institutes in Fujian (Grant No. 2019R1029-3, 2022R1029006), and the Project for Science and Technology Innovation Team of Fujian Academy of Agricultural Sciences (Grant No. CXTD2021004-2).

林清霞(1989生)，女，助理研究員，從事茶葉精深加工。E-mail: 735801309@qq.com

. E-mail: chenlin_xy@163.com